Yöntem makalesi

Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

DOI:

10.3791/64389

⸱

18 Ekim 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAV peptit görüntüleme kütüphanesi üretimi ve yeni nesil AAV'lerin oluşturulması için yeni özelliklere sahip adayların barkodlaması yoluyla daha sonra doğrulanması.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno ilişkili virüsten (AAV) türetilen gen dağıtım vektörleri, klinik verilerin teşvik edilmesi ve çeşitli AAV gen tedavilerinin onaylanmasıyla kanıtlanan genetik hastalıkların tedavisi için en umut verici araçlardan biridir. AAV vektörlerinin başarısının iki ana nedeni, (i) farklı özelliklere sahip çeşitli doğal olarak oluşan viral serotiplerin önceden izole edilmesi ve (ii) moleküler mühendisliği için güçlü teknolojilerin daha sonra kurulması ve yüksek verimde yeniden kullanılmasıdır. Bu tekniklerin potansiyelini daha da artırmak, son zamanlarda DNA ve RNA düzeyinde seçilmiş AAV kapsidlerini barkodlamak için stratejiler uygulanmakta ve tek bir hayvandaki tüm ana organlarda ve hücre tiplerinde kapsamlı ve paralel in vivo tabakalaşmalarına izin vermektedir. Burada, mevcut kapsid mühendisliği teknolojilerinin çeşitli cephaneliğini temsil etmek için AAV peptid ekranını kullanarak, bu tamamlayıcı caddeler kümesini kapsayan temel bir boru hattı sunuyoruz. Buna göre, ilk olarak, istenen özelliklere sahip adayların in vivo seçimi için bir AAV peptid görüntüleme kütüphanesinin oluşturulması için önemli adımları açıklıyoruz, ardından ikincil in vivo tarama için en ilginç kapsid varyantlarının nasıl barkodlanacağının bir gösterimi ile devam ediyoruz. Daha sonra, NGS veri analizi sırasında en kritik adımlara genel bir bakışla bitirmeden önce, barkod amplifikasyonu ve adaptör ligasyonu dahil olmak üzere yeni nesil dizileme (NGS) için kütüphanelerin oluşturulmasına yönelik metodolojiyi örneklendiriyoruz. Burada bildirilen protokoller çok yönlü ve uyarlanabilir olduğundan, araştırmacılar en sevdikleri hastalık modelinde ve gen terapisi uygulamalarında optimal AAV kapsid varyantlarını zenginleştirmek için bunları kolayca kullanabilirler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen transfer terapisi, hastalığı önlemek, tedavi etmek, iyileştirmek veya iyileştirmek için hücresel genetik materyali onarmak, değiştirmek veya değiştirmek için hücrelere genetik materyalin sokulmasıdır. Hem in vivo hem de ex vivo gen transferi, viral olmayan ve viral olan farklı dağıtım sistemlerine dayanır. Virüsler, hedef hücrelerini verimli bir şekilde dönüştürmek için doğal olarak evrimleşmiştir ve dağıtım vektörleri olarak kullanılabilir. Gen terapisinde kullanılan farklı viral vektör türleri arasında, adeno ilişkili virüsler, patojenite, güvenlik, düşük immünojenite eksikliği ve en önemlisi uzun vadeli, entegre olmayan ekspresyonu sürdürme yetenekleri nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır 1,2,3. AAV gen tedavisi son on yılda önemli başarılar sağlamıştır; Avrupa İlaç Ajansı ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından insanlarda kullanılmak üzere üç tedavi onaylanmıştır 3,4. Hemofili, kas, kalp ve nörolojik hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için başka yerlerde gözden geçirildiği gibi çeşitli klinik çalışmalar da devam etmektedir3. On yıllardır süren ilerlemeye rağmen, gen terapisi alanı son yıllarda bir dizi aksilik yaşamıştır4, en önemlisi klinik çalışmalarda ölümler5, özellikle kas gibi büyük veya beyin gibi ulaşılması zor dokular için doz sınırlayıcı toksisiteler nedeniyle beklemeye alınmıştır6.

Şu anda klinik çalışmalarda kullanılmakta olan AAV vektörleri, birkaç istisna dışında doğal serotiplere aittir1. AAV mühendisliği, üstün organ veya hücre özgüllüğü ve verimliliğine sahip vektörler geliştirme fırsatı sunar. Son yirmi yılda, peptid gösterimi, döngü değişimi, kapsid DNA karıştırma, hataya eğilimli PCR ve hedefli tasarım gibi çeşitli yaklaşımlar, farklı özelliklere sahip bireysel AAV varyantları veya kütüphaneleri oluşturmak için başarıyla uygulanmıştır7. Bunlar daha sonra, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, istenen özelliklere sahip varyantları seçmek için birden fazla yönlendirilmiş evrim turuna tabi tutulur 1,3. Tüm kapsid evrim stratejileri arasında, peptid görüntüleme AAV kütüphaneleri, bazı benzersiz özelliklerden dolayı en yaygın kullanılanı olmuştur: üretilmeleri nispeten kolaydır ve evrimlerini takip etmelerini sağlayan yüksek çeşitlilik ve yüksek verimli dizileme elde edebilirler.

İlk başarılı peptit yerleştirme AAV kütüphaneleri yaklaşık 20 yıl önce tanımlanmıştır. İlklerinden birinde, Perabo ve ark.8 , rastgele üretilen oligonükleotidlerin bir havuzunun, VP1 kapsid proteininin amino-asit 587'sine karşılık gelen bir pozisyonda, kapsidden çıkıntı yapan üç katlı eksende bir plazmid içine yerleştirildiği modifiye AAV2 kapsidlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmuştur. Adenovirüs ko-enfeksiyonu kullanılarak, AAV kütüphanesi çoklu seçim turları yoluyla geliştirildi ve son yeniden hedeflenen varyantların, ebeveyn AAV28'e dirençli hücre hatlarını dönüştürebildiği gösterildi. Bundan kısa bir süre sonra, Müller ve ark.9 , kütüphane üretimi için protokolde önemli bir gelişme olan iki aşamalı sistemi tanıttı. Başlangıçta, plazmid kütüphanesi, bir adenoviral yardımcı plazmid ile birlikte, kimerik kapsidler içeren bir AAV kütüphanesi üretmek için kullanılır. Bu AAV mekik kütüphanesi, hücre başına bir viral genom tanıtmak amacıyla, düşük enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Adenovirüs ile birlikte enfeksiyon, eşleşen bir genom ve kapsid9 ile AAV'lerin üretimini sağlar. Yaklaşık on yıl sonra, Dalkara10 , 7m8 varyantını oluşturmak için in vivo yönlendirilmiş evrimi kullandı. Bu varyant, üçü bağlayıcı görevi gören 10 amino asit yerleştirmesine (LALGETTRPA) sahiptir ve intravitreal enjeksiyon10'dan sonra dış retinayı etkili bir şekilde hedefler. Bu mühendislik kapsid, olağanüstü bir başarı öyküsüdür, çünkü şimdiye kadar kliniğe ulaşan birkaç mühendislik kapsidinden biridir11.

Alan, yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinin tanıtılmasıyla ikinci bir artış yaşadı. 2014 yılında Adachi ve ark.12'den ve 2015 yılında Marsic ve ark.13'ten iki yayın, barkodlu AAV kapsid kütüphanelerinin dağılımını yüksek doğrulukla izlemek için NGS'nin gücünü sergiledi. Birkaç yıl sonra, barkodlu bölgelerin NGS'si, kapsid evrimini takip etmek için peptit yerleştirme bölgesine uyarlandı. Körbelin ve ark.14, pulmoner hedefli AAV2 bazlı kapsid tanımlamak için NGS rehberliğinde bir tarama gerçekleştirdi. NGS analizi üç derecelendirme puanının hesaplanmasına yardımcı oldu: seçim turları arasındaki zenginleştirme puanı, doku özgüllüğünü belirlemek için genel özgüllük puanı ve son olarak birleşik puan14. Gradinaru laboratuvarı15, aynı yıl içinde hücre tipine özgü bir seçimi kolaylaştıran Cre-rekombinasyon tabanlı AAV hedefli evrim (CREATE) sistemini yayınladı. Bu sistemde, kapsid kütüphanesi Cre-ters çevrilebilir bir anahtar taşır, çünkü poliA sinyali iki loxP bölgesi tarafından çevrelenir. AAV kütüphanesi daha sonra Cre farelere enjekte edilir, burada poliA sinyali sadece Cre + hücrelerinde ters çevrilir ve kapsid geni içindeki ileri astar ile ters PCR primerinin bağlanması için şablon sağlar. Bu son derece spesifik PCR kurtarma, AAV-PHP'nin tanımlanmasını sağladı. Kan-beyin bariyerini geçebilen B varyantı15. Bu sistem ayrıca NGS ve sentetik kütüphane üretiminin boru hattı16'ya entegre edildiği M-CREATE'e (Multiplexed-CREATE) dönüştürüldü.

