Yöntem makalesi

Alerjik Kontakt Dermatitin Murin Modeli Olarak Kontakt Aşırı Duyarlılık

3.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64329

⸱

26 Eylül 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), alerjik kontakt dermatitin (AKB) murin deneysel bir modelidir. CHS, göğüs ve karın bölgesinin traş edilmiş cildini boyayarak reaktif hapten ile hassaslaşmaya dayanır, daha sonra seyreltilmiş bir hapten ile kulak derisi meydan okuması ile çeşitli şekillerde değerlendirilen bir şişlik reaksiyonuna neden olur.

Özet

Kontakt aşırı duyarlılık (CHS), farelerde incelenebilen deneysel bir alerjik kontakt dermatit (ACD) modelidir. Bu çalışma, farelerde CHS reaksiyonunu incelemeye yardımcı olabilecek, çeşitli testlerle ölçülebilen ve ölçülebilen objektif bir laboratuvar yöntemi sunmayı amaçlamaktadır. CHS'yi indüklemek için, "0" gününde, fareler bir aseton-etanol karışımında hapten 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB) ile abdominal cilt boyaması ile daha önce traş edilmiş bir noktaya duyarlılaştırılırken, negatif kontrol fareleri tek başına araç-aseton-etanol karışımı ile düzmece duyarlılaştırıldı. "4" gününde, temel kulak kalınlığı, CHS'nin (meydan okuma) ortaya çıkmasından önce, her iki kulağın hem test hem de kontrol gruplarında seyreltilmiş TNCB ile boyanmasıyla bir mikrometre ile ölçüldü. 24 saat sonra, kulak şişmesi bir mikrometre ile ölçüldü. CHS, iltihaplı dokuda şişmeye neden olan ve aynı hapten ile cilt mücadelesinden 24 saat sonra zirveye ulaşan T hücresi aracılı bir bağışıklık tepkisinin bir örneğidir. Kulak ödeminde artış, artmış kulak ağırlığı, miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, kulak ekstrelerinde pro-inflamatuar sitokin konsantrasyonu, histolojik incelemede ödemli dermisin kalınlaşmasının artması ve kulak vasküler geçirgenliği ile korelasyon gösterdi. Test grubunun serumlarında TNP-spesifik IgG1 antikorlarının konsantrasyonunda, kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında bir artış vardı. Ek olarak, CHS, daha önce TNCB ile duyarlılaştırılmış donörlerden elde edilen CHS-efektör hücrelerle başarılı bir şekilde aktarılabilir. CHS-efektör hücreler, daha sonra aynı seyreltilmiş hapten ile zorlanan naif alıcı farelere intravenöz olarak uygulandı. Kulak şişmesi 24 saat sonra mikrometre ile ölçüldü.

Giriş

Alerjik kontakt dermatit (AKB), sanayileşmiş ülkelerde, hapten adı verilen düşük moleküler ağırlıklı kimyasallara maruz kalmaktan kaynaklanan tip IV aşırı duyarlılık reaksiyonunun neden olduğu yaygın bir deri enflamatuar hastalığıdır. İnsanlarda temas duyarlılaşmasına neden olan maddeler arasında ağır metal iyonları (krom, nikel, demir, kobalt), terebentin, kokular, boyalar ve kozmetiklerde bulunan koruyucular (örneğin, p-fenilendiamin), bazı ilaçlar (örneğin, neomisin, benzokain), β-laktam antibiyotikler (yani penisilin), bitkiler tarafından üretilen kimyasallar (pentadekakatekol, zehirli sarmaşıklarda bulunan bir madde) ve fotoğraf endüstrisinde kullanılan hidrokinonbulunur 1,2 . ACD etiyolojik ajanları çok yüksektir, çünkü sadece endüstride 100.000'den fazla kimyasal kullanılmaktadır ve her yıl 2.000 yenisi sentezlenmektedir. Bugüne kadar, temas haptenleri / alerjenleri olabilecek 3.700'den fazla molekül tanımlanmıştır3. Temas aşırı duyarlılık reaksiyonu (CHS), farelerde, kobaylarda ve sıçanlarda çalışılabilen deneysel bir ACD modelidir ve organik çözücülerde çözünmüş reaktif kimyasal haptenlerin topikal cilt uygulaması ile indüklenebilir 4,5,6. Bu çalışma, farelerde CHS reaksiyonunu incelemeye yardımcı olabilecek ve çeşitli testlerle ölçülebilen ve ölçülebilen objektif bir laboratuvar yöntemini tanımlamayı amaçlamaktadır.

