Yeni Nesil Gen Terapisi Vektörlerinin Mühendislik, Barkodlama ve Adeno-İlişkili Virüs (AAV) Kapsid Varyantlarının Taranması Yoluyla İzolasyonu

Gen transfer terapisi, hastalığı önlemek, tedavi etmek, iyileştirmek veya iyileştirmek için hücresel genetik materyali onarmak, değiştirmek veya değiştirmek için hücrelere genetik materyalin sokulmasıdır. Hem in vivo hem de ex vivo gen transferi, viral olmayan ve viral olan farklı dağıtım sistemlerine dayanır. Virüsler, hedef hücrelerini verimli bir şekilde dönüştürmek için doğal olarak evrimleşmiştir ve dağıtım vektörleri olarak kullanılabilir. Gen terapisinde kullanılan farklı viral vektör türleri arasında, adeno ilişkili virüsler, patojenite, güvenlik, düşük immünojenite eksikliği ve en önemlisi uzun vadeli, entegre olmayan ekspresyonu sürdürme yetenekleri nedeniyle giderek daha fazla kullanılmaktadır ^1,2,3. AAV gen tedavisi son on yılda önemli başarılar sağlamıştır; Avrupa İlaç Ajansı ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından insanlarda kullanılmak üzere üç tedavi onaylanmıştır ^3,4. Hemofili, kas, kalp ve nörolojik hastalıklar gibi çeşitli hastalıkların tedavisi için başka yerlerde gözden geçirildiği gibi çeşitli klinik çalışmalar da devam etmektedir³. On yıllardır süren ilerlemeye rağmen, gen terapisi alanı son yıllarda bir dizi aksilik yaşamıştır⁴, en önemlisi klinik çalışmalarda ölümler⁵, özellikle kas gibi büyük veya beyin gibi ulaşılması zor dokular için doz sınırlayıcı toksisiteler nedeniyle beklemeye alınmıştır⁶.

Şu anda klinik çalışmalarda kullanılmakta olan AAV vektörleri, birkaç istisna dışında doğal serotiplere aittir¹. AAV mühendisliği, üstün organ veya hücre özgüllüğü ve verimliliğine sahip vektörler geliştirme fırsatı sunar. Son yirmi yılda, peptid gösterimi, döngü değişimi, kapsid DNA karıştırma, hataya eğilimli PCR ve hedefli tasarım gibi çeşitli yaklaşımlar, farklı özelliklere sahip bireysel AAV varyantları veya kütüphaneleri oluşturmak için başarıyla uygulanmıştır⁷. Bunlar daha sonra, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, istenen özelliklere sahip varyantları seçmek için birden fazla yönlendirilmiş evrim turuna tabi tutulur ^1,3. Tüm kapsid evrim stratejileri arasında, peptid görüntüleme AAV kütüphaneleri, bazı benzersiz özelliklerden dolayı en yaygın kullanılanı olmuştur: üretilmeleri nispeten kolaydır ve evrimlerini takip etmelerini sağlayan yüksek çeşitlilik ve yüksek verimli dizileme elde edebilirler.

İlk başarılı peptit yerleştirme AAV kütüphaneleri yaklaşık 20 yıl önce tanımlanmıştır. İlklerinden birinde, Perabo ve ^ark.8 , rastgele üretilen oligonükleotidlerin bir havuzunun, VP1 kapsid proteininin amino-asit 587'sine karşılık gelen bir pozisyonda, kapsidden çıkıntı yapan üç katlı eksende bir plazmid içine yerleştirildiği modifiye AAV2 kapsidlerinden oluşan bir kütüphane oluşturmuştur. Adenovirüs ko-enfeksiyonu kullanılarak, AAV kütüphanesi çoklu seçim turları yoluyla geliştirildi ve son yeniden hedeflenen varyantların, ebeveyn AAV2^8'e dirençli hücre hatlarını dönüştürebildiği gösterildi. Bundan kısa bir süre sonra, Müller ve ^ark.9 , kütüphane üretimi için protokolde önemli bir gelişme olan iki aşamalı sistemi tanıttı. Başlangıçta, plazmid kütüphanesi, bir adenoviral yardımcı plazmid ile birlikte, kimerik kapsidler içeren bir AAV kütüphanesi üretmek için kullanılır. Bu AAV mekik kütüphanesi, hücre başına bir viral genom tanıtmak amacıyla, düşük enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Adenovirüs ile birlikte enfeksiyon, eşleşen bir genom ve kapsid⁹ ile AAV'lerin üretimini sağlar. Yaklaşık on yıl sonra, Dalkara¹⁰ , 7m8 varyantını oluşturmak için in vivo yönlendirilmiş evrimi kullandı. Bu varyant, üçü bağlayıcı görevi gören 10 amino asit yerleştirmesine (LALGETTRPA) sahiptir ve intravitreal enjeksiyon^10'dan sonra dış retinayı etkili bir şekilde hedefler. Bu mühendislik kapsid, olağanüstü bir başarı öyküsüdür, çünkü şimdiye kadar kliniğe ulaşan birkaç mühendislik kapsidinden biridir¹¹.

Alan, yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinin tanıtılmasıyla ikinci bir artış yaşadı. 2014 yılında Adachi ve ark.12'den ve 2015 yılında Marsic ve ^ark.13'ten iki yayın, barkodlu AAV kapsid kütüphanelerinin dağılımını yüksek doğrulukla izlemek için NGS'nin gücünü sergiledi. Birkaç yıl sonra, barkodlu bölgelerin NGS'si, kapsid evrimini takip etmek için peptit yerleştirme bölgesine uyarlandı. Körbelin ve ^ark.14, pulmoner hedefli AAV2 bazlı kapsid tanımlamak için NGS rehberliğinde bir tarama gerçekleştirdi. NGS analizi üç derecelendirme puanının hesaplanmasına yardımcı oldu: seçim turları arasındaki zenginleştirme puanı, doku özgüllüğünü belirlemek için genel özgüllük puanı ve son olarak birleşik puan¹⁴. Gradinaru laboratuvarı¹⁵, aynı yıl içinde hücre tipine özgü bir seçimi kolaylaştıran Cre-rekombinasyon tabanlı AAV hedefli evrim (CREATE) sistemini yayınladı. Bu sistemde, kapsid kütüphanesi Cre-ters çevrilebilir bir anahtar taşır, çünkü poliA sinyali iki loxP bölgesi tarafından çevrelenir. AAV kütüphanesi daha sonra Cre farelere enjekte edilir, burada poliA sinyali sadece Cre + hücrelerinde ters çevrilir ve kapsid geni içindeki ileri astar ile ters PCR primerinin bağlanması için şablon sağlar. Bu son derece spesifik PCR kurtarma, AAV-PHP'nin tanımlanmasını sağladı. Kan-beyin bariyerini geçebilen B varyantı¹⁵. Bu sistem ayrıca NGS ve sentetik kütüphane üretiminin boru hattı^16'ya entegre edildiği M-CREATE'e (Multiplexed-CREATE) dönüştürüldü.