Maguire lab17'den bu sistemin geliştirilmiş bir RNA tabanlı versiyonu olan iTransduce, hücreleri işlevsel olarak dönüştüren ve genomlarını ifade eden kapsidlerin DNA seviyesinde seçime izin verir. Peptid görüntüleme kütüphanesinin viral genomu, her yerde bulunan bir promotörün kontrolü altındaki bir Cre genini ve p41 promotörünün kontrolü altındaki kapsid genini içerir. Kütüphane, tdTomato'nun yukarı akımında bir loxP-STOP-loxP kasetine sahip farelere enjekte edilir. Viral genomu ve dolayısıyla Cre'yi eksprese eden AAV varyantları ile transdübe edilen hücreler tdTomato'yu eksprese eder ve hücre belirteçleri ile kombinasyon halinde sıralanabilir ve seçilebilir17. Benzer şekilde, Nonnenmacher ve ark.18 ve Tabebordbar ve ark.19, kapsid gen kütüphanesini dokuya özgü promotörlerin kontrolü altına yerleştirmiştir. Farklı hayvan modellerinde enjeksiyondan sonra, kapsid varyantlarını izole etmek için viral RNA kullanıldı.

Alternatif bir yaklaşım, capsid kitaplıklarını etiketlemek için barkodlama kullanmaktır. Björklund laboratuvarı20 , bu yaklaşımı barkod peptit yerleştirme kapsid kütüphaneleri için kullandı ve barkodlu rasyonel AAV vektör evrimini (BRAVE) geliştirdi. Bir plazmidde, Rep2Cap kaseti ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR) ile çevrili, sarı floresan protein (YFP) eksprese eden, barkod etiketli transgenin yanında klonlanır. Kapağın sonu ile barkodun başlangıcı arasındaki loxP bölgelerini kullanarak, bir in vitro Cre rekombinasyonu NGS için yeterince küçük bir parça üretir, böylece peptid yerleştirmenin benzersiz barkodla (arama tablosu, LUT) ilişkilendirilmesine izin verir. AAV üretimi plazmid kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilir ve mRNA'da eksprese edilen barkodlar in vivo uygulamadan sonra yine NGS20 ile taranır. Kapsid kütüphaneleri tüm kapsid geninin varyantlarını (yani, karıştırılmış kütüphaneler) içerdiğinde, uzun okunan dizilemenin kullanılması gerekir. Birçok grup, NGS'nin daha yüksek okuma derinliğine sahip olmasını sağlayan bu çeşitli kütüphaneleri etiketlemek için barkodlar kullandı. Kay lab21 , çok çeşitli kapsid karıştırılmış kütüphaneleri, kapak poliA sinyalinin aşağı yönündeki barkodlarla etiketledi. İlk adımda, barkodlu bir plazmid kütüphanesi oluşturuldu ve karıştırılmış kapsid gen kütüphanesi klonlandı. Daha sonra LUT21'lerini oluşturmak için MiSeq (kısa okuma, daha yüksek okuma derinliği) ve PacBio (uzun okuma, daha düşük okuma derinliği) NGS ve Sanger diziliminin bir kombinasyonu kullanıldı. 2019 yılında, Ogden ve Church lab 22'den meslektaşları, her pozisyonda tek nokta mutasyonları, eklemeleri ve silmeleri olan kütüphaneleri kullanarakAAV2 kapsid uygunluğunu tanımladılar ve sonuçta makine rehberliğinde tasarıma olanak sağladılar. Kütüphanenin oluşturulması için, kapsid geninin daha küçük parçaları sentezlendi, bir barkodla etiketlendi, yeni nesil sıralandı ve daha sonra tam kapsid genine klonlandı. NGS verileri bir LUT oluşturmak için kullanıldı. Kütüphane daha sonra sadece barkodlar ve kısa okuma sıralaması kullanılarak tarandı ve bu da daha yüksek okuma derinliği22'ye izin verdi.

Barkodlu kütüphaneler ağırlıklı olarak, kapsid kütüphanelerinin birkaç tur seçimini takiben veya bir kapsid evrimi çalışmasından bağımsız olarak bilinen, doğal ve mühendislik varyantlarından oluşan bir havuzu taramak için kullanılmıştır. Bu tür kütüphanelerin avantajı, hayvan sayısını azaltırken ve hayvanlar arasındaki çeşitliliği en aza indirirken birden fazla kapsid tarama fırsatıdır. Bu teknolojiyi AAV alanına tanıtan ilk çalışmalar neredeyse on yıl önce yayınlandı. Nakai laboratuvarı 12, AAV9'dan VP1'de 356 ila 736 amino asitleri kapsayan 191 çift alanin mutantını bir çift 12-nükleotid barkodla etiketledi. NGS kullanılarak, kütüphane galaktoz bağlama ve diğer özellikler12 için in vivo olarak tarandı. Marsic ve meslektaşları, AAV varyantlarının biyolojik dağılımını, 1 yıl sonra13 çift barkablolu bir analiz kullanarak tanımladılar. İnsan olmayan primatlarda yapılan daha yeni bir çalışma, farklı doğum yolları kullanarak 29 kapsidin merkezi sinir sistemindeki biyodağılımını karşılaştırmıştır23. Laboratuvarımız yakın zamanda doğal ve mühendislik ürünü AAV'leri içeren 183 varyantın barkodlu AAV kütüphane ekranlarını yayınladı. DNA ve RNA seviyesindeki bu ekranlar, farelerde oldukça miyotropik bir AAV varyantı24'ün tanımlanmasına ve fare beyninde yüksek hücre tipi özgüllük gösteren diğerlerine yol açtı25.

Burada, bu çalışmada kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz ve AAV peptid görüntüleme kütüphanelerinin taranmasını içerecek şekilde genişletiyoruz. Bu, AAV2 peptit görüntüleme kütüphanelerinin oluşturulmasını, niceleme için bir dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini ve son olarak kısmen Weinmann ve meslektaşlarının çalışmalarına dayanan AAV varyantlarını analiz etmek için bir NGS boru hattını içerir24. Son olarak, barkodlu AAV kütüphanelerinin neslinin ve aynı yayında kullanılan NGS boru hattının bir açıklaması verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. AAV2 rastgele 7-mer peptid ekran kütüphanesi hazırlığı

NOT: Bir AAV2 rastgele peptid görüntüleme kütüphanesinin hazırlanması için, dejenere oligonükleotidleri tek sarmallı DNA olarak sentezleyin, çift sarmallı DNA'ya dönüştürün, sindirin, alıcı plazmidine ve elektroporata bağlayın.

