Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır
Bu makalede
Özet
Özet
Aptamerler, yüksek afinite ve özgüllükle bağlanan hedef tanıma molekülleridir. Bu özellikler, sinyal üretme kabiliyetine sahip diğer molekülleri kontrol etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan sistem için, modifiye edilmiş bir çekiç kafalı ribozimin Kök II'si olan aptamerik bir alan aracılığıyla hedef tanıma, başlangıçta yapılandırılmamış yapıyı stabilize ederek kendiliğinden yarılan ribozimi aktive eder. Cis-cleaving RNA, Kök III ve Kök I'in birleşme noktasında hareket eder ve iki bölünme ürünü oluşturur. Daha uzun bölünme ürünü, iki benzer katalitik olarak aktif G-dörtlüsünün izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonunu (EXPAR) hazırlar. Ortaya çıkan bu amplifikasyon ürünleri, çıplak gözün algılayabileceği bir çıkışla kolorimetrik bir substratın indirgenmesine bağlı olan peroksidaz indirgemesini katalize eder. Bu çalışmada açıklanan 3 parçalı sistem, enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) gibi tespit yöntemlerini, 15 dakika gibi kısa bir sürede 0.5 μM teofilin kadar düşük bir sürede varlığını göstermek için görsel olarak tespit edilebilir bir sinyal üreterek geliştirir.
Giriş
Aptamerler tipik olarak, istenen hedeflere yüksek bağlanma afinitesi ve özgüllüğü olan evrimsel bir süreçle seçilen tek sarmallı DNA veya RNA'dır1. Bağlama kabiliyetine ek olarak, aptamerler sinyal çıkış fonksiyonları2,3 ile motiflere bağlanabilir ve kontrol edilebilir, bu da söz konusu sinyali yükseltir ve sistemin hassasiyetini arttırır. G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu (GQ-EXPAR) sistemi, görsel bir çıktıüretmek için tek bir reaksiyon kabına ardışık bileşenler eklendikçe görsel bir sinyal geliştiren üç parçalı bir sistemdir (Şekil 1). Bu sistem, ilgilenilen bir hedefin hızlı ve spesifik bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için kolaylaştırılmış bir iş akışı kullanarak belirli bir numunedeki belirli bir hedefin, burada teofilin 15 dakika içinde tespit edilmesini sağlar. Bu yöntem, hedef konsantrasyonun spesifik niceliğinin, kısa sürede yanıtın yüksek özgüllüğünden daha düşük bir endişe kaynağı olduğu numuneler için düşünülmelidir.
Bir allosterik riboswitch, kendi kendine bölünmeye uğrayan bir yapı değiştiren RNA molekülü (ribozim), başlangıç sinyalini üretir. Bu yapı, Kök II'de bölünme aktivitesinin düzenleyicisi olarak tanıtılan aptamerik bir alana sahip çekiç kafalı ribozime dayanmaktadır. Kendi kendine bölünme fonksiyonu, aptamerik alanı hedef5'e bağlandığında stabilize edildiğinde aktive olur. Aksi takdirde, anahtar yerel durumunda etkin değildir.
Sonraki üstel amplifikasyon reaksiyonu (EXPAR), bir izotermal amplifikasyon reaksiyonu6'yı asal hale getirmek için kendinden parçalanmış RNA ipliğinin ilk aşamadan salınmasını kullanır. EXPAR'ın amplifikasyon ürünü, sistemin son aşaması için temel görevi gören peroksidaz aktivitesi7'ye sahiptir. Bazı substratlar peroksit parçalanması ile birlikte oksitlendiğinde, çeşitli enstrümantasyonda ölçülebilen bir floresan çıkışı üretirler. Diğer yaygın substratlar, görsel algılama için renkli bir ürün üretmek üzere değiştirilebilir. EXPAR ve amplifikasyon ürünlerinin peroksidaz aktivitesi, 2 aşamalı bir sinyal arttırıcı olarak işlev görür ve geleneksel stratejilere kıyasla duyarlılığı daha yüksek seviyelere çıkarır 7,8.