Maguire lab^17'den bu sistemin geliştirilmiş bir RNA tabanlı versiyonu olan iTransduce, hücreleri işlevsel olarak dönüştüren ve genomlarını ifade eden kapsidlerin DNA seviyesinde seçime izin verir. Peptid görüntüleme kütüphanesinin viral genomu, her yerde bulunan bir promotörün kontrolü altındaki bir Cre genini ve p41 promotörünün kontrolü altındaki kapsid genini içerir. Kütüphane, tdTomato'nun yukarı akımında bir loxP-STOP-loxP kasetine sahip farelere enjekte edilir. Viral genomu ve dolayısıyla Cre'yi eksprese eden AAV varyantları ile transdübe edilen hücreler tdTomato'yu eksprese eder ve hücre belirteçleri ile kombinasyon halinde sıralanabilir ve seçilebilir¹⁷. Benzer şekilde, Nonnenmacher ve ark.18 ve Tabebordbar ve ^ark.19, kapsid gen kütüphanesini dokuya özgü promotörlerin kontrolü altına yerleştirmiştir. Farklı hayvan modellerinde enjeksiyondan sonra, kapsid varyantlarını izole etmek için viral RNA kullanıldı.

Alternatif bir yaklaşım, capsid kitaplıklarını etiketlemek için barkodlama kullanmaktır. Björklund laboratuvarı²⁰ , bu yaklaşımı barkod peptit yerleştirme kapsid kütüphaneleri için kullandı ve barkodlu rasyonel AAV vektör evrimini (BRAVE) geliştirdi. Bir plazmidde, Rep2Cap kaseti ters çevrilmiş terminal tekrarları (ITR) ile çevrili, sarı floresan protein (YFP) eksprese eden, barkod etiketli transgenin yanında klonlanır. Kapağın sonu ile barkodun başlangıcı arasındaki loxP bölgelerini kullanarak, bir in vitro Cre rekombinasyonu NGS için yeterince küçük bir parça üretir, böylece peptid yerleştirmenin benzersiz barkodla (arama tablosu, LUT) ilişkilendirilmesine izin verir. AAV üretimi plazmid kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilir ve mRNA'da eksprese edilen barkodlar in vivo uygulamadan sonra yine NGS²⁰ ile taranır. Kapsid kütüphaneleri tüm kapsid geninin varyantlarını (yani, karıştırılmış kütüphaneler) içerdiğinde, uzun okunan dizilemenin kullanılması gerekir. Birçok grup, NGS'nin daha yüksek okuma derinliğine sahip olmasını sağlayan bu çeşitli kütüphaneleri etiketlemek için barkodlar kullandı. Kay lab²¹ , çok çeşitli kapsid karıştırılmış kütüphaneleri, kapak poliA sinyalinin aşağı yönündeki barkodlarla etiketledi. İlk adımda, barkodlu bir plazmid kütüphanesi oluşturuldu ve karıştırılmış kapsid gen kütüphanesi klonlandı. Daha sonra LUT^21'lerini oluşturmak için MiSeq (kısa okuma, daha yüksek okuma derinliği) ve PacBio (uzun okuma, daha düşük okuma derinliği) NGS ve Sanger diziliminin bir kombinasyonu kullanıldı. 2019 yılında, Ogden ve Church lab 22'den meslektaşları, her pozisyonda tek nokta mutasyonları, eklemeleri ve silmeleri olan kütüphaneleri kullanarak^AAV2 kapsid uygunluğunu tanımladılar ve sonuçta makine rehberliğinde tasarıma olanak sağladılar. Kütüphanenin oluşturulması için, kapsid geninin daha küçük parçaları sentezlendi, bir barkodla etiketlendi, yeni nesil sıralandı ve daha sonra tam kapsid genine klonlandı. NGS verileri bir LUT oluşturmak için kullanıldı. Kütüphane daha sonra sadece barkodlar ve kısa okuma sıralaması kullanılarak tarandı ve bu da daha yüksek okuma derinliği^22'ye izin verdi.

Barkodlu kütüphaneler ağırlıklı olarak, kapsid kütüphanelerinin birkaç tur seçimini takiben veya bir kapsid evrimi çalışmasından bağımsız olarak bilinen, doğal ve mühendislik varyantlarından oluşan bir havuzu taramak için kullanılmıştır. Bu tür kütüphanelerin avantajı, hayvan sayısını azaltırken ve hayvanlar arasındaki çeşitliliği en aza indirirken birden fazla kapsid tarama fırsatıdır. Bu teknolojiyi AAV alanına tanıtan ilk çalışmalar neredeyse on yıl önce yayınlandı. Nakai laboratuvarı 12, AAV9'dan VP1'de 356 ila 736 amino asitleri kapsayan 191 çift alanin mutantını bir çift 12-nükleotid barkodla etiketledi. NGS kullanılarak, kütüphane galaktoz bağlama ve diğer özellikler¹² için in vivo olarak tarandı. Marsic ve meslektaşları, AAV varyantlarının biyolojik dağılımını, 1 yıl sonra¹³ çift barkablolu bir analiz kullanarak tanımladılar. İnsan olmayan primatlarda yapılan daha yeni bir çalışma, farklı doğum yolları kullanarak 29 kapsidin merkezi sinir sistemindeki biyodağılımını karşılaştırmıştır²³. Laboratuvarımız yakın zamanda doğal ve mühendislik ürünü AAV'leri içeren 183 varyantın barkodlu AAV kütüphane ekranlarını yayınladı. DNA ve RNA seviyesindeki bu ekranlar, farelerde oldukça miyotropik bir AAV varyantı^24'ün tanımlanmasına ve fare beyninde yüksek hücre tipi özgüllük gösteren diğerlerine yol açtı²⁵.

Burada, bu çalışmada kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz ve AAV peptid görüntüleme kütüphanelerinin taranmasını içerecek şekilde genişletiyoruz. Bu, AAV2 peptit görüntüleme kütüphanelerinin oluşturulmasını, niceleme için bir dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini ve son olarak kısmen Weinmann ve meslektaşlarının çalışmalarına dayanan AAV varyantlarını analiz etmek için bir NGS boru hattını içerir²⁴. Son olarak, barkodlu AAV kütüphanelerinin neslinin ve aynı yayında kullanılan NGS boru hattının bir açıklaması verilmiştir.

1. AAV2 rastgele 7-mer peptid ekran kütüphanesi hazırlığı

NOT: Bir AAV2 rastgele peptid görüntüleme kütüphanesinin hazırlanması için, dejenere oligonükleotidleri tek sarmallı DNA olarak sentezleyin, çift sarmallı DNA'ya dönüştürün, sindirin, alıcı plazmidine ve elektroporata bağlayın.