CHS, sensitizasyon (indüksiyon) ve efektör (meydan okuma) aşamalarından oluşur. Hayvan modellerinde, haptenler ilk önce neoantijenler oluşturmak için vücuttaki proteinlere kovalent olarak bağlanır. Sensitizasyon aşamasında, aktive keratinositler, pro-inflamatuar sitokinler-tümör nekroz faktör α (TNF-α) ve interlökin 1β (IL-1β)7 üreterek deri dendritik hücrelerinin (sDC'ler) göçünü ve olgunlaşmasını teşvik eder. Epidermal Langerhans hücreleri (LC'ler) CHS indüksiyonu ve efektör fazları8 sırasında antijenler sunar. Duyarlılaşma sırasında hapten'e maruz kalan LC'ler hem düzenleyici hem de efektör hücrelerin indüksiyonunu teşvik eder9. Birkaç çalışmadan elde edilen kanıtların artması, CHS yanıtlarının CD4 + MHC sınıf II ile kısıtlanmış Th1 hücreleri tarafından aracılık edilebildiğini, karakteristik bir enflamatuar infiltrasyon kullanmak için lokal olarak interferon-γ (IFN-γ), IFN-γ serbest bırakabilen, ancak çoğunlukla keratinositlere sitotoksik hasara aracılık edebilen CD8 + MHC sınıf I-kısıtlı Tc1 lenfositleri ve şimdi de interlökin 17 (IL-17) üreten Th17 hücreleri10, 11.

Çeşitli türler 12,13,14 ve haptenleri kullanan birkaç farklı CHS modeli geliştirilmiştir (farklı haptenlerin, çözücülerin ve uygulama zamanlarının ayrıntılı bir karşılaştırması Tablo 1'de özetlenmiştir). Sık kullanılan bir laboratuvar türü olan fare, CHS'yi incelemede birkaç avantaj sunar. Fareler arasında diğer türlere kıyasla daha fazla suş, nakavt (KO) ve transgenik hayvan vardır, bu da onları çok çekici bir hayvan yapar15. Ek olarak, CHS modeli birçok hayvan gerektirir ve fareler burada daha ekonomiktir. Hayvan modelleri ACD'yi her açıdan taklit etmez; özellikle, insanlar için yaygın olmayan kabuklanma ve deskuamasyon gösterirler16,17. Kronik hastalığın özelliklerinin çoğaltılması zordur, çünkü tarif edilen model haptenin uzun süre uygulanmasını üstlenmez. Bununla birlikte, burada ACD'nin önemli yönlerinin çoğunun çoğaltıldığı doğrulanmıştır. İnsanlarda olduğu gibi, bu özelliklerin lokal alerjik reaksiyonlarla ilişkili olduğu da gösterilmiştir. Bu protokolde özetlenen hapten seçimi, çözücüsü ve uygulaması, sonuçların çok sayıda in vitro testle doğrulanması ve mevcut versiyon kurulana kadar uzun yıllar laboratuvarda test edilmesi ve modifiye edilmesi gerçeğiyle belirlendi. Murin modelleri, ACD'nin gelişiminde rol oynayan ve yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirmeleri için gerekli olan hücre alt kümelerinin veya sitokinlerin analizine izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu makalede sunulan tüm deneyler, Krakow'daki 1. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi'nin yönergelerine göre yürütülmüştür. Açıklanan tüm prosedürler, özellikle ketamin / ksilazinin anestezik olarak kullanılması, madde / hapten uygulamak için kulakların her iki tarafının kullanılması, kulağın kesilmesi ve göz küresinin çıkarılmasıyla kan toplanması ile ilgili olarak yerel önerilere göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada 6-12 haftalık BALB/c (haplotip H-2d), CBA/J (H-2k) ve C57BL/6 (H-2b) erkek ve dişi fareler kullanılmıştır (bkz. İstatistiksel anlamlılık için, her fare grubunun 10-12 hayvandan oluşması en iyisidir.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Tüm işlemlerden önce ve sonra ameliyat masasını% 70 etanol çözeltisi ile temizleyin. Steril koşullar gerektiren fareler kullanıyorsanız, tüm işlemleri bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

2. Tanımlama için fareleri işaretleme

  1. Cildi bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek fareleri etiketleyin: #0 - işaretsiz, #2 - sağ ön pençede, #3 - sağ tarafta, #4 - sağ arka pençede, #5 - kuyruğun tabanında, #6 - sol arka pençede, #7 - sol tarafta, #8 - sol ön pençede.
    NOT: İndüklenen reaksiyon nedeniyle, fareler klasik olarak kulak delme veya etiketleme ile işaretlenemez. Fareler etiketlenirken anestezi yapılmadı.

3. CHS'nin İndüksiyonu

NOT: Bu yordam Şekil 1'de gösterilmiştir.