  1. Dejenere oligonükleotidlerin tasarımı
    1. Dejenere oligonükleotidleri sipariş edin ve kodon yanlılığından kaçının. Oligonükleotid 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3'te X01, her biri 20 amino asitten birini kodlayan 20 kodona karşılık gelir. W, arginin (R) veya serin (S) amino asitlerini kodlayan AGA veya AGT kodonları üreten A veya T olabilir.
    2. Amplifikasyon astarını sipariş edin: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (ayrıntılar için Şekil 1'e bakın). Bu, aşağıdaki protein ekini üretir: R/S GX 7. Teorik çeşitlilik aşağıdaki gibi hesaplanır: 1 x 2 x 207 = 2.56 x 109 benzersiz varyant.
      NOT: Bu çeşitliliğin dönüşüm verimliliği ile sınırlandırılabileceği unutulmamalıdır.
  2. İkinci iplik sentezi
    1. Her iki oligonükleotidleri (dejenere oligonükleotidler ve amplifikasyon primeri) TE tamponu ile 100 μM nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.
      1. PCR reaksiyonu için, her bir astarın 1 μL'si, tamponun 10 μL'si, 1.5 μL DMSO, 0.5 μL dNTP'ler (10 mM), 0.5 μL'si Hi-fidelity Sıcak Başlangıç Polimeraz II ve 35.5 μL nükleaz içermeyen su ile 50 μL'lik bir reaksiyon ayarlayın.
      2. Reaksiyonu bir termosiklier'e aktarın ve 98 ° C'de 10 sn için bir ön inkübasyon adımı, ardından 98 ° C'de 10 s, 59 ° C'de 30 s ve 72 ° C'de 10 sn olmak üzere üç döngü, ardından 72 ° C'de 5 dakika ve son bir soğutma adımı çalıştırın.
    2. Bir nükleotid giderme kiti kullanarak reaksiyonu saflaştırın ve 100 μL nükleaz içermeyen suda salın.
    3. İkinci iplik sentezinin verimliliğini bir Biyoanalizör üzerinde analiz yaparak onaylayın (bkz. Şekil 2). Üreticinin talimatlarına göre bir DNA 1000 Reaktifler kitinden bir mikroakışkan çipe reaksiyonun 1 μL'sini yükleyerek çift sarmallı kesici ucun boyutunu ve saflığını analiz edin. Bu kit, çift sarmallı DNA fragmanlarının boyutunu ve konsantrasyonunu 25-1.000 bps arasında ölçmek için optimize edilmiştir.
  3. Kesici uç ve plazmid vektörünün sindirimi
    1. Saflaştırılmış kesici ucun 85 μL'sini 10 μL 10x tampon ve 5 μL BglI enzimi ile son 100 μL reaksiyon hacminde sindirin (ayrıntılar için Şekil 1'e bakın). Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bir nükleotid giderme kiti kullanarak saflaştırın, 50 μL nükleaz içermeyen suda sayın ve bir spektrofotometrede "Oligo DNA" tipini kullanarak sayısallaştırın.
    2. Son 200 μL reaksiyon hacminde 20 μL 10x tampon ve 10 μL SfiI enzimi ile replikasyon yetkin bir AAV plazmidinin (pRep2Cap2_PIS)26 (ITR ile çevrili viral genom) 10 μg'sini sindirin (ayrıntılar için Şekil 1'e bakın). Gece boyunca 50 ° C'de inkübe edin. Jel ekstraksiyon kitini kullanarak vektörü% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde saflaştırın, ardından bir DNA saflaştırma kiti kullanarak ek bir saflaştırma adımı izleyin. Bir spektrofotometredeki konsantrasyonu sayısallaştırın.
  4. Kesici ucun vektöre bağlanması
    1. 20 μL ligasyon reaksiyonunda 2 μL tampon ve 2 μL ligaz ile 45 ng kesici uç ile 955 ng plazmid vektörünü ligate. Gece boyunca 16 ° C'de inkübe edin, ardından ligazı ısıl inaktive etmek için 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  5. Dönüşüm, karmaşıklık hesaplaması ve plazmid kütüphanesi hazırlama
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek reaksiyonu bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın. Reaksiyonu, nükleaz içermeyen suyun başlangıç hacminin yaklaşık% 80'inde boşaltın ve sonraki dönüşüm için buz üzerinde saklayın.
    2. Elektrokompetan hücreleri dönüştürün: Bir şişe elektrokompetan hücreyi buz üzerinde 10 dakika boyunca çözün. Daha sonra 30 μL (bir şişe) elektrokompetan hücreye saflaştırılmış ligasyon reaksiyonunun 1-2 μL'sini ekleyin ve hafifçe dokunarak karıştırın. Daha sonra, hücre/DNA karışımını hava kabarcıkları sokmadan önceden soğutulmuş 1 mm boşluklu elektroporasyon küvetine dikkatlice pipetin.
    3. Aşağıdaki ayarları kullanarak elektroporat: 1800 V, 600 Ω ve 10 μF. Elektroporasyon darbesinin 10 s içinde, küvete 970 μL önceden ısıtılmış geri kazanım ortamı (elektrokompetan hücrelerle birlikte verilir) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Son olarak, hücreleri bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 250 rpm'de 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. İstenilen çeşitliliği elde etmek için 10-100 reaksiyon gerçekleştirin ve inkübasyondan sonra tüm reaksiyonları tek bir tüpte toplayın.
    4. PBS'de 10-, 100- veya 1.000-kat havuzlanmış dönüşümlerin 10 μL'sini seyrelterek çeşitliliği hesaplayın ve uygun antibiyotiği (75 mg / mL ampisilin) içeren besin agar plakalarına 100 μL yayın. Agar plakalarını gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve ardından agar plakalarındaki kolonileri sayın.
    5. Teorik çeşitliliği aşağıdaki gibi hesaplayın:
      Teorik maksimum çeşitlilik = 10 x seyreltme faktörü x koloni sayısı x elektroporasyon reaksiyonlarının sayısı.
      NOT: Kütüphane kalitesini onaylamak için, Sanger dizilimi ile en az 20 koloni sıralayın. Çoğu klon bir ek parça içermeli ve hepsi benzersiz olmalıdır.
    6. Uygun antibiyotik içeren 400-1.000 mL LB ortamını havuzlanmış dönüşümlerin geri kalanıyla aşılayın ve gece boyunca 37 ° C, 180 rpm'de inkübe edin.
  6. Plazmid kütüphanesinin hazırlanması
    1. Gece kültüründen, bir gliserol stoğu hazırlayın (nükleaz içermeyen suda eşit miktarda bakteri kültürü ve% 50 gliserol çözeltisini karıştırın ve -80 ° C'de dondurun) ve plazmid kütüphanesini bir plazmid maxi kiti kullanarak saflaştırın.
  7. AAV viral kütüphanesinin üretimi
    1. Viral kütüphaneyi daha önce açıklandığı gibi hazırlayın27. Plazmid kütüphanesini (pRep2Cap2_PI, peptid ekini) bir adeno-yardımcı plazmid ile birlikte polietilenimin (PEI) gibi bir transfeksiyon reaktifi kullanarak HEK293T hücrelerine transfekte edin.
    2. Hücreleri 3 gün sonra toplayın ve üç döngü donma-çözme işlemine maruz bırakın. Sezyum klorür gradyanı ultrasantrifüjleme kullanarak viral lizatı saflaştırın, ardından PBS'ye tampon değişimi yapın ve son olarak viral parçacıkları konsantre edin.
  8. dd-PCR kullanarak AAV vektör titrasyonu
    1. 1:106 nihai seyreltme elde etmek için AAV vektör stoğunun 2 μL'sini 198 μL nükleaz içermeyen suda seri olarak seyreltin. Her seferinde 200 μL pipet kullanarak iyice karıştırın. Negatif denetim olarak bir şablonsuz denetim (NTC) ekleyin.
      NOT: Ek düşük veya daha yüksek seyreltmeler test edilebilir (1:105-1:107).
    2. 20x astar-prob karışımı hazırlayın. 100 μM primerlerin her birinden 3,6 μL (ileri ve geri, Rep2 ve ITR), 100 μM dd-PCR problarının (Rep2 ve ITR) her birinden 1 μL ve 1,5 mL santrifüj tüpüne 3,6 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
      NOT: AAV kütüphanesi, FAM etiketli bir prob ile algılanan transgen hedefli bir primer-prob seti (Rep2) ve HEX etiketli bir prob ile algılanan ITR hedefli bir primer-prob seti kullanılarak ölçülür.
    3. 5,5 μL numune, 1,1 μL 20x astar-prob karışımı, problar için 11 μL dd-PCR süper karışımı (dUTP yok) ve 4,4 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek 22 μL'lik bir PCR reaksiyonu hazırlayın. Bu, primerler ve prob için sırasıyla 900 nM ve 250 nM konsantrasyonları verir.