1. Dejenere oligonükleotidlerin tasarımı
   1. Dejenere oligonükleotidleri sipariş edin ve kodon yanlılığından kaçının. Oligonükleotid 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3'te X01, her biri 20 amino asitten birini kodlayan 20 kodona karşılık gelir. W, arginin (R) veya serin (S) amino asitlerini kodlayan AGA veya AGT kodonları üreten A veya T olabilir.
   2. Amplifikasyon astarını sipariş edin: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (ayrıntılar için Şekil 1'e bakın). Bu, aşağıdaki protein ekini üretir: R/S G_{X 7}. Teorik çeşitlilik aşağıdaki gibi hesaplanır: 1 x 2 x 20⁷ = 2.56 x 10⁹ benzersiz varyant.
      NOT: Bu çeşitliliğin dönüşüm verimliliği ile sınırlandırılabileceği unutulmamalıdır.
2. İkinci iplik sentezi
   1. Her iki oligonükleotidleri (dejenere oligonükleotidler ve amplifikasyon primeri) TE tamponu ile 100 μM nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.
      1. PCR reaksiyonu için, her bir astarın 1 μL'si, tamponun 10 μL'si, 1.5 μL DMSO, 0.5 μL dNTP'ler (10 mM), 0.5 μL'si Hi-fidelity Sıcak Başlangıç Polimeraz II ve 35.5 μL nükleaz içermeyen su ile 50 μL'lik bir reaksiyon ayarlayın.
      2. Reaksiyonu bir termosiklier'e aktarın ve 98 ° C'de 10 sn için bir ön inkübasyon adımı, ardından 98 ° C'de 10 s, 59 ° C'de 30 s ve 72 ° C'de 10 sn olmak üzere üç döngü, ardından 72 ° C'de 5 dakika ve son bir soğutma adımı çalıştırın.
   2. Bir nükleotid giderme kiti kullanarak reaksiyonu saflaştırın ve 100 μL nükleaz içermeyen suda salın.
   3. İkinci iplik sentezinin verimliliğini bir Biyoanalizör üzerinde analiz yaparak onaylayın (bkz. Şekil 2). Üreticinin talimatlarına göre bir DNA 1000 Reaktifler kitinden bir mikroakışkan çipe reaksiyonun 1 μL'sini yükleyerek çift sarmallı kesici ucun boyutunu ve saflığını analiz edin. Bu kit, çift sarmallı DNA fragmanlarının boyutunu ve konsantrasyonunu 25-1.000 bps arasında ölçmek için optimize edilmiştir.
3. Kesici uç ve plazmid vektörünün sindirimi
   1. Saflaştırılmış kesici ucun 85 μL'sini 10 μL 10x tampon ve 5 μL BglI enzimi ile son 100 μL reaksiyon hacminde sindirin (ayrıntılar için Şekil 1'e bakın). Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bir nükleotid giderme kiti kullanarak saflaştırın, 50 μL nükleaz içermeyen suda sayın ve bir spektrofotometrede "Oligo DNA" tipini kullanarak sayısallaştırın.
   2. Son 200 μL reaksiyon hacminde 20 μL 10x tampon ve 10 μL SfiI enzimi ile replikasyon yetkin bir AAV plazmidinin (pRep2Cap2_PIS)²⁶ (ITR ile çevrili viral genom) 10 μg'sini sindirin (ayrıntılar için Şekil 1'e bakın). Gece boyunca 50 ° C'de inkübe edin. Jel ekstraksiyon kitini kullanarak vektörü% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde saflaştırın, ardından bir DNA saflaştırma kiti kullanarak ek bir saflaştırma adımı izleyin. Bir spektrofotometredeki konsantrasyonu sayısallaştırın.
4. Kesici ucun vektöre bağlanması
   1. 20 μL ligasyon reaksiyonunda 2 μL tampon ve 2 μL ligaz ile 45 ng kesici uç ile 955 ng plazmid vektörünü ligate. Gece boyunca 16 ° C'de inkübe edin, ardından ligazı ısıl inaktive etmek için 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
5. Dönüşüm, karmaşıklık hesaplaması ve plazmid kütüphanesi hazırlama
   1. Üreticinin talimatlarını izleyerek reaksiyonu bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın. Reaksiyonu, nükleaz içermeyen suyun başlangıç hacminin yaklaşık% 80'inde boşaltın ve sonraki dönüşüm için buz üzerinde saklayın.
   2. Elektrokompetan hücreleri dönüştürün: Bir şişe elektrokompetan hücreyi buz üzerinde 10 dakika boyunca çözün. Daha sonra 30 μL (bir şişe) elektrokompetan hücreye saflaştırılmış ligasyon reaksiyonunun 1-2 μL'sini ekleyin ve hafifçe dokunarak karıştırın. Daha sonra, hücre/DNA karışımını hava kabarcıkları sokmadan önceden soğutulmuş 1 mm boşluklu elektroporasyon küvetine dikkatlice pipetin.
   3. Aşağıdaki ayarları kullanarak elektroporat: 1800 V, 600 Ω ve 10 μF. Elektroporasyon darbesinin 10 s içinde, küvete 970 μL önceden ısıtılmış geri kazanım ortamı (elektrokompetan hücrelerle birlikte verilir) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Son olarak, hücreleri bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 250 rpm'de 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. İstenilen çeşitliliği elde etmek için 10-100 reaksiyon gerçekleştirin ve inkübasyondan sonra tüm reaksiyonları tek bir tüpte toplayın.
   4. PBS'de 10-, 100- veya 1.000-kat havuzlanmış dönüşümlerin 10 μL'sini seyrelterek çeşitliliği hesaplayın ve uygun antibiyotiği (75 mg / mL ampisilin) içeren besin agar plakalarına 100 μL yayın. Agar plakalarını gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve ardından agar plakalarındaki kolonileri sayın.
   5. Teorik çeşitliliği aşağıdaki gibi hesaplayın:
      Teorik maksimum çeşitlilik = 10 x seyreltme faktörü x koloni sayısı x elektroporasyon reaksiyonlarının sayısı.
      NOT: Kütüphane kalitesini onaylamak için, Sanger dizilimi ile en az 20 koloni sıralayın. Çoğu klon bir ek parça içermeli ve hepsi benzersiz olmalıdır.
   6. Uygun antibiyotik içeren 400-1.000 mL LB ortamını havuzlanmış dönüşümlerin geri kalanıyla aşılayın ve gece boyunca 37 ° C, 180 rpm'de inkübe edin.
6. Plazmid kütüphanesinin hazırlanması
   1. Gece kültüründen, bir gliserol stoğu hazırlayın (nükleaz içermeyen suda eşit miktarda bakteri kültürü ve% 50 gliserol çözeltisini karıştırın ve -80 ° C'de dondurun) ve plazmid kütüphanesini bir plazmid maxi kiti kullanarak saflaştırın.
7. AAV viral kütüphanesinin üretimi
   1. Viral kütüphaneyi daha önce açıklandığı gibi hazırlayın²⁷. Plazmid kütüphanesini (pRep2Cap2_PI, peptid ekini) bir adeno-yardımcı plazmid ile birlikte polietilenimin (PEI) gibi bir transfeksiyon reaktifi kullanarak HEK293T hücrelerine transfekte edin.
   2. Hücreleri 3 gün sonra toplayın ve üç döngü donma-çözme işlemine maruz bırakın. Sezyum klorür gradyanı ultrasantrifüjleme kullanarak viral lizatı saflaştırın, ardından PBS'ye tampon değişimi yapın ve son olarak viral parçacıkları konsantre edin.
8. dd-PCR kullanarak AAV vektör titrasyonu
   1. 1:10^{6 nihai} seyreltme elde etmek için AAV vektör stoğunun 2 μL'sini 198 μL nükleaz içermeyen suda seri olarak seyreltin. Her seferinde 200 μL pipet kullanarak iyice karıştırın. Negatif denetim olarak bir şablonsuz denetim (NTC) ekleyin.
      NOT: Ek düşük veya daha yüksek seyreltmeler test edilebilir (1:10^5-1:10⁷).
   2. 20x astar-prob karışımı hazırlayın. 100 μM primerlerin her birinden 3,6 μL (ileri ve geri, Rep2 ve ITR), 100 μM dd-PCR problarının (Rep2 ve ITR) her birinden 1 μL ve 1,5 mL santrifüj tüpüne 3,6 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
      NOT: AAV kütüphanesi, FAM etiketli bir prob ile algılanan transgen hedefli bir primer-prob seti (Rep2) ve HEX etiketli bir prob ile algılanan ITR hedefli bir primer-prob seti kullanılarak ölçülür.
   3. 5,5 μL numune, 1,1 μL 20x astar-prob karışımı, problar için 11 μL dd-PCR süper karışımı (dUTP yok) ve 4,4 μL nükleaz içermeyen su ekleyerek 22 μL'lik bir PCR reaksiyonu hazırlayın. Bu, primerler ve prob için sırasıyla 900 nM ve 250 nM konsantrasyonları verir.
   4. Bir damlacık jeneratörü kullanarak damlacıkları oluşturun, reaksiyonu 96 delikli bir plakaya aktarın, plakayı bir termosikletçiye yerleştirin ve 94 ° C'de 10 dakika boyunca bir denatürasyon adımı uygulayın, ardından 94 ° C'de 30 s'lik 40 döngü ve 58 ° C'de 1 dakika çalıştırın. Daha sonra, polimerazı 98 ° C'de 10 dakika boyunca ısıl olarak etkisiz hale getirin ve son bir soğutma adımı ekleyin. Bir damlacık okuyucudaki reaksiyonları okuyun ve analize geçin²⁸.
   5. Analiz yazılımını kullanarak kaydedilen dd-PCR plaka dosyasını açın. NTC'yi kılavuz olarak kullanarak her kanalın negatif ve pozitif damlacıklarını ayırmak ve verileri bir csv dosyasına dışa aktarmak için 1B Genlik sekmesindeki eşik aracını (floresan genliği ve olay numarası) kullanın.
   6. Vektör konsantrasyonunu hesaplamak için, önce aşağıdaki formülü kullanarak düzeltme faktörü CF'yi hesaplayın:
      