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek hassaslaştırmayı (indüksiyon) gerçekleştirin.
    1. "0" gününde, su ile gri sabun uygulayarak ve bir tıraş bıçağı ile tıraş ederek göğüs ve karın bölgesinde (kare 2 cm x 2 cm) fareleri tıraş edin.
      NOT: Hapten uygulamadan önce, cildin tahriş olmaması için 6 saat bekleyin.
    2. % 5 hapten hazırlayın: 2,4,6-trinitroklorobenzen (TNCB, bakınız Malzeme Tablosu) bir aseton-etanol karışımında (oran 1: 3) veya tek başına araç (aseton-etanol). Bir cam şişede kullanmadan hemen önce çözeltiler hazırlayın ve şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    3. Aynı gün, daha önce tıraş edilen noktaya 150 μL% 5 hapten uygulayarak fareleri hassaslaştırın. Kontrol fareleri grubunda, spesifik olmayan enflamatuar reaksiyonu değerlendirmek için aracı tek başına uygulayın. Hayvanı tekrar kafese koymadan önce, haptenin kurumasına izin vererek 30 s bekleyin.
      DİKKAT: Eldiven kullanın; TNCB çoğu insanda ciddi bir alerjik reaksiyona neden olur.
  2. Uyarılma (meydan okuma) ve kulak şişmesi ölçümü yapın.
    1. "4" gününde,% 0.4 hapten hazırlayın: Bir aseton-etanol karışımında TNCB (oran 1: 1). Çözeltiyi bir cam şişede kullanmadan hemen önce hazırlayın ve şişeyi alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
    2. Derin anestezi için fareleri ketamin (90-120 mg / kg) ve ksilazin (5-10 mg / kg) karışımının intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Farenin ayak parmağını kıstırarak en az 5 dakika boyunca tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
    3. Kulak kalınlığını (0 saatlik ölçüm, taban çizgisi) deney gruplarından habersiz bir gözlemci tarafından bir mikrometre ile (bakınız Malzeme Tablosu) ölçün.
    4. Her iki grupta da kulakların her iki tarafına 10 μL% 0.4 hapten uygulayın (test ve kontrol). Hayvanı tekrar kafese koymadan önce, 30 s bekleyin ve haptenin kurumasına izin verin.
    5. "5" gününde, hapten uygulamasından 24 saat sonra, 24 saatlik ölçüm için 3.2.2-3.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    6. CHS yanıtını, hapten ile mücadeleden önce ve sonra kulak kepçesi kalınlığındaki farkı hesaplayarak değerlendirin: 24 saat kulak kalınlığı (μm) - 0 saat kulak kalınlığı (μm). Her kulağı ayrı bir ölçüm olarak sayın. Daha sonra, ortalamanın (SEM) standart hatası ± mikrometre (μm) cinsinden kulak şişmesini ifade edin (Tablo 2, Şekil 3).

4. Kulak biyopsileri

  1. Kulak kalınlığının 24 saatlik ölçümünden hemen sonra (fare hala derin anestezi altındayken), kulakları kafatasına mümkün olduğunca yakın makasla kesin. Biyopsi punch kullanarak 6 mm çapında bir punch yaparak kulakların distal tarafından biyopsileri toplayın (bkz.
    1. Kulak ağırlığını ölçün (adım 4.2) ve ayrıca aynı kulak biyopsisinde aşağıdaki testlerden birini yapın: miyeloperoksidaz (MPO) testi (adım 4.3) veya kulak ekstrelerindeki sitokin konsantrasyonunun in vitro ölçümü (örneğin, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [adım 4.4]).
      NOT: Kan toplanmadan önce kulakları kesin. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. Her bir kulak biyopsisinin ağırlığını analitik terazide ölçün ve miligram (mg) cinsinden ifade edin (Şekil 4).
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek bir MPO testi gerçekleştirin.
    1. 50 mmol fosforat tamponu KH 2 PO4/Na2HPO4 içinde %0,5 hekzadediltrimetilamonyum bromür çözerek ve pH'ı 6,0'a ayarlayarak homojenizasyon tamponunu hazırlayın (oda sıcaklığında kullanın, RT).
    2. 5 mm çapında paslanmaz çelik boncuklu bir homojenizatör kullanarak 500 μL hazırlanmış tamponlu 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde biyopsileri 10 dakika boyunca homojenize edin (iki boncuk/şişe ekleyin) (bkz. Ardından, numuneyi 4 ° C'de 15 dakika soğutun ve 10 dakika daha homojenleştirin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpleri, boncukların kolayca hareket edebilmesi için yuvarlak bir tabana sahiptir.
    3. Homojenatları −20 °C'de 30 dakika boyunca dondurun. Çözülme ve vorteks (numunelerin çözüldüğünden emin olun). Bu prosedürü 3 kat tekrarlayın.
    4. Homojenatları 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantları bir pipetle hasat edin. MPO aktivitesini 1 mg protein başına birim (U) cinsinden ifade edin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numuneler 3 ay boyunca -20 ° C'de stabildir.
    5. MPO aktivitesini ölçmek için, 20 μL süpernatant ve 200 μL MPO substratını (50 mmol KH 2 PO 4 / Na2HPO4 tamponunda 0.167 mg / mL orto-dianisin dihidroklorür içinde 5 x 10−4% H 2 0 2) karıştırarak enzimatik bir reaksiyon gerçekleştirin ve 96 delikli düz tabanlı plakalara ekleyin. RT'de plakaları 20 dakika boyunca inkübe edin.
    6. MPO substratının 200 μL'sinde 0,008 U'dan 0,5 U'ya kadar konsantrasyonlarda MPO standardının 20 μL'sini kullanarak standart eğriyi hazırlayın. Boş numuneyi yalnızca MPO substratı ile hazırlayın.
      DİKKAT: Orto-dianisin dihidroklorür ile çalışırken bir maske kullanın.
      NOT: Plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlanma kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.
    7. Optik yoğunluğu (OD) λ = 460 nm dalga boyunda ölçün. Enzimatik reaksiyon 10 dakika boyunca kararlıdır. Standart eğriden test edilen numunelerdeki MPO aktivitesini okuyun.
    8. Protein konsantrasyonunu ölçmek için, süpernatanın 20 μL'sini kullanın, protein tayini için bir Bicinchoninic asit kiti ile bir test yapın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve OD'yi λ = 562 nm'de ölçün (Şekil 5).
  4. Kulak ekstraktındaki sitokinlerin in vitro ölçümünü gerçekleştirin.
    1. RT'deki kulak biyopsilerini, 5 mm çapında paslanmaz çelik boncuklu bir homojenizatör kullanarak 500 μL doku protein ekstraksiyon reaktifi (T-PER) içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde 10 dakika boyunca homojenize edin (iki boncuk/flakon ekleyin). Ardından, numuneyi 4 ° C'de 15 dakika soğutun ve 10 dakika daha homojenleştirin.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpleri, boncukların kolayca hareket edebilmesi için yuvarlak bir tabana sahiptir.
    2. Homojenatları 3.000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numuneler 6 ay boyunca -80 ° C'de stabildir.
    3. Sitokin seviyelerini, üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir ELISA seti (örneğin, IFN-γ) kullanarak değerlendirin (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 6).