Teofilin kafeine karşı teofilin tespiti, sadece tek bir metil grubuna göre farklılık gösterdikleri için bu algılama platformunun özgüllüğünün bir örneği olarak kullanılır (Şekil 2). Sistemin bu gösterimi, en az 500 nM teofilin görsel tespiti için kolorimetrik bir çıktı üretir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Reaksiyon bileşenlerinin spesifik hacimleri ve konsantrasyonları dahil olmak üzere tüp hazırlama için Ek Tablo 1'e (reaksiyon kurulum tablosu) bakınız. Burada gösterilen protokol, Malzeme Tablosunda açıklandığı gibi önceden monte edilmiş bir algılama platformu kiti kullanır. Aksi belirtilmedikçe tüm bileşenler buz üzerinde tutulmalıdır.
1. Ribozimin hazırlanması
NOT: Birincil tespit bileşeni, teofilini tanıyan allosterik (aptamer regüle edilmiş) bir ribozimdir (bakınız Ek Tablo 2).
- Ribozim bölünme ürünlerini aktive etmek için kullanılacak bir PCR tüpünde 5 U T4 polinükleotid kinaz (0.5 μL, Malzeme Tablosuna bakınız) toplayın.
NOT: Bu bileşen ilk önce eklenir, böylece kullanıcı enzimin doğru dağılımını görebilir. - Her numune tüpüne (PCR tüpü) 1 μL önceden hazırlanmış 5x ribozim tamponu (bkz.
- Özgüllüğü görsel olarak göstermek amacıyla, test numuneleri olarak her numune tüpüne 1,5 μL 2 mM teofilin (hedef) veya 2 mM kafein (kontrol) (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
NOT: Standart bir eğri oluşturmak için, 3,125 mM analitten başlanması ve 0,001 mM'ye kadar beş kat seyreltmenin test edilmesi önerilir. - Her numune tüpünü 5-10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
- 5 μL test çözeltisinde 240 nM'lik nihai konsantrasyon elde etmek için her numune tüpüne hedefe özgü bir aptamerik alan içeren 2 μL 600 nM RNA ekleyin (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız), ardından pipetleme ile hızlı bir şekilde karıştırın ve arka plan sinyalini en aza indirmek için soğuk bir bloğa yerleştirin.
NOT: Başlangıçta tüm reaksiyonları ribozim olmadan hazırlamak önemlidir, çünkü ribozim ribozim tamponu ile birleştirildiğinde kendiliğinden bölünme reaksiyonu hemen başlayacak ve önemli bir arka plan oluşturabilir. - Tüm reaksiyon tüpleri hazırlandıktan sonra, her bir numuneyi (5 μL) oda sıcaklığında (23 ° C) bir zamanlayıcı kullanarak tam olarak 3 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra numune tüplerini derhal buza (4 ° C) geri getirin.
2. GQ-EXPAR
- Her numune tüpüne 3,5 μL nickaz-polimeraz enzim karışımı ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve iyice karıştırın.
NOT: Gerekli enzim konsantrasyonları, kombinasyonu ampirik olarak belirlenen tanıma dizilerine, enzim tiplerine ve reaksiyon sıcaklıklarına bağlıdır. - Karıştırılacak her numune tüpüne ve pipete şablon, nükleotitler ve reaksiyon tamponu içeren 31,5 μL EXPAR reaksiyon karışımı ekleyin (bkz.
NOT: Bileşen konsantrasyonları, polimeraz ürünlerinin enzimlerine ve dizilerine göre optimize edilmiştir. - Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, hazırlanan her numuneyi (40 μL) bir zamanlayıcı kullanarak tam olarak 5 dakika boyunca 55 ° C'de inkübe edin. Mümkünse, ısıtılmış bir kapak gereksiz olsa da, bir termosiklet üzerinde inkübe edin.
- İnkübasyon adımından sonra numune tüplerini derhal buza (4 ° C) geri getirin.
3. Renk geliştirme
- Her numune tüpüne 2 μL Hemin çözeltisi (25 uM, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve iyice karıştırın.
- Her numune tüpüne ticari olarak temin edilebilen TMB çözeltisinden 58 μL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iyice karıştırın.
- Renk geliştirme reaksiyonunu (100 μL) oda sıcaklığında en az 3 dakika ve 30 dakikaya kadar inkübe edin.