      CF, fonksiyonel vektör parçacıklarının tespitini sağlamak için hem transgen hem de ITR [Ch1 + Ch2 ⁺] için pozitif olan transgen [Pozitifler] için pozitif olan damlacıkların oranını belirler. Son vektör konsantrasyonu c artık aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir:
      
      DF seyreltme faktörüdür (daha önce belirlendiği gibi 1:10,^5-1:10,⁷ ). 20 μL/kuyu reaksiyonu başına kopyalar, seyreltilmiş numunenin 5 μL'sine karşılık gelir. Faktör 1.000, ölçeği VG / mL'ye (viral genom / mL) düzeltir. Örnek bir titrasyon sonucu Tablo 1 ve Şekil 3'te gösterilmiştir.
9. AAV viral kütüphanesinin NGS ile analizi
   1. 96-nükleotid peptid yerleştirme fragmanını, bir prova okuma polimeraz kiti kullanarak 20 μL'lik bir PCR reaksiyonu kurarak güçlendirin (2x; bkz. Şekil 4). Reaksiyona 1 x 10⁸ vg içeren 1 μL AAV stoğu, 100 μM astarın her birinin 0,5 μL (NGS_forward ve NGS_reverse) ve 10 μL enzim karışımı ekleyin. Son ses seviyesini nükleaz içermeyen su ile 20 μL'ye ayarlayın.
   2. Reaksiyonu bir termosiklerle aktarın ve 98 ° C'de 3 dakika boyunca bir denatürasyon adımı, ardından 98 ° C'de 10 s'lik 30-35 döngü, 59 ° C'de 10 s ve 72 ° C'de 20 s, ardından 72 ° C'de 5 dakika ve son bir soğutma adımı çalıştırın.
   3. Bir PCR saflaştırma kiti kullanarak numuneleri saflaştırın. Bir spektrofotometredeki konsantrasyonu ölçün ve saflığı ve parça boyutunu doğrulamak için% 3'lük bir agaroz jeli çalıştırın.
   4. PCR parçalarını, düşük karmaşıklıktaki numune kiti için kütüphane sistemini kullanarak, üreticinin bir NGS kütüphanesinin hazırlanmasına ilişkin talimatlarına göre işleyin. Son onarım reaksiyonunu 30 ng PCR fragmanı ile gerçekleştirin, ardından 10 döngü boyunca adaptör ligasyonu ve PCR amplifikasyonu yapın. Reaksiyonların saflaştırılması için PCR saflaştırma kitini kullanın.
   5. Üreticinin talimatlarına göre bir DNA reaktifleri kiti kullanarak boyut ve saflığı doğrulamak için nihai ürünleri bir Biyoanalizörde işleyin.
   6. Bir florometre kullanarak amplikonları sayısallaştırın ve bir araya getirin. Son havuzlanmış NGS kütüphanesini bir florometre üzerinde tekrar ölçün (üreticinin talimatlarına göre) ve bir Biyoanalizörde kaliteyi doğrulayın.
   7. NGS kitaplıklarını, okuma uzunluğu 84 ve dizin 1'i 8 olan 75 döngülü yüksek çıkış kiti kullanarak tek uçlu (SE) modda sıralayın.
      NOT: Bu makaledeki örneklerin sıralanması EMBL Heidelberg'in (http://www.genecore.embl.de/) GeneCore tesisinde gerçekleştirilmiştir.
   8. NGS sıralama verilerini Python 3 ve biopython ile analiz edin. Dosyalar https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022'de bulunabilir (alternatif olarak https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215'de). NGS analizi iki adımdan oluşmaktadır.
      1. İlk adımda, dizi dosyalarında belirli ölçütleri karşılayan diziler için arama yapın (ekleme bölgesini çevreleyen tanıma dizilerinin varlığı) (bkz. Şekil 4, adım 1.9.8.5.). Bu, bir komut dosyası (Komut Dosyası # 1) ve gerekli bilgileri sağlayan bir yapılandırma dosyası kullanılarak yapılır. Doğru sıra belirlendikten sonra, program sırayı ayıklar ve sıralama dosyasıyla aynı ada sahip bir txt dosyası olan çıktı dosyasında saklar.
      2. İkinci adım, çıktı dosyalarının analizidir. Kütüphanedeki diziler, dokuz amino asit ekindeki altı nükleotitten (AGWggc, W = A / T) herhangi biriyle başlar. Bu başlangıç sırasına dayanarak, peptid çevrilir. Bu, peptit varyantlarını (PV'ler) içeren çıktı dosyalarını oluşturur.
      3. İki klasör hazırlayın: Komut Dosyası ve Veri. Veri klasörüne, sıralamadan kaynaklanan gzip ile sıkıştırılmış dosyaları kopyalayın. Komut Dosyası klasörüne aşağıdaki dosyaları kopyalayın, Python dosyası: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python dosyası: Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Yapılandırma dosyası: Barcode_Script_JoVE.conf; ve Arama tablosu (LUT) dosyası: Zuordnung.txt.
      4. Komut dosyalarını çalıştırmadan önce, Komut Dosyası klasöründe aşağıdaki dosyaları düzenleyin. "Zuordnung.txt" dosyasını açın ve sekmeyle ayrılmış iki sütuna, gzip dosyalarının adlarını (sütun 1) ve istediğiniz son adı (sütun 2; sekmeyle ayrılmış değerler) ekleyin.
         NOT: Örnek txt dosyaları GitHub "PV_analysis_script" klasöründe bulunur. GitHub klasöründe sağlanan dosyalar, yukarıdaki kitaplıktan üç örnek verinin analizi için hazırlanır: xaa.txt.gz, xab.txt.gz ve xac.txt.gz. Çıktı dosyaları da sağlanır.
      5. "Barcode_Script_JoVE.conf" yapılandırma dosyasında aşağıdaki değişkenleri değiştirin:
         my_dir = "~/Veri/"
         filename_sample_file = "~/script/Zuordnung.txt"
         Diziye özgü değişkenler: BCV_size = 27, BCV_sol = TCCAGGGCCAG, BCV_sağ = GCCCAGG, BCV_loc = 30, BCV_marjı = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC ve BCV_{loc_revcomp} = 41 (ayrıntılar için Şekil 4'e bakın).
      6. Varyant dizisi algılama ve ayıklamayı çağırmak için aşağıdaki komutu kullanın:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         NOT: Çıktı, çıkarılan DNA dizilerini ve okunma sayılarını içeren txt dosyalarıdır. Bu dosyanın başlığı istatistiksel veriler içerir (yani, toplam okuma sayısı ve ayıklanan okumalar). Bu veriler sonraki dosyalara aktarılır. Bu txt verileri, DNA dizilerinin çevrildiği, sıralandığı ve analiz edildiği Script # 2 için giriş dosyalarıdır.
      7. Aşağıdaki komutu kullanarak PV çıkarma ve analiz gerçekleştirin:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Komut Dosyası # 2'nin metin çıktı dosyalarını analiz edin. Komut Dosyası # 2'nin çıktı dosyaları, analiz türüne bağlı uzantılarla "Zuordnung.txt" içindeki LUT'un ikinci sütunu kullanılarak adlandırılır.
         NOT: Üç çıktı dosyasının ilk satırlarda istatistiksel veriler içerdiğinden emin olun ("# of Valid PV reads", "# of Invalid PV reads" ve "# of unique PV reads"), giriş txt dosyalarından her DNA dizisinin dizinini içeren bir ilk sütun (Script#1 çıktısı) ve aşağıdaki sütunlar: (1) "... analyzed_all.csv": "Örnek:" (DNA dizisi), "#" (okuma sayısı), "Frw veya Rev" (ileri veya geri okuma) ve "PV'ler" (çevrilmiş peptid dizisi). Geçersiz dizilerin son iki sütununda "NA" ve "geçerli değil" ifadeleri bulunur. (2) "... analyzed_validSeq.csv": önceki dosyayla aynı, geçerli diziler için filtrelenmiş. (3) "... analyzed_PV.csv": "PV'ler" (çevrilmiş peptid dizisi), "#" (okuma sayısı) ve "sayım" (önceki dosyalardaki frw ve devir sayıları birleştirilir ve sayıma 1 veya 2 verilir).
      9. Kullanıcının ihtiyaçlarına göre mevcut yazılımları kullanarak çıktı dosyalarını görselleştirin.