5. Kulak dokusunun histolojisi

  1. Kulak kalınlığının 24 saatlik ölçümünden hemen sonra, fare hala derin anestezi altındayken, kulakları makasla kafatasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde kesin (adım 4.1).
    NOT: Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek doku bloklarının parafin gömmesini gerçekleştirin.
    1. Çıkarıldıktan hemen sonra, kulağı 24 saat boyunca ~ 10 mL% 10 formalin içine yerleştirin.
    2. Kulakları bir doku işleme kasetine yerleştirin. Kasetleri, dehidrasyon döngüleri (RT'de her biri %70, %90, %100, 30 dakika alkol), temizleme döngüleri (RT'de her biri 30 dakika ksilen 3x, 30 dakika) ve balmumu infiltrasyon döngüleri (56 ° C'de her biri 3x, 30 dakika olmak üzere parafin 3x) için otomatik bir işlemciye ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
    3. Kasetleri otomatik işlemciden çıkarın ve gerekli olana kadar ısıtma plakasına tutun. Balmumu kalıbını ılık balmumu ile doldurun (dağıtıcıdan).
    4. Bölümleri ısıtılmış forseps ile kasetten çıkarın ve kalıba yerleştirin; Daha sonra, kaset tabanını kalıbın üstüne yerleştirin ve ardından daha fazla balmumu ile doldurun. 30 dakika boyunca soğuk bir tabak üzerinde soğutulmuş suya koyun, böylece parafin numuneyi içeren bir blok oluşturmak için katılaşır.
    5. ~5 μm kalınlığındaki bölümleri kesmek için döner bir mikrotom kullanın (bkz. Bölümleri düzleştirmek için ılık bir banyoda yüzdürün. Bölümleri bir cam mikroskop slaytına alın. Bölümlerin slayda yapışmasını sağlamak için RT'de kurumasını bekleyin.
      NOT: Boyama sırasında doku kesitlerinin kaybını önlemek için yapışkan malzemeler veya protein kaplamalar uygulama ihtiyacını ortadan kaldıran slaytlar kullanın.
  3. Hematoksilin ve eozin (H & E) boyama işlemini gerçekleştirin.
    1. Aşağıdakilerle 17 boyama kabı hazırlayın: ksilen (dört tabak),% 100 etanol (mutlak alkol) (dört tabak), % 90 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol,% 50 etanol, PBS (üç tabak), hematoksilin çözeltisi, eozin çözeltisi. Aşağıdaki adımlara göre slaytları bir çanaktan diğerine aktarın ve hepsini RT'de gerçekleştirin.
      NOT: Her bir çanaktaki prosedür yaklaşık 10x tekrarlanabilir (örneğin, 20 slaytlı bir tabak kullanılıyorsa, sıvıları değiştirmeden 200 leke yapılabilir).
    2. İnkübatörde 30 dakika boyunca 65 ° C'de inkübasyon yaparak bölümleri deparaffinize edin. Slaytları 30 dakika boyunca ksilene batırın. Yeni ksilende 30 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    3. Slaytları 5 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın. Yeni% 100 etanolde 5 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın. Slaytları her seyreltmede 2 dakika boyunca etanol sırasına,% 90,% 80,% 70 ve% 50 batırın.
    4. Slaytları 5 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) içine batırın. Fazla sıvıyı dokunun etrafından ve slaytların arka tarafından silin.
    5. Hematoksilin çözeltisindeki bölümleri 7-8 dakika boyunca sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Bölümlere zarar vermemek için ters taraftan 30 s akan suda yıkayın. Adım 5.3.4'ü yineleyin.
    6. Bölümleri 30 sn boyunca eozin çözeltisi ile sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Adım 5.3.5'te belirtildiği gibi yıkayın ve ardından adım 5.3.4'ü tekrarlayın.
    7. Slaytları 2 dakika boyunca %100 etanol (mutlak alkol) içine batırın. Yeni% 100 etanolde 2 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    8. Slaytları 5 dakika boyunca ksilene batırın. Yeni ksilende 5 dakika boyunca 1x'i tekrarlayın.
    9. Bölümlerin RT'de 15 dakika boyunca kurumasını bekleyin. Bir kapak kapağına bir damla montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından bölümün üstüne yerleştirin.
  4. Bölümü ışık mikroskobu altında 20x veya 40x büyütme altında inceleyin ve görüntüler yakalayın (Şekil 7).