NOT: (İsteğe bağlı) 20 μL 2 M sülfürik asit eklenerek renk gelişimi durdurulabilir. - Numuneleri gözle kalitatif olarak okuyun veya renk geliştirme reaksiyonları sülfürik asit kullanılarak durdurulursa 450 nm'de bir absorbans plakası okuyucusu kullanarak sonuçları ölçün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1'de gösterilen tespit platformu, aptamerik hedef tanımayı kısa bir süre içinde numune preparatları (hedef ve hedef olmayan, Şekil 2) arasında görsel olarak farklı farklılıklara dönüştürür. Soukup ve ark.5 tarafından tanımlanan allosterik bir ribozim, kontrol ve negatif numuneler üzerindeki hedefe yanıt veren daha az gürültülü bir dizi oluşturmak için başlangıç noktası olarak hizmet etti. Optimize edilmiş yapı, 30 dakika içinde 500 ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan yöntem, allosterik bir ribozimde başlangıçta düzensiz bir ikincil yapı ile cis-yarık çekiç kafası ribozimini aktive etmek için hedefin aptamerik alana bağlanması yoluyla sağlanan ek stabilite arasındaki geçişten yararlanır. Ribozimin stabilitesi, hedefin yokluğunda katalitik aktiviteyi en aza indirgemek için ayarlanırken, hedef bağlamanın aktif yapıyı restore etmesine izin verdi. Ek olarak, EXPAR ve renk gelişimini kolaylaştırmak için gerekli çoklu enzimlerin tamponlarını dengelemek için özen gösterilmelid...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Aptagen, LLC, aptamer tabanlı bir algılama sistemi ile doğrudan deneyim isteyenler için bir GQ-EXPAR Gösteri Kiti üretmekte ve pazarlamaktadır.
Teşekkürler
Bu araştırma, Aptagen LLC'nin Araştırma ve Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3,3 ', 5,5' Tetrametilbenzidin dihidroklorür (TMB) çözeltisi H 2< / sub > O < sub > 2 < / sub>, "MaxSignal TMB Microwell Substrat Solüsyonu" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Renk geliştirme reaktifi. Işığa ve atmosfere maruz kalmayı en aza indirin. Daha önce BIOO Bilimsel katalog numarası 1806. Apta-beacon Gösteri Kitinde Tüp 3-2 olarak Tedarik Edilmiştir. |
| 5'- TCC, CTC, CCT, CCC, TCC, CKG, TCC, AGA, CTC, TTC, CCT, CCC, TCC, CTC, CCA, GA-Biotin-3' | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | EXPAR'ın G-dörtlüsü üretmesi için özel olarak Optimize Edilmiş QtQ47 DNA şablonu, G-dörtlüsü tarafından astarlanmıştır. Bu, EXPAR'ın "üstel" kısmı için, Adım 3 renk gelişimi için kullanılan DNAzyme miktarını hızla artırmak için kullanılır. Şablon, Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-2'nin bir parçası olan EXPAR. sırasında Bst 2.0 DNA polimeraz tarafından istenmeyen uzamayı önlemek için bir 2'-biyotin içerir. | |
| 5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UAG UU-3' | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | Soukup ve ark. Soukup, G. A., Emilsson, G. A. ve Breaker, R. R. (2000) Allosterik seleksiyon ile RNA aptamerlerinin moleküler tanınmasının değiştirilmesi, Journal of molecular biology 298, 623-632. Apta-beacon Demonstrasyon Kitinde Tüp 1-3 olarak sağlanır. | |
| 5'-TCC, CTC, CCT, CCC, TCC, CAG, TCC, CAC, TAC, GGC, TTT, CAC, CGT, TTC, AAC, G-Biotin-3' | Entegre DNA Teknolojileri (IDT) | EXPAR'ın P3 bölünme ürünü ile astarlanmış G-dörtlü üretmek için özel olarak optimize edilmiş P3tQ49 DNA şablonu. Bu, Adım 2'de, bölünme ürününü Adım 3 renk geliştirme için kullanılan DNAzyme'ye çevirmek için kullanılır. Şablon, Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-2'nin bir parçası olan EXPAR. sırasında Bst 2.0 DNA polimeraz tarafından istenmeyen uzamayı önlemek için bir 2'-biyotin içerir. | |
| 5x Ribozim Tampon | Aptagen, LLC | N/A | 5x bileşim: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Adım 1. 'de kullanılır ve apta-beacon gösteri kitinde tüp 1-4 olarak verilir. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Gösteri Kiti | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | Demo kiti, yalnızca tek bir metil grubuna göre farklılık gösteren zor küçük molekül hedeflerini, teofilin ve kafeini tespit ederek kolorimetrik testin özgüllüğünü gösterir. |
