Yöntem makalesi

Epstein-Barr Virüsünün P3HR1 Hücre Hattından İzolasyonu ve Nicelleştirilmesi

DOI:

10.3791/64279

⸱

28 Eylül 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Epstein-Barr virüs parçacıklarının, forbol 12-miristat 13-asetat ile viral litik döngüyü indükledikten sonra insan P3HR1 hücre hattından izole edilmesine izin verir. DNA daha sonra viral preparattan çıkarılır ve viral parçacık konsantrasyonunu ölçmek için gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutulur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resmi olarak İnsan herpes virüsü 4 (HHV-4) olarak adlandırılan Epstein-Barr virüsü (EBV), ilk izole insan tümör virüsüdür . Dünyadaki yetişkin nüfusun yaklaşık% 90-95'i EBV tarafından enfekte edilmiştir. Moleküler biyoloji ve immünolojideki son gelişmelerle birlikte, hem in vitro hem de in vivo deneysel modellerin uygulanması, birçok hastalıkta EBV'nin patogenezi ve EBV ile ilişkili tümörigenez hakkında derin ve anlamlı bir bakış açısı sağlamıştır. Bu görselleştirilmiş deney çalışmasının amacı, EBV viral parçacıklarının P3HR1 hücre hattının hücrelerinden izolasyonuna genel bir bakış sağlamak ve ardından viral preparatın nicelleştirilmesidir. Aslen bir insan Burkitt lenfomasından izole edilen P3HR1 hücreleri, tip 2 EBV suşu olan bir P3HR1 virüsü üretebilir. EBV litik döngüsü, bu P3HR1 hücrelerinde forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ile tedavi edilerek indüklenebilir ve EBV viral parçacıkları elde edilebilir.

EBV parçacıklarının izolasyonu için bu protokolü kullanarak, P3HR1 hücreleri 37 ° C'de 5 gün ve% 5 CO2 35 ng / mL PMA içeren tam RPMI-1640 ortamında kültürlenir. Daha sonra, kültür ortamı, hücreleri peletlemek için 8 dakika boyunca 120 x g hızında santrifüj edilir. Virüs içeren süpernatant daha sonra toplanır ve EBV parçacıklarını peletlemek için 90 dakika boyunca 16.000 x g hızında döndürülür. Viral pelet daha sonra tam bir RPMI-1640 ortamında yeniden askıya alınır. Bunu, preparattaki EBV parçacıklarının konsantrasyonunu değerlendirmek için DNA ekstraksiyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR izler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epstein-Barr virüsü (EBV), izole edilen ilk insan tümör virüsüdür1. Resmi olarak İnsan herpes virüsü 4 (HHV-4)2 olarak adlandırılan EBV, herpes virüsü ailesinin gama herpes virüsü alt ailesinin bir parçasıdır ve Lenfokriptovirüs cinsinin prototipidir. Dünyadaki yetişkin nüfusun yaklaşık% 90-95'i virüs tarafından enfekteedilmiştir 3. Çoğu durumda, ilk enfeksiyon yaşamın ilk 3 yılında ortaya çıkar ve asemptomatiktir, ancak enfeksiyon ergenlik döneminde daha sonra ortaya çıkarsa, bulaşıcı mononükleoz4 olarak adlandırılan bir hastalığa yol açabilir. EBV, istirahat eden B hücrelerini enfekte edebilir ve onları virüsün latent olarak enfekte olmuş bir durum oluşturduğu ve koruduğu proliferatif B lenfoblastları haline getirebilir5. EBV herhangi bir zamanda yeniden aktive olabilir ve böylece tekrarlayan enfeksiyonlara yol açabilir6.

Son 50 yılda, bazı virüsler ile insan malignitelerinin gelişimi arasındaki ilişki giderek daha belirgin hale gelmiştir ve bugün tüm insan kanserlerinin% 15 ila% 20'sinin viral enfeksiyonlarla ilişkili olduğu tahmin edilmektedir7. EBV de dahil olmak üzere herpes virüsleri, bu tip tümör virüslerinin en iyi çalışılan örneklerinden bazılarıdır8. Aslında, EBV, Burkitt lenfoma (BL), Hodgkin lenfoma (HL), diffüz büyük B hücreli lenfoma ve immün sistemi baskılanmış konakçılarda lenfoproliferatif hastalıklar gibi birçok insan malignitesine neden olabilir 9,10. EBV'nin sistemik otoimmün hastalıkların gelişimi ile ilişkili olduğu da gösterilmiştir. Bu otoimmün hastalıkların bazı örnekleri romatoid artrit (RA), polimiyozit-dermatomiyozit (PM-DM), sistemik lupus eritematozus (SLE), karışık bağ dokusu hastalığı (MCTD) ve Sjögren sendromudur (SS)11. EBV ayrıca inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gelişimi ile ilişkilidir12.

Bu hastalıkların çoğu, hücre kültürü, fareler veya EBV ile enfekte olmuş diğer organizmalar kullanılarak incelenebilir veya modellenebilir. Bu nedenle, in vitro veya in vivo modeller13,14,15,16 olsun, hücreleri veya organizmaları enfekte etmek için EBV parçacıklarına ihtiyaç vardır, bu nedenle viral parçacıkların düşük maliyetle izole edilmesini sağlayan bir teknik geliştirme ihtiyacı vardır. Burada açıklanan protokol, EBV parçacıklarını nispeten erişilebilir bir hücre hattından güvenilir bir şekilde izole etmenin ve uygun maliyetli ve çoğu laboratuvar için kolayca bulunabilen gerçek zamanlı PCR kullanarak parçacıkları ölçmenin kolay bir yolu için kılavuzlar sağlar. Bu, EBV'yi farklı hücre hatlarından izole etmek için tarif edilen diğer birkaç yöntemle karşılaştırıldığında17,18,19,20.