6. Vasküler geçirgenlik testi

NOT: Kulak kalınlığı ölçümüne alternatif olarak, vasküler geçirgenlik testi yapılabilir.

  1. Fareleri "0" gününde (adım 3.1.1-3.1.3) hassaslaştırın ve ardından "4" gününde, fareleri uyuşturun (adım 3.2.2) ve 0 saatlik kulak ölçümünü atlayarak doğrudan kulaklara hapten uygulayın (adım 3.2.4).
  2. Meydan okuma sonrası 23 saatte, fareleri anestezi altına alın (adım 3.2.2).
  3. İntravenöz olarak (i.v.) 8.3 μL/g vücut ağırlığında% 1 Evans mavi boyası enjekte edin (bakınız Malzeme Tablosu) Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salinine (DPBS) enjekte edin.
  4. Evans mavi enjeksiyonundan 1 saat sonra fareleri tekrar derin anestezi (adım 3.2.2) ile anestezi altına alın.
  5. Kulak biyopsilerini toplayın (adım 4.1).
    NOT: Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  6. Boyayı dokudan çıkarın, kulak yumruklarını 1 mL formamid içeren tüplere yerleştirin ve 18 saat boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Biyopsileri RT'de 3 dakika boyunca 3.000 x g'de santrifüj edin.
  8. OD'yi, 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalarda λ = 565 nm dalga boyunda, formamid içeren boş bir formamide karşı ölçün. Renk 24 saat boyunca kararlıdır. Test numunelerinin konsantrasyonunu standart eğriden okuyun (Evans mavisinin 0.2-30 μg boya / mL formamid arasında değişen konsantrasyonlarını kullanın) (Şekil 8).
    NOT: Plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlanma kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.

7. Serum toplama ve anti-TNP immünoglobulin (IgG1) antikor ölçümü

  1. Kulak biyopsilerini topladıktan sonra (adım 4.1), fare hala derin anestezi altındayken, göz küresini cımbızla çıkarın, fareye hafif bir baskı uygulayın ve retro-orbital sinüsten tüpe kan toplayın (serum elde etmek için jelli şişe , bkz. Kan toplamanın alternatif bir yöntemi, kalbi bir şırınga ile delmek ve kanı toplamak olabilir.
    NOT: Kulaklar çıkarıldıktan sonra kan toplanmalıdır. Kan parametrelerindeki potansiyel farklılıklar nedeniyle tüm çalışma boyunca aynı kanama yöntemi kullanılmalıdır18. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  2. En az 6x ters çevirin, kanın pıhtılaşması için 30 dakika bekleyin ve ardından RT'de 10 dakika boyunca 1.300-2.000 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Numune 6 ay boyunca -20 ° C'de stabildir.
  3. DPBS'de 10 μg / mL'lik bir konçersiyonda çözünmüş 2,4,6-trinitrofenil (TNP-BSA) ile konjuge edilmiş 50 μL sığır serum albümini içeren 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakayı kaplayın. Daha sonra, ikinci plakayı DPBS'de (arka plan) 10 μg / mL'lik bir konsantrasyonda çözünmüş sığır serum albümini (BSA) ile kaplayın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Fare serumu BSA'ya karşı antikorlar (Abs) içerir, bu nedenle numunelerin her iki plakada da test edilmesi gerekir ve daha sonra bir hesaplama yapılmalıdır (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Plakaları% 0.05 Ara 20 içeren 300 μL DPBS ile yıkayın. 3x tekrarlayın.
  5. Tahlil seyrelticisini hazırlayın (AD): %1 BSA içeren DPBS. Kuyucukları RT'de 1 saat boyunca AD ile bloke edin. tekrar yıkayın (adım 7.4).
  6. Dahili bir standart (iSTD) hazırlayın: fareleri TNCB ile hassaslaştırın (adım 3.1.1-3.1.3) ve duyarlılaştırmadan 10 gün sonra, serumu tüm donörlerden toplayın ve yoklayın (adım 7.1 ve adım 7.2).
  7. Standart eğriyi yapmak için plakaya 50 μL derecelendirilmiş iSTD konsantrasyonları ekleyin ( Tablo 3'te açıklanmıştır). Tabağa 50 μL serum örnekleri ekleyin. Her numuneyi ve standart eğriyi her iki plakada da test edin (TNP-BSA ve BSA kaplamalı). RT'de 2 saat boyunca inkübe edin. plakaları yıkayın (adım 7.4).
  8. AD ile 1:250 seyreltilmiş 50 μL biyotinile anti-fare IgG1 monoklonal antikoru (mAb, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin. tekrar yıkayın (adım 7.4).
  9. AD ile 1:2000 seyreltilmiş 50 μL yaban turpu peroksidaz strepttavidin (HRD streptavidin, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı yıkayın (adım 7.4).
  10. 50 μL TMB substratı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. 1M H2S04'ün 25 μL'sini ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun; reaksiyon 30 dakika boyunca kararlıdır.
  12. OD'yi λ = 450 nm dalga boyunda ve 570 nm arka planda ölçün (arka plan her 450 nm ölçümden çıkarılmalıdır). Sonuçları sunarken, numuneler için BSA ölçümlerini TNP-BSA'dan ve standart eğriden çıkarın. Ardından, standart eğriye göre antikorların birimini (U) hesaplayın (Şekil 9).