    4. Bir damlacık jeneratörü kullanarak damlacıkları oluşturun, reaksiyonu 96 delikli bir plakaya aktarın, plakayı bir termosikletçiye yerleştirin ve 94 ° C'de 10 dakika boyunca bir denatürasyon adımı uygulayın, ardından 94 ° C'de 30 s'lik 40 döngü ve 58 ° C'de 1 dakika çalıştırın. Daha sonra, polimerazı 98 ° C'de 10 dakika boyunca ısıl olarak etkisiz hale getirin ve son bir soğutma adımı ekleyin. Bir damlacık okuyucudaki reaksiyonları okuyun ve analize geçin28.
    5. Analiz yazılımını kullanarak kaydedilen dd-PCR plaka dosyasını açın. NTC'yi kılavuz olarak kullanarak her kanalın negatif ve pozitif damlacıklarını ayırmak ve verileri bir csv dosyasına dışa aktarmak için 1B Genlik sekmesindeki eşik aracını (floresan genliği ve olay numarası) kullanın.
    6. Vektör konsantrasyonunu hesaplamak için, önce aşağıdaki formülü kullanarak düzeltme faktörü CF'yi hesaplayın:
      figure-protocol-1
      CF, fonksiyonel vektör parçacıklarının tespitini sağlamak için hem transgen hem de ITR [Ch1 + Ch2 +] için pozitif olan transgen [Pozitifler] için pozitif olan damlacıkların oranını belirler. Son vektör konsantrasyonu c artık aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir:
      figure-protocol-2
      DF seyreltme faktörüdür (daha önce belirlendiği gibi 1:10,5-1:10,7 ). 20 μL/kuyu reaksiyonu başına kopyalar, seyreltilmiş numunenin 5 μL'sine karşılık gelir. Faktör 1.000, ölçeği VG / mL'ye (viral genom / mL) düzeltir. Örnek bir titrasyon sonucu Tablo 1 ve Şekil 3'te gösterilmiştir.
  9. AAV viral kütüphanesinin NGS ile analizi
    1. 96-nükleotid peptid yerleştirme fragmanını, bir prova okuma polimeraz kiti kullanarak 20 μL'lik bir PCR reaksiyonu kurarak güçlendirin (2x; bkz. Şekil 4). Reaksiyona 1 x 108 vg içeren 1 μL AAV stoğu, 100 μM astarın her birinin 0,5 μL (NGS_forward ve NGS_reverse) ve 10 μL enzim karışımı ekleyin. Son ses seviyesini nükleaz içermeyen su ile 20 μL'ye ayarlayın.
    2. Reaksiyonu bir termosiklerle aktarın ve 98 ° C'de 3 dakika boyunca bir denatürasyon adımı, ardından 98 ° C'de 10 s'lik 30-35 döngü, 59 ° C'de 10 s ve 72 ° C'de 20 s, ardından 72 ° C'de 5 dakika ve son bir soğutma adımı çalıştırın.
    3. Bir PCR saflaştırma kiti kullanarak numuneleri saflaştırın. Bir spektrofotometredeki konsantrasyonu ölçün ve saflığı ve parça boyutunu doğrulamak için% 3'lük bir agaroz jeli çalıştırın.
    4. PCR parçalarını, düşük karmaşıklıktaki numune kiti için kütüphane sistemini kullanarak, üreticinin bir NGS kütüphanesinin hazırlanmasına ilişkin talimatlarına göre işleyin. Son onarım reaksiyonunu 30 ng PCR fragmanı ile gerçekleştirin, ardından 10 döngü boyunca adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu yapın. Reaksiyonların saflaştırılması için PCR saflaştırma kitini kullanın.
    5. Üreticinin talimatlarına göre bir DNA reaktifleri kiti kullanarak boyut ve saflığı doğrulamak için nihai ürünleri bir Biyoanalizörde işleyin.
    6. Bir florometre kullanarak amplikonları sayısallaştırın ve bir araya getirin. Son havuzlanmış NGS kütüphanesini bir florometre üzerinde tekrar ölçün (üreticinin talimatlarına göre) ve bir Biyoanalizörde kaliteyi doğrulayın.
    7. NGS kitaplıklarını, okuma uzunluğu 84 ve dizin 1'i 8 olan 75 döngülü yüksek çıkış kiti kullanarak tek uçlu (SE) modda sıralayın.
      NOT: Bu makaledeki örneklerin sıralanması EMBL Heidelberg'in (http://www.genecore.embl.de/) GeneCore tesisinde gerçekleştirilmiştir.
    8. NGS sıralama verilerini Python 3 ve biopython ile analiz edin. Dosyalar https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022'de bulunabilir (alternatif olarak https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215'de). NGS analizi iki adımdan oluşmaktadır.
      1. İlk adımda, dizi dosyalarında belirli ölçütleri karşılayan diziler için arama yapın (ekleme bölgesini çevreleyen tanıma dizilerinin varlığı) (bkz. Şekil 4, adım 1.9.8.5.). Bu, bir komut dosyası (Komut Dosyası # 1) ve gerekli bilgileri sağlayan bir yapılandırma dosyası kullanılarak yapılır. Doğru sıra belirlendikten sonra, program sırayı ayıklar ve sıralama dosyasıyla aynı ada sahip bir txt dosyası olan çıktı dosyasında saklar.
      2. İkinci adım, çıktı dosyalarının analizidir. Kütüphanedeki diziler, dokuz amino asit ekindeki altı nükleotitten (AGWggc, W = A / T) herhangi biriyle başlar. Bu başlangıç sırasına dayanarak, peptid çevrilir. Bu, peptit varyantlarını (PV'ler) içeren çıktı dosyalarını oluşturur.
      3. İki klasör hazırlayın: Komut Dosyası ve Veri. Veri klasörüne, sıralamadan kaynaklanan gzip ile sıkıştırılmış dosyaları kopyalayın. Komut Dosyası klasörüne aşağıdaki dosyaları kopyalayın, Python dosyası: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python dosyası: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Yapılandırma dosyası: Barcode_Script_JoVE.conf; ve Arama tablosu (LUT) dosyası: Zuordnung.txt.
      4. Komut dosyalarını çalıştırmadan önce, Komut Dosyası klasöründe aşağıdaki dosyaları düzenleyin. "Zuordnung.txt" dosyasını açın ve sekmeyle ayrılmış iki sütuna, gzip dosyalarının adlarını (sütun 1) ve istediğiniz son adı (sütun 2; sekmeyle ayrılmış değerler) ekleyin.
        NOT: Örnek txt dosyaları GitHub "PV_analysis_script" klasöründe bulunur. GitHub klasöründe sağlanan dosyalar, yukarıdaki kitaplıktan üç örnek verinin analizi için hazırlanır: xaa.txt.gz, xab.txt.gz ve xac.txt.gz. Çıktı dosyaları da sağlanır.
      5. "Barcode_Script_JoVE.conf" yapılandırma dosyasında aşağıdaki değişkenleri değiştirin:
        my_dir = "~/Veri/"
        filename_sample_file = "~/script/Zuordnung.txt"
        Diziye özgü değişkenler: BCV_size = 27, BCVsol = TCCAGGGCCAG, BCVsağ = GCCCAGG, BCVloc = 30, BCVmarjı = 8, BCVleft_revcomp = GCCGCCTGGGC, BCVright_revcomp = CTGGCCC ve BCVloc_revcomp = 41 (ayrıntılar için Şekil 4'e bakın).
      6. Varyant dizisi algılama ve ayıklamayı çağırmak için aşağıdaki komutu kullanın:
        >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
        NOT: Çıktı, çıkarılan DNA dizilerini ve okunma sayılarını içeren txt dosyalarıdır. Bu dosyanın başlığı istatistiksel veriler içerir (yani, toplam okuma sayısı ve ayıklanan okumalar). Bu veriler sonraki dosyalara aktarılır. Bu txt verileri, DNA dizilerinin çevrildiği, sıralandığı ve analiz edildiği Script # 2 için giriş dosyalarıdır.
      7. Aşağıdaki komutu kullanarak PV çıkarma ve analiz gerçekleştirin:
        >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Komut Dosyası # 2'nin metin çıktı dosyalarını analiz edin. Komut Dosyası # 2'nin çıktı dosyaları, analiz türüne bağlı uzantılarla "Zuordnung.txt" içindeki LUT'un ikinci sütunu kullanılarak adlandırılır.
        NOT: Üç çıktı dosyasının ilk satırlarda istatistiksel veriler içerdiğinden emin olun ("# of Valid PV reads", "# of Invalid PV reads" ve "# of unique PV reads"), giriş txt dosyalarından her DNA dizisinin dizinini içeren bir ilk sütun (Script#1 çıktısı) ve aşağıdaki sütunlar: (1) "... analyzed_all.csv": "Örnek:" (DNA dizisi), "#" (okuma sayısı), "Frw veya Rev" (ileri veya geri okuma) ve "PV'ler" (çevrilmiş peptid dizisi). Geçersiz dizilerin son iki sütununda "NA" ve "geçerli değil" ifadeleri bulunur. (2) "... analyzed_validSeq.csv": önceki dosyayla aynı, geçerli diziler için filtrelenmiş. (3) "... analyzed_PV.csv": "PV'ler" (çevrilmiş peptid dizisi), "#" (okuma sayısı) ve "sayım" (önceki dosyalardaki frw ve devir sayıları birleştirilir ve sayıma 1 veya 2 verilir).
      9. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre mevcut yazılımları kullanarak çıktı dosyalarını görselleştirin.