2. AAV2 rastgele 7-mer peptit ekran kütüphanesi seçimi

1. İstenilen özelliklere sahip adayları yinelemeli olarak seçmek üzere tercih edilen bir modelde yönlendirilmiş evrim için niceleme ve kalite kontrolünden sonra AAV kitaplığını kullanın (Bölüm 1) (Bkz. Şekil 5)^16,18,21.
   NOT: Bu adaylar daha sonra aşağıda bölüm 3'te açıklandığı gibi barkodlu bir kütüphanenin oluşturulması için kullanılır.

3. Barkodlu AAV kapsid kütüphanesi hazırlama ve analizi

NOT: Peptid görüntüleme ekranında potansiyel olarak spesifik ve etkili AAV kapsidleri kümesinin tanımlanmasını takiben, tanımlanan peptid dizilerinin işlevselliğini doğrulayın ve bunları yaygın olarak kullanılan veya iyi tanımlanmış referans AAV kapsid varyantları kümesiyle karşılaştırın. Bunu yapmak için, kapsid sırası ITR'ler olmadan bir Rep/Cap yardımcı yapısına eklenir.

1. Barkodlu AAV kütüphanesi üretimi
   1. Daha önce tarif edildiği gibi üç plazmid sistemini kullanarak her kapsid varyantı için rekombinant AAV üretimi^{gerçekleştirin 24}.
      NOT: Farklı kapsid varyantlarını ayırt etmek için, ITR yanlı muhabir transgen plazmid, 15 nükleotid uzunluğunda benzersiz bir barkod barındırır. Barkod, geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile poliA sinyali arasındaki 3' UTR'de (çevrilmemiş bölge) bulunur (bkz. Şekil 6A). EYFP ekspresyonu, yeterli düzeyde RNA transkriptleri sağlayan güçlü bir ubiquitous sitomegalovirüs (CMV) promotörü tarafından yönlendirilir.
   2. 15 nükleotid uzunluğundaki barkodları, üçten az nükleotidden daha az homopolimerler, GC içeriği 29 ve dört nükleotitten daha büyük bir Hamming mesafesi²⁴ ile tasarlayın.
   3. Her kapsidi benzersiz bir barkod taşıyan bir transgen plazmid ile birlikte ayrı ayrı üretin. Bu şekilde, her kapsid varyantı, kendine özgü izlemeyi sağlayan ayrı bir barkodla etiketlenir (bkz. Şekil 6B).
2. dd-PCR kullanarak AAV vektör titrasyonu
   1. AAV titrasyonunu daha önce bölüm 1.8'de açıklandığı gibi, Rep2 astar çiftini YFP astar çifti ile değiştirerek gerçekleştirin.
   2. Tek tek AAV üretimlerini ölçün ve nihai barkodlu kütüphaneyi oluşturmak için her üretimin eşit miktarlarını bir araya getirin.
   3. Son konsantrasyonu ve kaliteyi kontrol etmek için son kütüphaneyi tekrar ölçün (bkz. Şekil 7).
3. Barkodlu AAV kütüphanesi in vivo uygulama
   1. Barkodlu AAV kütüphanesini sistematik olarak tercih edilen model sistemine uygulayın (örneğin farelerde sistematik olarak²⁴).
   2. Deneye dayanarak ON- ve OFF-hedef dokuları (yani, karaciğer, akciğer, kalp, diyafram, düz kas, duodenum, pankreas, kolon, biseps, yumurtalıklar, mide, iç kulak, böbrek, abdominal aort, torasik aort, beyin, kahverengi ve beyaz yağ ve dalak) veya hücre tiplerini toplayın. Bunları -80 ° C'de dondurun, DNA / RNA'yı çıkarın ve bir sonraki bölümde açıklandığı gibi NGS kantitasyon analizi uygulayın.
4. DNA/RNA ekstraksiyonu
   1. DNA / RNA Mini Kitini kullanarak DNA ve RNA'yı ilgili dokulardan çıkarın.
   2. İlgilenilen dokunun küçük bir parçasını (1 mm³, yaklaşık 5 mg) 2 mL'lik bir reaksiyon tüpüne yerleştirin.
   3. Dokuya β-merkaptoetanol (% 1) ve 5 mm çelik boncuklarla karıştırılmış 350 μL lizis tamponu ekleyin (duman başlığı altında β-merkaptoetanol içeren numuneleri işleyin).
   4. Bir dokudaki dokuyu homojenize edinLyser 40 Hz'de 45 sn boyunca.
   5. 10 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve 400 rpm'de çalkalarken 55 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
   6. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüjleyin, süpernatanı toplayın ve üreticinin DNA / RNA Kiti protokolüne devam edin.
   7. Her adımda 350 μL yıkama tamponu ile yıkama adımını iki adıma bölün. Bu yıkama adımları arasında, kolon üzerindeki kalan DNA'yı RNase içermeyen DNase I ile sindirin. üreticinin talimatına göre hazırlanan DNase I çözeltisinin 80 μL'sini kolona ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
   8. RNA / DNA'yı nükleaz içermeyen su ile kolondan çıkarın. İzole RNA'yı -80 ° C'de ve gDNA'yı -20 ° C'de saklayın.
5. cDNA sentezi
   1. RNA örneklerini, ters transkripsiyon reaksiyonundan önce 15-30 dakikalık başka bir DNaz I tedavisine (RNA örneklerinden kirletici DNA'nın tamamen çıkarılması için) maruz bırakın. DNaz I çözeltisinden 1 μL, 4 μL tampon (kit ile birlikte verilir) ve nükleaz içermeyen suyu, 40 μL ila 212 ng RNA'nın son hacmine ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısıyı etkisiz hale getirin.
   2. Üreticinin talimatlarına göre bir kit kullanarak 150 ng RNA kullanarak cDNA'yı sentezleyin. Numuneden kontamine edici viral DNA'nın bulunmadığından emin olmak için ters transkriptaz içermeyen kontrolleri dahil edin. cDNA -20 °C'de saklanır.
      NOT: Optimal ters transkripsiyon için giriş RNA miktarı, doku tipine ve ilgili dokuda beklenen transdüksiyon verimliliğine bağlı olarak değişebilir.
6. AAV viral kütüphanesinin analizi (in-vivo) tarafından NGS
   1. Düşük maliyetle yüksek sıralama derinliği elde etmek için, daha önce açıklandığı gibi Illumina dizilemesi yoluyla NGS gerçekleştirin (bölüm 1.9). Barkod dizisini yükseltin ve ardından sıralama adaptörlerini amplikona bağlayın.
   2. Kısa okuma uzunluğu ve amplikonunun her iki tarafındaki sıralama adaptörlerinin bağlanması nedeniyle, tasarım yaparken, amplikonun NGS okunması içindeki barkod dizisinin varlığını sağlamak için yeterince küçük olup olmadığını kontrol edin. Viral genomlar ve viral transkriptler içindeki barkodların dizilimi için, PCR amplikonu 113 bp uzunluğunda olacak şekilde tasarlanmıştır (bkz. Şekil 8).
   3. BC-seq ileri ve BC-seq geri astarları ile barkodlu bölgeyi yükseltin. Aşağıdaki PCR reaksiyonunu hazırlayın: 0,5 μL Hi-fidelity DNA polimeraz, 10 μL 5x tampon, her 100 μM primerin 0,25 μL'si (BC-seq fw / BC-seq rv) ve 1 μl 10 mM dNTP'ler. Şablon olarak 25 ng cDNA veya DNA / reaksiyon kullanın ve son hacmi nükleaz içermeyen su ile 50 μL'ye ayarlayın.
   4. Kontaminasyonu önlemek için PCR ana karışımını temiz bir PCR başlığı altında hazırlayın. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanın: 98 °C'de 30 s, ardından 10 s için 98 °C'de 40 döngü ve 20 sn için 72 °C ve 72 °C'de son 5 dakikalık adım.
   5. PCR ana karışımında kirletici DNA bulunmadığını doğrulamak için PCR kontrollerini dahil edin. cDNA örnekleri için, ters transkriptaz içermeyen kontrolleri dahil edin. Son olarak, AAV giriş kitaplığına bir örnek ekleyin. Bu bilgiler, analizde kullanılan Normalization_Variant.txt dosyasını oluşturmak için kullanılacaktır.
   6. PCR saflaştırmadan önce jel elektroforezi ile her numunenin PCR parçasının boyutunu doğrulayın. İkincisi, ticari olarak temin edilebilen manyetik boncuklar veya sütun bazlı DNA saflaştırma sistemleri kullanılarak elde edilir (bakınız Malzeme Tablosu).
   7. NGS kitaplığını, daha önce bölüm 1.9'da açıklandığı gibi, düşük karmaşıklıktaki numuneler için kütüphane sistemini kullanarak üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
   8. DNA HS Kiti ile DNA konsantrasyonunu belirleyin ve daha önce açıklandığı gibi kütüphanenin kalitesini analiz edin (bölüm 1.9.6), ardından havuzlama. Bir florometre üzerinde havuzlanmış kütüphaneyi ölçün ve bir Biyoanalizörde kaliteyi değerlendirin.