8. CHS-efektör hücrelerin evlat edinilmiş transferi

NOT: Bu yordam Şekil 2'de gösterilmiştir.

  1. Donörler (bir donör oranında: 1 alıcı): "0" gününde TNCB ile fareleri hassaslaştırın (adım 3.1.1-3.1.3).
  2. "4" gününde, farelerin derin anestezisini anestezi altına alın (adım 3.2.2).
  3. Forseps ile aksiller ve inguinal lenf nodlarını (ALN'ler) ve dalakları (SPL'ler) izole edin. ALN'leri bir şişede ve SPL'leri başka bir şişede bir araya getirin.
    NOT: Her aksillada pektoral kasının arkasında bir aksiller lenf nodu vardır. Kalça bölgesindeki bir inguinal lenf nodu üç kan damarının yanında bulunur. Dalak, vücudun sol tarafında bağırsak ve midenin arkasında bulunur19. Steril koşulları korumak için bir biyogüvenlik kabininde steril aletlerle çalışın. Bu işlemden sonra, fareler ötenazi yapılmalıdır (örneğin, servikal çıkık yoluyla).
  4. İki mikroskop slaytının buzlu uçları arasındaki dokuyu püre haline getirin. Hücre süspansiyonunu gözenek boyutu 70 μm olan bir hücre süzgecinden geçirin (bkz.
  5. Hücreleri% 1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DPBS ile yıkayın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatantı boşaltın ve kalan hücre peletini 1-5.0 mL DPBS içinde yeniden askıya alın.
  6. Trypan mavisi ile bir hemositometre20 kullanarak canlı hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun 10 μL'sini Trypan mavisinin 90-990 μL (hücre sayısına bağlı olarak) ile karıştırın. Hücre numarasını hesaplarken seyreltmeyi dikkate alın (10x-100x).
  7. ALN'ler ve SPL'lerin bir karışımını hazırlayın (oran 1:1): 200 μL DPBS'de 8,0 x 106'dan 7,0 x 107/fareye kadar.
  8. Alıcılar (naif sinjenik fareler): naif alıcı fareleri anestezi altına alın (adım 3.2.2) ve i.v.'yi CHS-efektör hücrelerinin hazırlanmış bir karışımı ile enjekte edin (adım 8.7). Farelerin kontrol grubunda, herhangi bir hücre enjekte etmeyin.
  9. Kulak kalınlığını meydan okumadan önce (0 saat) ve sonra (24 saat) ölçün (adım 3.2.1-3.2.6) (Şekil 10).
  10. Ek olarak, izole CHS-efektör hücreler üzerinde testler yapın (örneğin, hücre fenotiplemesi veya üretilen sitokinlerin CHS-efektör hücreler tarafından akış sitometrisi ile ölçülmesi). Hücre kültürleri de kurulabilir ve CHS-efektör hücrelerin antijen varlığında çoğalma kabiliyeti veya kültür süpernatantlarında salgılanan sitokinlerin miktarı21,22 olarak değerlendirilebilir (veriler sunulmamıştır).
    NOT: Ek testler yapmak, buna bağlı olarak daha fazla hücre bağışçısı gerektirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