2. AAV2 rastgele 7-mer peptit ekran kütüphanesi seçimi

  1. İstenilen özelliklere sahip adayları yinelemeli olarak seçmek üzere tercih edilen bir modelde yönlendirilmiş evrim için niceleme ve kalite kontrolünden sonra AAV kitaplığını kullanın (Bölüm 1) (Bkz. Şekil 5)16,18,21.
    NOT: Bu adaylar daha sonra aşağıda bölüm 3'te açıklandığı gibi barkodlu bir kütüphanenin oluşturulması için kullanılır.

3. Barkodlu AAV kapsid kütüphanesi hazırlama ve analizi

NOT: Peptid görüntüleme ekranında potansiyel olarak spesifik ve etkili AAV kapsidleri kümesinin tanımlanmasını takiben, tanımlanan peptid dizilerinin işlevselliğini doğrulayın ve bunları yaygın olarak kullanılan veya iyi tanımlanmış referans AAV kapsid varyantları kümesiyle karşılaştırın. Bunu yapmak için, kapsid sırası ITR'ler olmadan bir Rep/Cap yardımcı yapısına eklenir.

  1. Barkodlu AAV kütüphanesi üretimi
    1. Daha önce tarif edildiği gibi üç plazmid sistemini kullanarak her kapsid varyantı için rekombinant AAV üretimigerçekleştirin 24.
      NOT: Farklı kapsid varyantlarını ayırt etmek için, ITR yanlı muhabir transgen plazmid, 15 nükleotid uzunluğunda benzersiz bir barkod barındırır. Barkod, geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile poliA sinyali arasındaki 3' UTR'de (çevrilmemiş bölge) bulunur (bkz. Şekil 6A). EYFP ekspresyonu, yeterli düzeyde RNA transkriptleri sağlayan güçlü bir ubiquitous sitomegalovirüs (CMV) promotörü tarafından yönlendirilir.
    2. 15 nükleotid uzunluğundaki barkodları, üçten az nükleotidden daha az homopolimerler, GC içeriği 29 ve dört nükleotitten daha büyük bir Hamming mesafesi24 ile tasarlayın.
    3. Her kapsidi benzersiz bir barkod taşıyan bir transgen plazmid ile birlikte ayrı ayrı üretin. Bu şekilde, her kapsid varyantı, kendine özgü izlemeyi sağlayan ayrı bir barkodla etiketlenir (bkz. Şekil 6B).
  2. dd-PCR kullanarak AAV vektör titrasyonu
    1. AAV titrasyonunu daha önce bölüm 1.8'de açıklandığı gibi, Rep2 astar çiftini YFP astar çifti ile değiştirerek gerçekleştirin.
    2. Tek tek AAV üretimlerini ölçün ve nihai barkodlu kütüphaneyi oluşturmak için her üretimin eşit miktarlarını bir araya getirin.
    3. Son konsantrasyonu ve kaliteyi kontrol etmek için son kütüphaneyi tekrar ölçün (bkz. Şekil 7).
  3. Barkodlu AAV kütüphanesi in vivo uygulama
    1. Barkodlu AAV kütüphanesini sistematik olarak tercih edilen model sistemine uygulayın (örneğin farelerde sistematik olarak24).
    2. Deneye dayanarak ON- ve OFF-hedef dokuları (yani, karaciğer, akciğer, kalp, diyafram, düz kas, duodenum, pankreas, kolon, biseps, yumurtalıklar, mide, iç kulak, böbrek, abdominal aort, torasik aort, beyin, kahverengi ve beyaz yağ ve dalak) veya hücre tiplerini toplayın. Bunları -80 ° C'de dondurun, DNA / RNA'yı çıkarın ve bir sonraki bölümde açıklandığı gibi NGS kantitasyon analizi uygulayın.
  4. DNA/RNA ekstraksiyonu
    1. DNA / RNA Mini Kitini kullanarak DNA ve RNA'yı ilgili dokulardan çıkarın.
    2. İlgilenilen dokunun küçük bir parçasını (1 mm3, yaklaşık 5 mg) 2 mL'lik bir reaksiyon tüpüne yerleştirin.
    3. Dokuya β-merkaptoetanol (% 1) ve 5 mm çelik boncuklarla karıştırılmış 350 μL lizis tamponu ekleyin (duman başlığı altında β-merkaptoetanol içeren numuneleri işleyin).
    4. Bir dokudaki dokuyu homojenize edinLyser 40 Hz'de 45 sn boyunca.
    5. 10 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve 400 rpm'de çalkalarken 55 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
    6. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin, süpernatanı toplayın ve üreticinin DNA / RNA Kiti protokolüne devam edin.
    7. Her adımda 350 μL yıkama tamponu ile yıkama adımını iki adıma bölün. Bu yıkama adımları arasında, kolon üzerindeki kalan DNA'yı RNase içermeyen DNase I ile sindirin. üreticinin talimatına göre hazırlanan DNase I çözeltisinin 80 μL'sini kolona ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    8. RNA / DNA'yı nükleaz içermeyen su ile kolondan çıkarın. İzole RNA'yı -80 ° C'de ve gDNA'yı -20 ° C'de saklayın.
  5. cDNA sentezi
    1. RNA örneklerini, ters transkripsiyon reaksiyonundan önce 15-30 dakikalık başka bir DNaz I tedavisine (RNA örneklerinden kirletici DNA'nın tamamen çıkarılması için) maruz bırakın. DNaz I çözeltisinden 1 μL, 4 μL tampon (kit ile birlikte verilir) ve nükleaz içermeyen suyu, 40 μL ila 212 ng RNA'nın son hacmine ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısıyı etkisiz hale getirin.
    2. Üreticinin talimatlarına göre bir kit kullanarak 150 ng RNA kullanarak cDNA'yı sentezleyin. Numuneden kontamine edici viral DNA'nın bulunmadığından emin olmak için ters transkriptaz içermeyen kontrolleri dahil edin. cDNA -20 °C'de saklanır.
      NOT: Optimal ters transkripsiyon için giriş RNA miktarı, doku tipine ve ilgili dokuda beklenen transdüksiyon verimliliğine bağlı olarak değişebilir.
  6. AAV viral kütüphanesinin analizi (in-vivo) tarafından NGS
    1. Düşük maliyetle yüksek sıralama derinliği elde etmek için, daha önce açıklandığı gibi Illumina dizilemesi yoluyla NGS gerçekleştirin (bölüm 1.9). Barkod dizisini yükseltin ve ardından sıralama adaptörlerini amplikona bağlayın.
    2. Kısa okuma uzunluğu ve amplikonunun her iki tarafındaki sıralama adaptörlerinin bağlanması nedeniyle, tasarım yaparken, amplikonun NGS okunması içindeki barkod dizisinin varlığını sağlamak için yeterince küçük olup olmadığını kontrol edin. Viral genomlar ve viral transkriptler içindeki barkodların dizilimi için, PCR amplikonu 113 bp uzunluğunda olacak şekilde tasarlanmıştır (bkz. Şekil 8).
    3. BC-seq ileri ve BC-seq geri astarları ile barkodlu bölgeyi yükseltin. Aşağıdaki PCR reaksiyonunu hazırlayın: 0,5 μL Hi-fidelity DNA polimeraz, 10 μL 5x tampon, her 100 μM primerin 0,25 μL'si (BC-seq fw / BC-seq rv) ve 1 μl 10 mM dNTP'ler. Şablon olarak 25 ng cDNA veya DNA / reaksiyon kullanın ve son hacmi nükleaz içermeyen su ile 50 μL'ye ayarlayın.
    4. Kontaminasyonu önlemek için PCR ana karışımını temiz bir PCR başlığı altında hazırlayın. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanın: 98 °C'de 30 s, ardından 10 s için 98 °C'de 40 döngü ve 20 sn için 72 °C ve 72 °C'de son 5 dakikalık adım.
    5. PCR ana karışımında kirletici DNA bulunmadığını doğrulamak için PCR kontrollerini dahil edin. cDNA örnekleri için, ters transkriptaz içermeyen kontrolleri dahil edin. Son olarak, AAV giriş kitaplığına bir örnek ekleyin. Bu bilgiler, analizde kullanılan Normalization_Variant.txt dosyasını oluşturmak için kullanılacaktır.
    6. PCR saflaştırmadan önce jel elektroforezi ile her numunenin PCR parçasının boyutunu doğrulayın. İkincisi, ticari olarak temin edilebilen manyetik boncuklar veya sütun bazlı DNA saflaştırma sistemleri kullanılarak elde edilir (bakınız Malzeme Tablosu).
    7. NGS kitaplığını, daha önce bölüm 1.9'da açıklandığı gibi, düşük karmaşıklıktaki numuneler için kütüphane sistemini kullanarak üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
    8. DNA HS Kiti ile DNA konsantrasyonunu belirleyin ve daha önce açıklandığı gibi kütüphanenin kalitesini analiz edin (bölüm 1.9.6), ardından havuzlama. Bir florometre üzerinde havuzlanmış kütüphaneyi ölçün ve bir Biyoanalizörde kaliteyi değerlendirin.
    9. NGS sıralamasını bölüm 1.9.7'de açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    10. Havuzlanmış kütüphanenin DNA üzerindeki dokular veya organlar arasındaki dağılımını değerlendirmek için transgenin (viral genomlar) ve temizlik geninin kopya sayısını qPCR ile sayısallaştırın.