| Bst 2.0 DNA polimeraz | New England Biolabs | M0537S | İplikçik yer değiştirme aktivitesine sahip izotermal amplifikasyon polimeraz. 9.375 U/uL. 'de hazırlanan Nickase-Polimeraz Karışımının bir parçası Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-1'in bir parçası. |
| Tampon 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | EXPAR Karışımında 1.11X EXPAR Tamponu üretmek için 2 uL 10X İzotermal Amplifikasyon Tamponu ve 27.5 uL nükleaz içermeyen su ile birleştirilmiştir. Bu ürün, ilk sistem geliştirmenin bir parçası olan daha önce kullanılan B7203SVIAL yerini alır (rekombinant olmayan BSA hariç aynı bileşim). Apta-beacon Gösteri Kiti Tüp 2-2'nin bir parçası. |
| Kafein | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer karşı hedef (kontrol), nükleaz içermeyen su ile hazırlanmıştır. Apta-beacon Gösteri Kitinde Tüp 1-1 olarak verilir. |
| dNTP'ler | New England Biolabs | N0447S | EXPAR reaksiyon karışımının bir parçası. Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-2'nin bir parçası. |
| EXPAR reaksiyon karışımı | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTP'ler, 0.38 & mu; M P3tQ49, 0.38 & mu; M QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 & mu; g/ml BSA, %0,0635 ara 20, Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-2'nin bir parçası. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | DMF'de 25 uM. 'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edildi Apta-beacon gösteri kitinde tüp 3-1 olarak sağlanır. |
| İzotermal Amplifikasyon Tamponu | New England Biolabs | B0537SVIAL | 2 uL 10x Tampon 3.1 ve 27.5 & mikro ile birleştirilmiş; Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-2'nin bir parçası olan EXPAR Mix. içinde 1,11x EXPAR Tamponu üretmek için L nükleaz içermeyen su. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Çekiç başlı ribozim kofaktörü, kendi kendine bölünme için gerekli. Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 1-3'ün bir parçası. |
| MJ PTC-100 Termodöngüleyici | MJ Araştırma A.Ş. | PTC-100 | Thermocycler. Herhangi bir termosikleyici veya sıcak blok kullanılabilir. |
| N, N-Dimetilformamid (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Hemini yeniden süspanse etmek ve dondurucuda raf ömrünü en üst düzeye çıkarmak için kullanılır. Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 3-1'in bir parçası. |
| Nickase-polimeraz Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 birim/μ L) ve Bst 2.0 DNA polimeraz (0.5 birim/μ L). Apta-beacon gösteri kitinde tüp 2-1 olarak verilir. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Sürekli izotermal amplifikasyona izin vermek için çentikleme enzimi. 0.5 U/uL. 'de hazırlanan Nickase-Polimeraz Karışımının bir parçası Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 2-1'in bir parçası. |
| T4 Kinaz Tamponu | New England Biolabs | B0201SVIAL | Siklik fosfatın çıkarılması için gerekli enzim için tampon. Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 1-4'ün bir parçası. |
| T4 polinükleotid kinaz | New England Biolabs | M0201S | Bölünme ürününün izotermal amplifikasyon reaksiyonunu astarlamasına izin vermek için bölünme sonrası döngüsel fosfatı giderir. Apta-beacon Gösteri Kitinde PCR Tüpleri olarak sağlanır. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Adım 3 sonuçlarından gelen absorbans sinyalini ölçmek için plaka okuyucu. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer hedefi, nükleaz içermeyen su ile hazırlanmıştır. Apta-beacon Gösteri Kitinde Tüp 1-2 olarak verilir. |
| Tris-HCl | Amerikan Biyoanalitik | AB14043-01000 | Aptamer bağlama tamponu. Apta-beacon Gösteri Kiti Tüpü 1-4'ün bir parçası. |
Kaynaklar
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