   9. NGS sıralamasını bölüm 1.9.7'de açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   10. Havuzlanmış kütüphanenin DNA üzerindeki dokular veya organlar arasındaki dağılımını değerlendirmek için transgenin (viral genomlar) ve temizlik geninin kopya sayısını qPCR ile sayısallaştırın.
   11. EYFP (transgen) ve GAPDH'nin (gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz, temizlik geni) kopya sayısını belirlemek için aşağıdaki gibi bir 30 μL qPCR reaksiyonu ayarlayın:
       1. EYFP için 60x astar/prob karışımı hazırlayın (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv ve 0,6 μM YFP_probe; bkz. Temizlikçi geninin kopya sayısını belirlemek için GAPDH astar / prob karışımını kullanın (bkz. Buz üzerinde reaksiyonu ayarlayın.
       2. Bir PCR ana karışımı hazırlayın (15 μL, Malzeme Tablosuna bakın) ve tüm numuneler ve standartlar için 60x astar/prob karışımı (0,5 μL) ekleyin (standartların kopya sayılarını hesaplamak için aşağıdaki bağlantıyı kullanın: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Buz üzerinde reaksiyonu ayarlayın.
       3. Ana karışımın 15,5 μL'sini 96 delikli bir plakaya aktarın ve ilgili kuyucuğa 14,5 μL numune (toplam DNA konsantrasyonunun 75 ng'si) veya standardı ekleyin. 96 delikli plakayı folyo, vorteks ile kapatın ve kısaca döndürün.
       4. Her numunenin 10 μL'sini kopyalar halinde 384 delikli bir plakaya aktarın. Plakayı folyo ile kapatın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'de döndürün.
       5. Reaksiyon karışımını 2 dakika boyunca 50 ° C'lik bir başlangıç sıcaklığı kullanarak bir termosiklerde inkübe edin, ardından 95 ° C'de 10 dakikalık bir başlangıç aktivasyon adımı izleyin. 15 s için 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon ve 1 dakika²⁴ için 60 ° C'de tavlama / uzatma gerçekleştirin.
       6. Diploid genomların (dg) sayısını elde etmek için, GAPDH kopya numarasını kullanın ve ikiye bölün. Ardından, EYFP kopya numarasının değerini alın ve dg sayısına bölün, bu da diploid genom başına vektör genomları (vg / dg) ile sonuçlanır. Biyoinformatik analiz için Normalization_Organ.txt dosyasını oluşturmak üzere bu değeri kullanın.
   12. Weinmann ve ark. gibi NGS dizileme verilerinin analizini gerçekleştirin.²⁴, Python3'te özel kod kullanarak (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). İş akışı, yan diziler tarafından yönlendirilen barkod dizilerinin, uzunluklarının ve konumlarının (Script#1_BarcodeDetection.py) algılanmasının yanı sıra barkod zenginleştirme ve doku kümesi üzerindeki dağılımının analizini (Script#2_BarcodeAnalysis.py) içerir.
       1. Barkodu algılayın ve bunları AAV varyantlarına atayın. Sıralama verilerini arşivlenmiş fastq dosyaları olarak tek bir dizine yerleştirin (örneğin, "Data_to_analyze"). Giriş kitaplığının sıralama veri dosyası bu dizine eklenir ve yalnızca giriş kitaplığındaki kapsid oranlarını hesaplamak için kullanılır.
       2. Komut dosyasını çalıştırmadan önce, sekmeyle ayrılmış iki metin dosyası oluşturun: AAV kapsid varyant adlarına atanan barkod dizilerini içeren kapsid varyantları dosyası ("Varyantlar.txt örnek dosyasına bakın) ve olası kontaminasyondan kaynaklanan barkod dizilerine sahip kontaminasyon dosyası (bkz. "Kontaminasyonlar.txt) (laboratuvarda bulunan ve kontaminasyona katkıda bulunan diğer barkodlar).
       3. Son olarak, "Barcode_Script.conf" yapılandırma dosyasını aşağıdaki bilgileri içerecek şekilde düzenleyin: sıralama verilerini içeren klasörün yolu (örneğin, "Data_to_analyze"), barkodların yan bölgelerinin sırası, konumları ve barkod algılama için pencere boyutu (1.9.8.5'e benzer, bkz. Şekil 8).
       4. Komut Dosyası # 1_BarcodeDetection.py ve yapılandırma dosyalarına sağlanan yollarla barkod algılamayı çağırmak için aşağıdaki komutu kullanın:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          NOT: Komut Dosyası#1_BarcodeDetection.py yürütmesinin çıktısı, kapsid değişkeni başına okuma sayılarının yanı sıra ham verilerden kurtarılan toplam okuma sayısına sahip metin dosyalarıdır.
       5. Barkodlu AAV kapsidlerinin dokular veya organlar arasındaki dağılımını, aşağıdaki txt dosyalarıyla birlikte Script#2_BarcodeAnalysis.py yürüterek değerlendirin:
          1. "Zuordnung.txt" dosyasında, barkod algılama çalıştırmasından elde edilen her txt dosyasına bir doku/organ adı atayın: ilk sütundaki txt dosyalarının adları ve sekmeyle ayrılmış atamada karşılık gelen doku/organ adları.
             NOT: Bir örnek için, "Örnek" klasörünü (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022) iade edin. Not olarak, doku / organ adı cDNA veya gDNA ölçümünü ve biyolojik replika sayısını (M1, M2, vb.) tanımlayan karakterleri içerebilir.
          2. "Zuordnung.txt" dosyasında verilen adlara karşılık gelen ON- ve OFF-target organlarının adlarının listesini içeren bir "organlar.txt" metin dosyası oluşturun (bkz. "Örnek" klasör: https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Tüm kapsid varyantları ve tüm organlar/dokular için normalleştirilmiş değerlere sahip "Normalization_Organ.txt" ve "Normalization_Variant.txt" sekmeyle ayrılmış metin dosyaları oluşturun. "Normalization_Organ.txt" dosyasının ilk sütununda, her organ için verilen isimleri ("Zuordnung.txt atama dosyasında olduğu gibi) ve ikinci sütunda, bölüm 3.6.11'de oluşturulan ilgili dokular için normalleştirme değerlerini yazın.
          4. "Normalization_Variant.txt" dosyasının ilk sütununu kapsid adları listesiyle, ikinci sütununu ise havuza alınmış kitaplıktaki her kapsid için okuma sayılarının normalleştirilmiş değerleriyle doldurun (normalleştirme, ilk komut dosyasından kaynaklanan giriş kitaplığı için txt çıktı dosyasına göre hesaplanabilir).
          5. Yukarıda belirtilen tüm ek dosyaların tam yollarını belirterek yapılandırma dosyasını düzenleyin. Komut Dosyası#2_BarcodeAnalysis.py şu şekilde yürütün:
             >python3 /script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             NOT: Barkod analizi komut dosyası birkaç dosyanın çıktısını verir: daha önce açıklanan çoklu normalleştirme adımlarına dayalı olarak farklı dokulardaki kapsid dağılımının göreceli konsantrasyon (RC) değerlerine sahip metin dosyaları ve metin dosyası verilerini birleştirilmiş matris verilerinde birleştiren elektronik tablo dosyası. İkincisi, küme analizi ve görselleştirme için kullanılabilir.
          6. Kapsid özelliklerini ayırt etmek ve dokular arasındaki RC profillerine dayanarak benzerliklerini değerlendirmek için verileri görselleştirin ve matris verilerinin küme analizini yapın. Ek komut dosyası PCA_heatmap_plot kullanın. Depoya yerleştirilen R:
             >Rscript --vanilya ~/PCA. R ~/göreli konsantrasyon.xls
             NOT: Komut dosyası, göreli konsantrasyon .xls dosyalarını girdi olarak alır ve hiyerarşik küme ısı haritası ve ana bileşen analizinin (PCA) iki grafiğini oluşturur.
          7. Grafikleri (ısı haritası eksenleri, PCA'nın ana bileşenleri) veya png parametrelerini (renk, boyut, etiketleme) değiştirmek için R betiğini açın ve yorum yapılan bölümlerde sağlanan talimatları izleyin.