    11. EYFP (transgen) ve GAPDH'nin (gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz, temizlik geni) kopya sayısını belirlemek için aşağıdaki gibi bir 30 μL qPCR reaksiyonu ayarlayın:
      1. EYFP için 60x astar/prob karışımı hazırlayın (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv ve 0,6 μM YFP_probe; bkz. Temizlikçi geninin kopya sayısını belirlemek için GAPDH astar / prob karışımını kullanın (bkz. Buz üzerinde reaksiyonu ayarlayın.
      2. Bir PCR ana karışımı hazırlayın (15 μL, Malzeme Tablosuna bakın) ve tüm numuneler ve standartlar için 60x astar/prob karışımı (0,5 μL) ekleyin (standartların kopya sayılarını hesaplamak için aşağıdaki bağlantıyı kullanın: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Buz üzerinde reaksiyonu ayarlayın.
      3. Ana karışımın 15,5 μL'sini 96 delikli bir plakaya aktarın ve ilgili kuyucuğa 14,5 μL numune (toplam DNA konsantrasyonunun 75 ng'si) veya standardı ekleyin. 96 delikli plakayı folyo, vorteks ile kapatın ve kısaca döndürün.
      4. Her numunenin 10 μL'sini kopyalar halinde 384 delikli bir plakaya aktarın. Plakayı folyo ile kapatın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de döndürün.
      5. Reaksiyon karışımını 2 dakika boyunca 50 ° C'lik bir başlangıç sıcaklığı kullanarak bir termosiklerde inkübe edin, ardından 95 ° C'de 10 dakikalık bir başlangıç aktivasyon adımı izleyin. 15 s için 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon ve 1 dakika24 için 60 ° C'de tavlama / uzatma gerçekleştirin.
      6. Diploid genomların (dg) sayısını elde etmek için, GAPDH kopya numarasını kullanın ve ikiye bölün. Ardından, EYFP kopya numarasının değerini alın ve dg sayısına bölün, bu da diploid genom başına vektör genomları (vg / dg) ile sonuçlanır. Biyoinformatik analiz için Normalization_Organ.txt dosyasını oluşturmak üzere bu değeri kullanın.
    12. Weinmann ve ark. gibi NGS dizileme verilerinin analizini gerçekleştirin.24, Python3'te özel kod kullanarak (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). İş akışı, yan diziler tarafından yönlendirilen barkod dizilerinin, uzunluklarının ve konumlarının (Script#1_BarcodeDetection.py) algılanmasının yanı sıra barkod zenginleştirme ve doku kümesi üzerindeki dağılımının analizini (Script#2_BarcodeAnalysis.py) içerir.
      1. Barkodu algılayın ve bunları AAV varyantlarına atayın. Sıralama verilerini arşivlenmiş fastq dosyaları olarak tek bir dizine yerleştirin (örneğin, "Data_to_analyze"). Giriş kitaplığının sıralama veri dosyası bu dizine eklenir ve yalnızca giriş kitaplığındaki kapsid oranlarını hesaplamak için kullanılır.
      2. Komut dosyasını çalıştırmadan önce, sekmeyle ayrılmış iki metin dosyası oluşturun: AAV kapsid varyant adlarına atanan barkod dizilerini içeren kapsid varyantları dosyası ("Varyantlar.txt örnek dosyasına bakın) ve olası kontaminasyondan kaynaklanan barkod dizilerine sahip kontaminasyon dosyası (bkz. "Kontaminasyonlar.txt) (laboratuvarda bulunan ve kontaminasyona katkıda bulunan diğer barkodlar).
      3. Son olarak, "Barcode_Script.conf" yapılandırma dosyasını aşağıdaki bilgileri içerecek şekilde düzenleyin: sıralama verilerini içeren klasörün yolu (örneğin, "Data_to_analyze"), barkodların yan bölgelerinin sırası, konumları ve barkod algılama için pencere boyutu (1.9.8.5'e benzer, bkz. Şekil 8).
      4. Komut Dosyası # 1_BarcodeDetection.py ve yapılandırma dosyalarına sağlanan yollarla barkod algılamayı çağırmak için aşağıdaki komutu kullanın:
        >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
        NOT: Komut Dosyası#1_BarcodeDetection.py yürütmesinin çıktısı, kapsid değişkeni başına okuma sayılarının yanı sıra ham verilerden kurtarılan toplam okuma sayısına sahip metin dosyalarıdır.
      5. Barkodlu AAV kapsidlerinin dokular veya organlar arasındaki dağılımını, aşağıdaki txt dosyalarıyla birlikte Script#2_BarcodeAnalysis.py yürüterek değerlendirin:
        1. "Zuordnung.txt" dosyasında, barkod algılama çalıştırmasından elde edilen her txt dosyasına bir doku/organ adı atayın: ilk sütundaki txt dosyalarının adları ve sekmeyle ayrılmış atamada karşılık gelen doku/organ adları.
          NOT: Bir örnek için, "Örnek" klasörünü (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022) iade edin. Not olarak, doku / organ adı cDNA veya gDNA ölçümünü ve biyolojik replika sayısını (M1, M2, vb.) tanımlayan karakterleri içerebilir.
        2. "Zuordnung.txt" dosyasında verilen adlara karşılık gelen ON- ve OFF-target organlarının adlarının listesini içeren bir "organlar.txt" metin dosyası oluşturun (bkz. "Örnek" klasör: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
        3. Tüm kapsid varyantları ve tüm organlar/dokular için normalleştirilmiş değerlere sahip "Normalization_Organ.txt" ve "Normalization_Variant.txt" sekmeyle ayrılmış metin dosyaları oluşturun. "Normalization_Organ.txt" dosyasının ilk sütununda, her organ için verilen isimleri ("Zuordnung.txt atama dosyasında olduğu gibi) ve ikinci sütunda, bölüm 3.6.11'de oluşturulan ilgili dokular için normalleştirme değerlerini yazın.
        4. "Normalization_Variant.txt" dosyasının ilk sütununu kapsid adları listesiyle, ikinci sütununu ise havuza alınmış kitaplıktaki her kapsid için okuma sayılarının normalleştirilmiş değerleriyle doldurun (normalleştirme, ilk komut dosyasından kaynaklanan giriş kitaplığı için txt çıktı dosyasına göre hesaplanabilir).
        5. Yukarıda belirtilen tüm ek dosyaların tam yollarını belirterek yapılandırma dosyasını düzenleyin. Komut Dosyası#2_BarcodeAnalysis.py şu şekilde yürütün:
          >python3 /script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
          NOT: Barkod analizi komut dosyası birkaç dosyanın çıktısını verir: daha önce açıklanan çoklu normalleştirme adımlarına dayalı olarak farklı dokulardaki kapsid dağılımının göreceli konsantrasyon (RC) değerlerine sahip metin dosyaları ve metin dosyası verilerini birleştirilmiş matris verilerinde birleştiren elektronik tablo dosyası. İkincisi, küme analizi ve görselleştirme için kullanılabilir.
        6. Kapsid özelliklerini ayırt etmek ve dokular arasındaki RC profillerine dayanarak benzerliklerini değerlendirmek için verileri görselleştirin ve matris verilerinin küme analizini yapın. Ek komut dosyası PCA_heatmap_plot kullanın. Depoya yerleştirilen R:
          >Rscript --vanilya ~/PCA. R ~/göreli konsantrasyon.xls
          NOT: Komut dosyası, göreli konsantrasyon .xls dosyalarını girdi olarak alır ve hiyerarşik küme ısı haritası ve ana bileşen analizinin (PCA) iki grafiğini oluşturur.