CHS indüksiyonu için, hayvanlar cilt boyama (karın) yoluyla 150 μL% 5 TNCB ile hassaslaştırıldı veya sadece araçla hassaslaştırıldı. "4" gününde, her iki kulağın kulak şişmesi tepkileri, daha önce TNCB (test grubu) ve kontrol grubu fareleri (sahte duyarlılaştırılmış) ile daha önce temas halinde olan her iki farede de% 0.4 TNCB'nin 10 μL'si ile temas boyama (meydan okuma) ile indüklendi. Sunulan veriler, TNCB ile duyarlılaşan ve 4 gün sonra meydan okuyan farelerin, benzer şekilde meydan okunan sahte duyarlılaştır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CHS, derideki kendi kendine protein antijenlerine bağlanan ve neoantijenler yaratan haptenler yoluyla indüklenir. CHS, dolaşımdaki antijene özgü CHS-efektör T hücrelerinin lokal ekstravasküler alımı ile aracılık eder, bu da meydan okunan dokuda şişmeye neden olur ve sekonder cildin aynı hapten6'ya maruz kalmasından 24 saat sonra zirveye ulaşır. Dokunun şişmesi esas olarak lökositlerin infiltrasyonundan ve lökosit bağımlı fibrin birikiminden kaynaklanır24. Bu değişi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma subvention SUBZ tarafından desteklenmiştir. Polonya, Wroclaw'daki Tıp Üniversitesi'nin A020.22.060 ve Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı'ndan N N401 545940'tan MS'ye ve IP2012 0443 72'den MMS'ye hibelerle.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Yüzey dezenfeksiyonu için%70 etanolMerck KGaA, Darmstadt, Almanya65350-M
96 kuyulu düz tabanlı plakalar, polipropilenGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, AvusturyaMPOve Evans mavi ölçümü için 655101 - plakalar, proteinlerin veya DNA'nın bağlanmaması için daha düşük bir bağlama kapasitesine sahip polipropilenden yapılmalıdır.
Aseton (ACS reaktifi, ≥ %99,5)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya179124
Alüminyum folyoMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaZ185140
Analitik teraziSartorius Weighing Technology GmbH, Göttingen, AlmanyaPRACTUM224-1S, 29105177
Otomatik doku işlemcisiMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, HindistanMTP-E-212doku örneklerini parafin BD ile sabitleyerek, dehidre ederek, temizleyerek ve sızarak otomatik olarak hazırlayın
BD Vacutainer SST II Advance (serum elde etmek için jelli tüp)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, ABDBD
Protein tayini için biskinkoninik asit kitiMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaBCA1-1KT
Biotin Sıçan Anti-Fare IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, ABD553441
BSA (sığır serum albümini)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaA9418protein tahlilleri ve analizi, 2 mg/mL
Hücre süzgeci, gözenek boyutu 70 & mu; mBIOLOGIX, Çin15-107050 mL tüpler için uygun
LamelVWR, Radnor, Pensilvanya, Amerika Birleşik Devletleri631-158324 mm, ancak farklı boyutlarda kullanmak mümkündür
Tek kullanımlık pipet kapasitesi: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′ s fosfat tamponlu tuzlu su)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, ABD14190144kalsiyum yok, magnezyum yok, memeli hücre kültürü
Histoloji için DPX MountantMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaH-E için 6522montaj ortamı, başka bir şey kullanılabilir, örneğin, Kanada balsamı
Dumont 5 cımbız - düzAnimalab, Poznan, Polonya11251-10FSTfareler üzerindeki prosedürler için cerrahi aletler (steril olmalıdır)
Dumont 7 cımbız - bükülmüşAnimalab, Poznan, Polonya11272-50FSTfareler üzerindeki prosedürler için cerrahi aletler (steril olmalıdır)
Eosin Y solüsyonu, alkollüMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaHT110116
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri 1.5 mLEppenforf, Almanya3,01,20,086polipropilen
Eppendorf Güvenli Kilit Tüpleri, 2.0 mLEppenforf, Almanya3,01,20,094polipropilen, yuvarlak tabanlı (homojenizasyon boncukları kolayca hareket edebilir)
Etanol %100 (mutlak alkohol)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya1.07017
Etanol %96Merck KGaA, Darmstadt, Almanya1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaE2129
FBS (fetal sığır serumu)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD
Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaHT501128
Formamid %99,5 (GC)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaF7503
Dondurucu -20 derece; CBosch, AlmanyaGSN54AW30
Buzdolabı +4 & derece; C / dondurucu -20 derece; CBosch, AlmanyaKGV36V10memeli Hücre Kültürü, nitelikli, Brezilya, 10 x 50 mL
Cam mikroskop slaytları, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pensilvanya, Amerika Birleşik Devletleri631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Boyama sırasında herhangi bir doku kesiti kaybını önlemek için yapışkan malzemeler veya protein kaplamalar uygulama ihtiyacını ortadan kaldıran slaytlar.
Grafik Pedi PrizmaGraphPad Yazılım A.Ş.v. 9.4.0
Gri sabunPollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., PolonyaBialy jelen sabunkalıbı gri Sabun Kalıbı Doğal Hipoalerjenik. Genel olarak mevcut ürün
H2SO4 (sülfürik asit) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya1.60313
Harris hematoksilen çözeltisiMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaHHS16
HemositometreVWR, Avantor, ABD612-5719manuel sayma odası önerilir, bu daha doğrudur
Hekzadesiltrimetilamonyum bromürMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaH5882
HomojenizatörQIAGEN Hilden, AlmanyaDoku Lyser LT, SN 23.1001/052342 mL santrifüj tüpleri için paslanmaz çelik boncuklu (çap 5 mm) homojenizatör