AAV2 peptit görüntüleme kitaplığının oluşturulması. Mühendislik AAV'lerinin seçimine yönelik ilk adım olarak, bir plazmid kütüphanesinin oluşturulması açıklanmaktadır. Peptit kesici ucu, dejenere primerler kullanılarak üretilir. 64'ten 20'ye kadar olanlardaki kodonların kombinasyonunu azaltmak, DNA üzerindeki kütüphane çeşitliliğini azaltarak ancak protein seviyesini azaltmayarak durdurma kodonları ortadan kaldırma ve NGS analizini kolaylaştırma avantajlarına sahiptir. Oligonükleotid eki, bir PCR reaksiyonu kullanılarak çift sarmallı DNA'ya dönüştürülen tek sarmallı DNA olarak satın alınır (Şekil 1). Bu reaksiyonun kalitesi bir Biyoanalizörde kontrol edilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, üç döngü, 10 veya 30 döngüye kıyasla daha güçlü bir bant üretti. Kesici uç daha sonra üç nükleotid çıkıntıları oluşturmak için BglI ile sindirilir. Çift sarmallı kesici ucun çıkıntı dizisinin yanındaki nükleotid, arginin (R) veya serin (S) kodlayan bir kodonun üçüncü konumunda bulunan bir A veya T (W, A veya T için belirsizlik kodudur) olabilir. Vektör (pRep2Cap2_PIS), peptid yerleştirme bölgesinde, yerleştirme bölgesinden kısa bir süre sonra bir durdurma kodonu oluşturulması nedeniyle, bir kesici uç yokluğunda kapsidin üretimini önleyen bir çerçeve kayması mutasyonuna sahiptir. Bu plazmidin SfiI sindirimi, peptid kodlayan oligonükleotid ekinde üretilen çıkıntılarla eşleşen üç nükleotid çıkıntısı üretir. Ligasyon, plazmid kütüphanesinin karmaşıklığını en üst düzeye çıkarmak için en uygun koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Bu amaçla, dönüşüm için, yüksek verimliliğe sahip ticari olarak temin edilebilen bakteriler kullanılarak elektroporasyon gerçekleştirildi.

Plazmid kütüphanesinin çeşitliliği, bu tür kütüphaneler için tipik olarak 1 x 108 civarında olan koloni sayısına göre hesaplanır. Toplam koloni sayısı, daha sonra tartışılacağı gibi, NGS analizinde kütüphanenin maksimum potansiyel çeşitliliğine karşılık gelir. Plazmid kütüphanesi daha sonra burada ayrıntılı olarak açıklanmayan ancak başka bir yerde açıklanan AAV kütüphanesini oluşturmak için kullanılır27.

