Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici
Bu makalede
Özet
Özet
Bu makalede, katı hal, O2'ye duyarlı kaplamalardan çözünür O2'ye duyarlı problarla boyanmış canlı hayvan dokusu örneklerine kadar farklı fosforesan numunelerdeki moleküler oksijen (O2) konsantrasyonunu haritalamak için tasarlanmış yeni bir fotolüminesans ömür boyu görüntüleyici sunulmaktadır. Özellikle, 625 nm ışık yayan diyot (LED) ile uyarılabilen ve 760 nm'de yayılan nanopartikül tabanlı yakın kızılötesi prob NanO2-IR kullanıldı. Görüntüleme sistemi, Timepix3 kameraya (Tpx3Cam) ve aynı zamanda bir görüntü yoğunlaştırıcı barındıran opto-mekanik adaptöre dayanmaktadır. O2 fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) çeşitli çalışmalar için yaygın olarak gereklidir, ancak mevcut platformların doğrulukları, genel esneklikleri ve kullanılabilirlikleri konusunda sınırlamaları vardır.
Burada sunulan sistem, entegre bir optik sensör ve okuma çipi modülü olan Tpx3Cam üzerine inşa edilmiş hızlı ve son derece hassas bir görüntüleyicidir. Yüzey lekeli bağırsak dokusu örneklerinden veya kalın bağırsağın intraluminal olarak boyanmış parçalarından yüksek yoğunluklu fosforesans sinyalleri ve stabil ömür değerleri ürettiği gösterilmiştir ve dokuO2 seviyelerinin yaklaşık 20 s veya daha kısa sürede ayrıntılı haritalanmasını sağlar. Bilinçsiz hayvanlarda aşılanmış tümörlerde hipoksi görüntülemeye yönelik ilk deneyler de sunulmuştur. Ayrıca, görüntüleyicinin, uyarma için 390 nm LED ve emisyon için 650 nm bandpass filtre kullanılarak Pt-porfirin boyalarınadayanan O2'ye duyarlı malzemelerle kullanım için nasıl yeniden yapılandırılabileceğini de açıklıyoruz. Genel olarak, PLIM görüntüleyicinin, kullanılan problar veO2 konsantrasyonunun ilgili iki boyutlu haritaları için yaşam boyu değerlerin doğru nicel ölçümlerini ürettiği bulunmuştur. Ayrıca ex vivo doku modellerinin ve canlı hayvanların metabolik görüntülemesi için de yararlıdır.
Giriş
O2, canlı sistemler için anahtar çevresel parametrelerden biridir veO2'nin dağılımı ve dinamikleri hakkında bilgi sahibi olmak birçok biyolojik çalışma için önemlidir 1,2,3. Doku oksijenasyonununfosforlu problar 4,5,6,7,8 ve PLIM 9,10,11,12,13 ile değerlendirilmesi biyolojik ve tıbbi araştırmalarda popülerlik kazanmaktadır 3,9,14,15,16
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (2010/63/EU) uyarınca Sağlık Ürünleri Düzenleme Kurumu (HPRA, İrlanda) tarafından verilen izinler altında gerçekleştirilmiş ve University College Cork Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Numune hazırlama
- Canlı doku örneklerinin ex vivo probu ile boyanması
- Ex vivo uygulamalar için, 4 haftalık dişi Balb / c farelerinden taze izole edilmiş doku örnekleri kullanın.
- Deney gününde, bir fareyi kafa keserek ötenazi yapın ve yaklaşık 10 mm büyüklüğündeki kolon parçalarını (kalın bağırsak) hı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ex vivo görüntüleme uygulamaları için, dokunun serozal tarafına NanO2-IR probunun topikal uygulaması ile bağırsak dokusunun parçaları boyandı. Daha derin boyama için, probun 1 μL'si lümene enjekte edildi. İkinci durumda, 0.2-0.25 mm kalınlığındaki bağırsak duvarı, probu kameradan korudu. İki boyama işlemi Şekil 2A'da gösterilmiştir.
Elde edilen yoğunluk ve PLIM görüntüleri Şekil 2B-G'de sunul.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıdaki protokoller, yeni görüntüleyicinin montajının ve mikrosaniye FLIM/PLIM modunda çalışmasının ayrıntılı bir açıklamasını verir. TCSPC tabanlı yeni nesil Tpx3Cam kamera, görüntü yoğunlaştırıcı, emisyon filtresi ve makro lens ile opto-mekanik adaptör Cricket ile birleştiğinde, kullanımı kolay, kararlı, kompakt ve esnek bir optik modül üretir. Görüntüleyicinin, fosforlu malzemelerin karakterizasyonu ve canlı dokuO2 görüntülemeyi içeren bir dizi farklı numune ve analitik görevle iyi performans gösterdiği .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
İrlanda Bilim Vakfı'ndan bu çalışma için mali destek, SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 ve 18 / SP / 3522 ve Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) için minnetle kabul edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 627 nm LED | Parçaları Ekspres | : Sensörün uyarma dalga boyuna bağlı olarak farklı LED ile değiştirilebilir. Pt-porfirin boyaları için 390 nm LED kullanılmıştır. | |
| 760 ± 50 nm emisyon filtresi | Edmund Optics | 84-788 | Sensörün emisyon dalga boyuna bağlı olarak farklı bir filtre ile değiştirilebilir. Kullanılmış 650 ± Pt-porfirin boyaları için 50 nm bant geçiren filtre. |
| Balb / c fareleri | Envigo, İngiltere | Balb / c | |
| Kara kutu | Thorlabs | XE25C9 / M Kriket | |
| Adaptörü | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 hücreleri ve nbsp; | ATCC | CT26. WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Diğer ortamlar da kullanılabilir |
| ImageJ Yazılımı ImageJ | Ücretsiz Görüntü analiz yazılımı. Şuradan indirilebilir: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | ||
| P47 fosfor ekranlı MCP-125 görüntü yoğunlaştırıcı | Photonis | PP0360EF | |
| Mini | tabaklar Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm çap |
| Mylar plastik film, 75 mikron | RS İrlanda | 785-0795 | Diğer plastik yüzeyler de kullanılabilir |
| NanO2-IR | ev yapımı | n/a | Prob, yayınlanmış 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB' yöntemine göre sentezlenebilir. Fosforlu oksijene duyarlı bir prob kullanılarak beyin metabolizması aktivitesinin in vivo görüntülenmesi. J Neurosci Yöntemleri. 2013 Haziran 15; 216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 Nisan. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' veya laboratuvarımız tarafından sağlanır. |
| NMV-50M11" 50 mm lens | Navitar | C-mount adators ile uyumlu diğer lensler kullanılabilir | |
| Optik devre tahtası | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Kapları | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm çaplı |
| Güç Kaynağı | Tenma | 72-10495 | |
| Darbe Jeneratörü | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | ASI tarafından Tpx3Cam Tpx3Cam ile birlikte sağlanmıştır |
| Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | ||
| Tri2 Yazılımı | Oxford Üniversitesi | n/a | Free Time Resolved Imaging yazılımı şu adresten indirilebilir: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Çeviri Aşaması | Thorlabs | LT3 |
Kaynaklar
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