Yaban turpu peroksidaz streptavidin (HRP streptavidin)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, ABDSA-5004-1
Hidrojen peroksit çözeltisi (H2< / sub> 02 < / sub>)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaH1009
İnkübatör Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Almanya4107106837 oC atmosferde %5 CO2 ve deparafinizasyon için 65 0C histoloji bölümleri
için bölümler Ketamin 100 mg / mL, enjeksiyon için çözümBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polonyacat.# mevcut
KH2PO4 (potasyum dihidrojen fosfat) %99,995 susuz bazMerck KGaA, Darmstadt, Almanya1.05108
Laboratuvar SantrifüjüHeraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Almanya4 0C'ye kadar soğutma ile 300 x g'ye kadar B00013899 hızı
Laboratuvar SantrifüjüHeraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Almanya75002425hızı 3.000 x'ye kadar, soğutma ile 4 0C
Maske (FFP2)VWR, Radnor, Pensilvanya, Amerika Birleşik Devletleri111-0917orto-dianisin dihidroklorür ile çalışmak için
Fareler Biyomedikal Bilimler Kürsüsü Yetiştirme birimi, Sağlık Bilimleri Fakültesi, Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi, Krakow, PolonyaCBA/J, C57BL/6
MikrometreMitutoyo, Tokyo, Japonya193-111basamaklı Dış Mikrometre, Cırcır Durdurma, 0-25 mm Aralık, 0,001 mm Derecelendirme, +/- 0,002 mm Doğruluk, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
mikroplaka, 96 kuyulu, mikrolon, yüksek bağlayıcı (ELISA testi için)Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, AvusturyaKolorimetrik tahlillerde güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar için maxi-sorp bağlayıcı yüzeylere sahip655061
Objektifli mikroskopLeica Microsystems CMS GmbH, AlmanyaDM1000, 294011-082007Makalede sunulan histoloji, ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Görüntüleme Sistemi altında, objektiflerle gerçekleştirildi: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD ve FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
İnsan lökositlerinden miyeloperoksidaz (MPO standardı)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodyum fosfat dibazik heptahidrat)Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaS9390
ZeytinyağıMerck KGaA, Darmstadt, Almanya75343saf, doğal
OptEIA Fare IFN-&gama; ELISA SetiBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, ABD555138
Orto-dianisin dihidroklorürMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaD3252
Parafin mumuMerck KGaA, Darmstadt, Almanya76242boncuk, mumsu katı
PBS (fosfat tamponlu tuzlu su)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, ABD20012027pH 7.2, memeli hücre kültürü
pH metreElmetron, PolonyaCP-401
Pipetler, uçlarla birlikte değişken hacimMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaEP3123000900-1EA3'lü paket, Seçenek 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, epT.I.P.S. içerir.
Tıraş bıçağıVWR, Radnor, Pensilvanya, Amerika Birleşik DevletleriPERS94-0462sıyırıcı ve kesici bıçaklar, tek kenarlı, alüminyum sırt, kutu başına 100 bıçak, ayrı ayrı sarılmış
Döner mikrotomMRC Laboratuvar Aletleri, Essex, CM20 2HU İNGILTEREHIS-202A
Makas - düz, keskin / keskinAnimalab, Poznan, Polonya14060-10FSTFareler üzerindeki prosedürler için cerrahi aletler (steril edilmelidir)
Vidalı kapak (üstü açık)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya27056siyah polipropilen delikli kapak, 22  20-400 iplikli mL flakon
SpektrofotometreBioTek Instruments, ABD201446üniversal mikroplaka spektrofotometresi: λ aralık: 200 - 999 nm, absorbans ölçüm aralığı: 0.000 - 4.000 Abs
Boyama kabı 20 raflı slaytMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaS6141örneğin kapaklar, sürgülü raf ve sap ile tamamlanmış 20 slayt boyama kabı
Steril Tek Kullanımlık Biyopsi Punch 6mmIntegra LifeSciences, Princeton, NJ, ABD33-36
Cerrahi makasAnimalab, Poznan, Polonya52138-46Fareler üzerindeki prosedürler için cerrahi aletler (steril olmalıdır)
Doku işleme kasetleriMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaZ672122doku işleme/ kapaklı kaset gömme
TMB Substrat Reaktif SetiBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, ABD555214
TNCB (2,4,6-trinitroklorobenzen)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JaponyaC0307
TNP-BSA (2,4,6-trinitrofenil ile konjuge sığır serum albümini)BiyoaraştırmaTeknolojileri LGC, Petaluma, CA, ABDT-5050
T-PER (doku proteini ekstraksiyon reaktifi)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, ABD78510
Tüpler 15 mL sterilMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaCLS430055 (Corning)polipropilen, konik tabanlı
Tüpler 50 mL, sterilMerck KGaA, Darmstadt, AlmanyaCLS430290 (Corning)polipropilen, konik tabanlı
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaP1379
, vidalı kapak, şeffaf cam (yalnızca şişe) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Almanya27173haptenin hazırlanması için, buharlaşmaması için vidalanır
Su banyosuAJL Electronic, PolandLW102
Balmumu (parafin) dağıtıcıVWR, Radnor, Pensilvanya, Amerika Birleşik Devletleri114-8737
Enjeksiyon için ksilazin (ksilapan 20 mg / mL) çözeltisiVetokinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polonyacat.# mevcut değil
Ksilen (histolojik derece)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya534056
366882 A3160802değilŞişeler

Kaynaklar

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Etiketler

T H cresi Yan tKulak i mesiHapten SensitizasyonuMiyeloperoksidaz AnaliziVask ler Ge irgenlikEfekt r H cre TransferiLenf Nod zolasyonu

İlgili makaleler