        7. Grafikleri (ısı haritası eksenleri, PCA'nın ana bileşenleri) veya png parametrelerini (renk, boyut, etiketleme) değiştirmek için R betiğini açın ve yorum yapılan bölümlerde sağlanan talimatları izleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAV2 peptit görüntüleme kitaplığının oluşturulması. Mühendislik AAV'lerinin seçimine yönelik ilk adım olarak, bir plazmid kütüphanesinin oluşturulması açıklanmaktadır. Peptit kesici ucu, dejenere primerler kullanılarak üretilir. 64'ten 20'ye kadar olanlardaki kodonların kombinasyonunu azaltmak, DNA üzerindeki kütüphane çeşitliliğini azaltarak ancak protein seviyesini azaltmayarak durdurma kodonları ortadan kaldırma ve NGS analizini kolaylaştırma avantajlarına sahiptir. Oligonükleotid eki, bir PCR reaksi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, peptid gösterimi AAV kapsid mühendisliği ve barkodlu AAV kütüphane taramasının yanı sıra kütüphane kompozisyonunun ve kapsid performansının biyoinformatik analizi için gerekli adımlar özetlenmiştir. Bu protokol, bu tür kütüphanelerin biyoinformatik analizini kolaylaştıran adımlara odaklanmaktadır, çünkü çoğu viroloji laboratuvarı, moleküler biyoloji tekniklerindeki yeterliliklerine uyacak şekilde programlama becerilerinde gecikmektedir. Her iki kütüphane türü de girişte belirtildiği gibi literatürde kapsam...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.G., AaviGen GmbH'nin kurucu ortaklarından biridir. D.G. ve K.R., bağışıklıktan kaçan AAV kapsid varyantlarının üretilmesiyle ilgili bekleyen bir patent başvurusunda mucitlerdir. Yazarların geri kalanının açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.G., DFG İşbirlikçi Araştırma Merkezleri SFB1129 (Projektnummer 240245660) ve TRR179 (Projektnummer 272983813) aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG) ve Alman Enfeksiyon Araştırma Merkezi'nin (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amplifikasyon primeriELLA Biotech (Münih, Almanya)-Oligonükleotid ekinin ikinci iplikli sentezi
Agilent DNA 1000 ReaktifleriAgilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)5067-1504DNA fragmanı doğrulaması
Agilent 2100 Biyoanalizör SistemiAgilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)G2938CDNA fragmanı doğrulaması
AllPrep DNA/RNA Mini Takımı Qiagen (Venlo, Hollanda)80204DNA/RNA ekstraksiyonu
Agilent DNA 1000 ReaktifleriAgilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)5067-1504NGS Kütüphanesi hazırlığı
Agilent 2100 Biyoanalizör SistemiAgilent Technologies (Santa Clara, CA, ABD)G2938CNGS Kütüphanesi hazırlığı
BC-seq fw: IDT (San Joce, CA, CA, ABD)ATCACTCTCGGCATGGACGAGC NGS Kütüphanesi hazırlığı
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, ABD)ggctggcaactagaaggcaca NGS Kütüphanesi hazırlığı
β-MerkaptoetanolMillipore Sigma (Burlington, MA, ABD)44-420-3250MLDNA/RNA ekstraksiyonu
BglINew England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)R0143Çift sarmallı kesici uç
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad'ın sindirimi (Hercules, CA, ABD)1851196dd-PCR döngüleyici
dNTPS New England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)N0447SNGS Kütüphanesi hazırlığı
Problar için ddPCR Supermix (dUTP yok)Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)1863024dd-PCR süpermiks
Problar için Damlacık Oluşturma YağıBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1863005dd-PCR damlacık üretim yağı
QX100 / QX200 Damlacık Jeneratörü Bio-Rad için DG8 Kartuşları(Hercules, CA, ABD)1864008dd-PCR damlacık oluşturma kartuşu
DG8 Kartuş TutucuBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1863051dd-PCR kartuş tutucu
Damlacık Jeneratörü DG8 ContaBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1863009kartuş için dd-PCR kapağı
ddPCR Plakaları 96 Kuyulu, Yarı Etekli Bio-Rad(Hercules, CA, ABD)12001925dd-PCR 96 kuyulu plaka
E.cloni 10G SUPREME Elektroyetkin HücrelerLucigen (Middleton, WI, ABD)60081-1Elektroyetkin hücreler
Elektroporasyon küvetleri, 1mmBiozym Scientific (Oldendorf, Almanya)748050Elektroporasyon
GAPDH astar/prob karışımıThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)Mm00186825_cnTaqman qPCR primer
Genepulser XcellBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1652660Elektroporasyon
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiUygulamalı Biyosistemler (Waltham, MA, ABD)4368814cDNA ters transkripsiyon
ITR_fwIDT (San Joce, CA, ABD)GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)dd-PCR primer
ITR_rvIDT (San Joce, CA, ABD)CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)dd-PCR primer
ITR_probeIDT (San Joce, CA, ABD)HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)dd-PCR probu
Illumina NextSeq 500 sistemiIllumina Inc (San Diego, CA, ABD)SY-415-1001NGS Kütüphanesi Sıralama
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*Roche AG (Basel, İsviçre)KK2600 07958919001NGS numune hazırlama
MagnaBot 96 Manyetik Ayırma CihazıPromega GmbH (Madison, WI, ABD)V8151NGS kütüphanesi için numune hazırlama
NanoDrop 2000 spektrofotometreThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)ND-2000Çift sarmallı kesici ucun sindirimi
NGS_frwSigma-Aldrich (Burlinght, MA, ABD)GTT CTG TAT CTA CCA ACC TCNGS astarı
NGS_revSigma-Aldrich (Burlinght, MA, ABD)CGC CTT GTG TGT TGA CAT CNGS astarı
NextSeq 500/550 Yüksek Çıkış Kiti (75 döngü)Illumina Inc (San Diego, CA, ABD)FC-404-2005NGS Kitaplık sıralaması
Düşük Karmaşıklıklı Örnekler Kiti için Ovation Kitaplık Sistemi NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, ABD)9092-256NGS Kütüphane hazırlığı
PX1 Plaka Kapatıcı Bio-Rad (Hercules, CA, ABD)1814000dd-PCR plaka kapatıcı
Delinebilir Folyo Isı YalıtımıBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1814040dd-PCR sızdırmazlık folyosu
Phusion Yüksek Sadakatli DNA-PolimerazThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)F530SOligonükleotid ekinin ikinci iplikli sentezi
PEI MAX - Transfeksiyon Sınıfı Lineer Polietilamin Hidroklorür (MW 40.000)Polysciences, Inc. (Warrington, PA, ABD)24765-1GAAV kütüphane hazırlığı
ProNex Boyut Seçici Arıtma SistemiPromega GmbH (Madison, WI, ABD)NG2002NGS kütüphanesi için numune hazırlama
Phusion Hot Start II Polimeraz Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)F549LNGS Kütüphane hazırlığı
Proteinaz KRoche AG (Basel, İsviçre)5963117103DNA / RNA ekstraksiyonu
pRep2Cap2_PISITR-Rep2Cap2-ITR vektörü. Laboratuvarda üretilen/hazırlanan Cap2 ORF içindeki peptit yerleştirme bölgesi 
QX200 Damlacık JeneratörüBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1864002dd-PCR damlacık jeneratörü
QX200 Damlacık OkuyucuBio-Rad (Hercules, CA, ABD)1864003dd-PCR damlacık analizi
QIAquick Nükleotid Temizleme KitiQiagen (Venlo, Hollanda)28306Oligonükleotid uç saflaştırmasının ikinci iplikli sentezi
QIAquick Jel Ekstraksiyon KitiQiagen (Venlo, Hollanda)28704Plazmid vektör saflaştırması
QIAGEN Plazmid Maxi KitiQiagen (Venlo, Hollanda)12162Plazmit kütüphanesi DNA hazırlığı
Qiaquick PCR Saflaştırma kitiQiagen (Venlo, Hollanda)28104NGS kütüphanesi
Qubit florometreInvitrogen için numune hazırlama (Waltham, MA, ABD)Q32857NGS Kütüphane hazırlığı
Qubit dsDNA HSThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, ABD)Q32851NGS Kütüphane hazırlığı
QuantiFast PCR Master MixQiagen (Venlo, Hollanda)1044234Taqman qPCR
rep_fwIDT (San Joce, CA, ABD)AAGTCCTCGGCCCAGATAGACdd-PCR primer
rep_rvIDT (San Joce, CA, ABD)CAATCACGGCGCACATGTdd-PCR primer
rep_probeIDT (San Joce, CA, ABD)FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1dd-PCR probu
RNaz içermeyen DNazQiagen (Venlo, Hollanda)79254DNA/RNA ekstraksiyonu
SfiINew England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)R0123boncukların sindirimi
Qiagen (Venlo, Hollanda)69989DNA/RNA ekstraksiyonu
TRİMER-oligonükleotidlerELLA Biyoteknoloji (Münih, Almanya)-Dejenere oligonükleotid
T4 LigaseNew England Biolabs (Ipswich, MA, ABD)M0202LPlazmid kütüphane ligasyonu
TissueLyserLTQiagen (Venlo, Hollanda)85600DNA/RNA ekstraksiyonu
YFP_fwIDT (San Joce, CA, ABD)GAGCGCACCATCTTCTTCAAGdd-PCR primer
YFP_rvIDT (San Joce, CA, ABD)TGTCGCCCTCGAACTTCACdd-PCR primer
YFP_probeIDT (San Joce, CA, ABD)FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1dd-PCR probu
Zymo DNA Temiz & Konsantratör-5 (Kapaklı)Zymo araştırması (Irvine, CA, ABD)D4013Vektör ve Ligasyon saflaştırma
Vektör 5 mm, çelik