P3HR-1, süspansiyonda büyüyen ve bir EBV tip 2 suşu ile gizli olarak enfekte olan bir BL hücre hattıdır. Bu hücre hattı bir EBV üreticisidir ve viral parçacıklar üretmek için indüklenebilir. Bu makalenin amacı, EBV parçacıklarının P3HR-1 hücre hattından izole edilmesine izin veren bir yöntemi sergilemek ve ardından daha sonra hem in vitro hem de in vivo EBV deneysel modelleri için kullanılabilecek viral stokun nicelleştirilmesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: EBV potansiyel olarak biyotehlikeli bir malzeme olarak kabul edilmeli ve bu nedenle Biyogüvenlik Seviye 2 veya daha yüksek bir muhafaza altında kullanılmalıdır. Eldivenlerin yanı sıra laboratuvar önlüğü de giyilmelidir. Sıçramalara maruz kalma potansiyeli varsa, göz koruması da dikkate alınmalıdır. Aşağıdaki prosedür bir Biyolojik Güvenlik Dolabında yapılmalıdır.

1. P3HR1 hücrelerini sayma

  1. Santrifüj ve resüspane edici hücreler

    3. figure-protocol-1

figure-protocol-2






  2. figure-protocol-3figure-protocol-4



  3. figure-protocol-5

    1. figure-protocol-6

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedürün amacı, EBV parçacıklarını, daha sonra EBV enfeksiyonunu modellemek için kullanılabilecek bilinen viral titreye sahip bir süspansiyonda izole etmektir. Bu nedenle, prosedürden en yüksek EBV verimini elde etmek için farklı reaktiflerin optimal konsantrasyonlarının kullanılması son derece önemlidir.

En yüksek sayıda EBV partikülü verecek PMA ve DMSO konsantrasyonlarını belirlemek için bir optimizasyon denemesi yapılmıştır (Şekil 2). % 0.8'lik bir DMSO k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EBV parçacıklarının üretimi, bu virüsün biyolojisini ve ilişkili hastalıklarını anlamak için gereklidir. Burada bu parçacıkların üretimini P3HR-1 hücre hattından tanımladık. Bu hücre hattı tek EBV üretici hattı değildir; Aslında, EBV parçacıkları ayrıca B95-8 hücreleri21,22 ve Raji hücre hattı18,19'dan izole edilmiştir. EBV litik döngüsü bu hücrelerde n-bütirat ile indüklenmiştir. Alternatif olarak, forb...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın finansmanı, Asmar Araştırma Fonu, Lübnan Ulusal Bilimsel Araştırma Konseyi (L-CNRS) ve Beyrut Amerikan Üniversitesi'ndeki Tıbbi Uygulama Planı'ndan (MPP) ER'ye yapılan hibelerle desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 mL ince duvarlı PCR tüpleriThermo ScientificAB0620Kullanmadan önce otoklavlanmalıdır
0.2-10 & L Mikro Hacimli Filtre UçlarıCorning4807önce otoklavlanmalıdır
; L PipetBrandTech704770
10 mL Tek Kullanımlık Serolojik PipetCorning4488
1000 & mikro; L Filtreli Pipet UçlarıQSPTF-112-1000-Q
100-1000 & mikro; L PipetEppendorf3123000063
100x20 mm Küpe PlakalarıSarstedt83.1802
10-100 & mikro; L PipetBrandTech704774
15 mL Konik TüplerCorning430791
200 & L Filtreli Pipet UçlarıQSPTF-108-200-Q
20-200 & mikro; L PipetEppendorf3123000055
50 mL Konik TüplerCorning430828
CFX96 Gerçek Zamanlı C-1000 Termal DöngüleyiciBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
DNase/RNase İçermeyen SuZymo ResearchW1001-1
EBER PrimerlerMacrogenN/AÖzel Yapım Primerler
EBV DNA Kontrolü (Standartlar)VircellMBC065
Etanol (Laboratuvar Reaktif Sınıfı)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Fetal Sığır SerumuSigmaF9665
Fresco 21 MicroSantrifüjThermo Scientific10651805
Glikojen ÇözeltisiQiagen158930
HemositometreBOECOBOE 01
Ters Işık MikroskobuZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Mikrosantrifüj TüpüCostar (Corning)3621Kullanmadan önce otoklavlanmalıdır
P3HR-1 Hücre HattıATCCHTB-62
Penisilin-Streptomisin Çözüm: BiowestL0022
FenolVWR20599.297
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)Sigma-AldrichP8139
Pipet DolguThermo Scientific9501
Hassas MendilKimtech7552
RPMI-1640 Kültür OrtamıSigmaR7388
SL 16R SantrifüjThermo Scientific75004030
Sodyum AsetatRiedel-de Haë n (Honeywell)25022
SpektrofotomerDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Tripan Mavi ÇözeltiSigmaT8154
Su Ceketli CO2 İnkübatörThermo Scientific4121
0.5-10 & kullanmadan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18(2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265(2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380(2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683(2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944(2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324(2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Epstein Barr VirusP3HR1 Cell LineVirus IsolationVirus QuantificationViral DNA ExtractionReal Time PCREBV Genome CopyCell CulturePMA InductionHemocytometer Counting

İlgili makaleler