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene therapy. Molecular Therapy. 30 (4), 1364-1380 (2022).
  3. Li, C., Samulski, R. J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 255-272 (2020).
  4. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  5. Mullard, A. Gene therapy community grapples with toxicity issues, as pipeline matures. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (11), 804-805 (2021).
  6. Nature Biotechnology. Gene therapy at the crossroads. Nature Biotechnology. 40 (5), 621(2022).
  7. Becker, P., et al. Fantastic AAV Gene Therapy Vectors and How to Find Them-Random Diversification, Rational Design and Machine Learning. Pathogens. 11 (7), 756(2022).
  8. Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Molecular Therapy. 8 (1), 151-157 (2003).
  9. Muller, O. J., et al. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology. 21 (9), 1040-1046 (2003).
  10. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
  11. Sahel, J. A., et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nature Medicine. 27 (7), 1223-1229 (2021).
  12. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nature Communications. 5, 3075(2014).
  13. Marsic, D., Mendez-Gomez, H. R., Zolotukhin, S. High-accuracy biodistribution analysis of adeno-associated virus variants by double barcode sequencing. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2, 15041(2015).
  14. Korbelin, J., et al. Pulmonary targeting of adeno-associated viral vectors by next-generation sequencing-guided screening of random capsid displayed peptide libraries. Molecular Therapy. 24 (6), 1050-1061 (2016).
  15. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).
  16. Ravindra Kumar, S., et al. Multiplexed Cre-dependent selection yields systemic AAVs for targeting distinct brain cell types. Nature Methods. 17 (5), 541-550 (2020).
  17. Hanlon, K. S., et al. Selection of an efficient AAV vector for robust CNS transgene expression. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 15, 320-332 (2019).
  18. Nonnenmacher, M., et al. Rapid evolution of blood-brain-barrier-penetrating AAV capsids by RNA-driven biopanning. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 20, 366-378 (2021).
  19. Tabebordbar, M., et al. Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species. Cell. 184 (19), 4919-4938 (2021).
  20. Davidsson, M., et al. A systematic capsid evolution approach performed in vivo for the design of AAV vectors with tailored properties and tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (52), 27053-27062 (2019).
  21. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), (2019).
  22. Ogden, P. J., Kelsic, E. D., Sinai, S., Church, G. M. Comprehensive AAV capsid fitness landscape reveals a viral gene and enables machine-guided design. Science. 366 (6469), 1139-1143 (2019).
  23. Kondratov, O., et al. A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Molecular Therapy. 29 (9), 2806-2820 (2021).
  24. Weinmann, J., et al. Identification of a myotropic AAV by massively parallel in vivo evaluation of barcoded capsid variants. Nature Communications. 11 (1), 5432(2020).
  25. Kremer, L. P. M., et al. High throughput screening of novel AAV capsids identifies variants for transduction of adult NSCs within the subventricular zone. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 33-50 (2021).
  26. Borner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Molecular Therapy. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  27. Kienle, E., et al. Engineering and evolution of synthetic adeno-associated virus (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Journal of Visualized Experiments. (62), e3819(2012).
  28. Furuta-Hanawa, B., Yamaguchi, T., Uchida, E. Two-dimensional droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors. Human Gene Therapy Methods. 30 (4), 127-136 (2019).
  29. Lyons, E., Sheridan, P., Tremmel, G., Miyano, S., Sugano, S. Large-scale DNA barcode library generation for biomolecule identification in high-throughput screens. Scientific Reports. 7 (1), 13899(2017).
  30. Korbelin, J., et al. Optimization of design and production strategies for novel adeno-associated viral display peptide libraries. Gene Therapy. 24 (8), 470-481 (2017).
  31. Korbelin, J., Trepel, M. How to successfully screen random adeno-associated virus display peptide libraries in vivo. Human Gene Therapy Methods. 28 (3), 109-123 (2017).
  32. Herrmann, A. K., et al. A robust and all-inclusive pipeline for shuffling of adeno-associated viruses. American Chemical Society Synthetic Biology. 8 (1), 194-206 (2019).
  33. Choudhury, S. R., et al. In vivo selection yields AAV-B1 Capsid for central nervous system and muscle gene therapy. Molecular Therapy. 24 (7), 1247-1257 (2016).
  34. Buschmann, T., Bystrykh, L. V. Levenshtein error-correcting barcodes for multiplexed DNA sequencing. BMC Bioinformatics. 14, 272(2013).
  35. Buschmann, T. DNABarcodes: an R package for the systematic construction of DNA sample tags. Bioinformatics. 33 (6), 920-922 (2017).
  36. Li, B., et al. A comprehensive mouse transcriptomic BodyMap across 17 tissues by RNA-seq. Scientific Reports. 7 (1), 4200(2017).
  37. Clarner, P., et al. Development of a one-step RT-ddPCR method to determine the expression and potency of AAV vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 23, 68-77 (2021).
  38. Zolotukhin, S., Vandenberghe, L. H. AAV capsid design: A Goldilocks challenge. Trends in Molecular Medicine. 28 (3), 183-193 (2022).
  39. Brown, D., et al. deep parallel characterization of AAV tropism and AAV-mediated transcriptional changes via single-cell RNA sequencing. Frontiers in Immunology. 12, 730825(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AAV Capsid EngineeringGene Therapy VectorsBarcoded AAV VariantsPeptide Display LibraryIn Vivo ScreeningNext Generation SequencingBarcode AnalysisCapsid Variant StratificationTransduction EfficiencyHierarchical Clustering

İlgili makaleler