Bu kütüphanenin nicelleştirilmesi dd-PCR kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tipik olarak, iki bölge ölçülür, viral genomdaki AAV2 rep geni ve ITR (bkz. Şekil 3 ve Tablo 1). Tablo 1'de gösterildiği gibi, viral genom için pozitif damlacıklardan,% 99.2'si, AAV kütüphanesi için bir kalite kontrol olan ve AAV kapsidlerinin tam viral genomlar içerdiğini öne süren ITR (Ch1 + Ch2 +) için de pozitiftir. Vg / mL'de bir konsantrasyon elde etmek için, çift pozitif damlacıkların pozitiflere oranı hesaplanır ve seyreltme faktörü ile amplifikasyondan önce doğru sayıda kopya elde etmek için kullanılır.

AAV kütüphanesinin kalitesi daha sonra uygun primerler kullanılarak bir PCR ile başlayarak NGS analizi ile değerlendirilir. Daha sonra, PCR ürünü, PCR ürününe indeks içeren adaptörler ekleyen ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak işlenir. NGS ürünleri sıralanır ve dosyalar Python kullanılarak analiz edilir. AAV2 peptid görüntüleme kitaplığından üç örnek veri sağlanır. Script#1 giriş dosyasındaki her sekans (numunedeki güçlendirilmiş DNA segmentinin tüm PCR kopyalarının dizilerinin listesi), BCVsol ve BCVsağ dizileri veya BCVleft_comp ve BCVright_comp dizileri için biyoinformatik olarak aranır. Her iki kombinasyon da tanımlanırsa, içerdiği sıra ayıklanır ve çıktı dosyasına eklenir (bkz. Şekil 4). Her iki komut dosyasının çıktısı da NGS kütüphanesinin hazırlanması ile ilgili istatistiksel veriler sağlar. Her üç kümede de, kitaplığa özgü imza dizilerine dayanan ayıklanan okumalar, toplam okumaların yaklaşık% 94'ünü temsil ediyordu ve bu da iyi bir kaliteye işaret ediyordu. Script # 2'nin çıktısı daha fazla istatistiksel veri sağlar ve çıkarılan DNA dizisinin çevirisi ek kalite kontrol verileri sağlar. "Geçersiz PV okumalarının #'sı" (yani, in-silico translasyonunu başlatmak ve kalıntıları RG veya SG'yi kodlamak için kullanılan altı nükleotitten yoksun diziler), geri kazanılan okumaların% 1'inden daha azdır ve bu da iyi bir sıralama kalitesini doğrular. İkinci senaryonun çıktıları (yani, ekstrakte edilen DNA dizilerinin çevirisi ve sıralaması), peptid varyantı başına okuma sayısı veya her peptid varyantına yol açan DNA dizilerinin sayısı gibi ek bilgiler sağlar. Dosyalardan "analyzed_PVs" ile bitenler sadece geçerli DNA okumaları içerir ve analiz peptid dizisi seviyesinde gerçekleştirilir. Geçerli okumaların% 99'undan fazlası benzersizdir, bu da kütüphanenin dengeli olduğunu ve iç çeşitliliğin yüksek olduğunu gösterir.

AAV2 peptit görüntüleme kitaplığının seçimi. Bu kütüphane daha sonra in vivo veya in vitro seçim için kullanılabilir. Bu, bu protokole dahil değildir, ancak Şekil 5'te bir taslak verilmiştir. Kısaca in vivo seleksiyon için 1 x 1012 vg/farenin sistemik enjeksiyonundan 1 hafta sonra dokular toplanır ve DNA izole edilir. Kapak geninin daha büyük bir parçası üzerinde bir kurtarma PCR'si gerçekleştirilir ve ürün, farklı kısıtlama bölgeleri kullanılarak plazmid vektörüne klonlanır, ancak burada tarif edilene benzer bir protokol kullanılır ve yuvarlak-1 AAV kütüphaneleri hazırlanır. NGS analizi için, PCR izole DNA veya AAV kütüphaneleri üzerinde gerçekleştirilir. Seçimden sonra, kütüphanedeki benzersiz PV'lerin yüzdesi tipik olarak seçim basıncına göre azalır. Projeye bağlı olarak, NGS tarafından yeterli baskın PV tanımlandıktan sonra seçim sonuçlandırılabilir.

Barkodlu kütüphane seçimi ve analizi. 82 kapsidden oluşan barkodlu bir AAV kütüphanesinden elde edilen veriler daha önce24 olarak açıklanmıştı. AAV parçacıklarının dd-PCR nicelleştirilmesi (bakınız Şekil 7 ve Tablo 1), transgen için pozitif olan kapsidlerin% 94'ünün aynı zamanda tam bir genomun göstergesi olan bir ITR içerdiğini göstermektedir. Bu, yukarıda açıklanan vahşi tip kütüphaneden daha düşüktür, ancak genellikle daha az verimli bir şekilde paketlendikleri göz önüne alındığında, rekombinant AAV'ler için hala iyi bir kalite önermektedir. Havuzlanmış kütüphanenin hayvanlara enjekte edilmesinden sonra, dokular toplanır ve DNA ve RNA izole edilir. NGS için PCR'nin yanı sıra NGS kütüphanesi hazırlama ve sıralama daha sonra yukarıda ve daha önce24'te açıklandığı gibi gerçekleştirilir. vg/dg'yi hesaplamak için qPCR gerçekleştirilir ve sağlanan örnek verilerde değerler 0,1-4 arasında değişir. Sistemik AAV doğumu için tipik olduğu gibi, karaciğer 10 vg / dg'nin üzerindedir.

Analiz işlem hattının bir parçası olarak, normalleştirme adımları farklı düzeylerde gerçekleştirilir. Giriş havuzlu kitaplıkta, kapsid değişkenleri genellikle eşit olarak temsil edilmez. Bu nedenle, giriş kütüphanesinin NGS analizi, giriş kütüphanesindeki bu kapsid varyantının bolluğuna bağlı olarak son doku / organdaki her kapsid varyantının bolluğunu düzelten bir normalizasyon dosyası oluşturmak için kullanılır. Havuza alınan kütüphane üyelerinin NGS tarafından biyodağılımı DNA ve RNA düzeyinde gerçekleştirilir. Giriş kütüphanesi için bu normalleştirme, doku/organ (P αβ) içindeki oranın bölümünü (P*αβ) giriş kütüphanesindeki orana (La) verir. Bu hesaplamalar "variant_comparison.txt" dosyasında bulunabilir. Bu bölüm daha sonra Β αβ değerini elde etmek için "Normalization_organ.txt" dosyasındaki vg / dg değerleri ile çarpılır ve Βαβ değerlerinin oranları tek bir doku veya herkes için hesaplanır. Bir doku (V αβ) içindeki her varyant için Βαβ değerinin oranı, bu varyantın bu doku içindeki yayılımını yansıtır ("organ_comparison.txt"). Buna karşılık, tüm dokulardaki (Tαβ) her varyant için Βαβ değerinin oranı, bu varyantın tüm vücut içinde yayıldığını gösterir ("göreceli konsetrasyonlar.xls"). Bu iki oran, her bir varyantın doku içi ve dokular arası biyodağılımını yansıtır. Tüm bu dosyalar, kapsid verimliliği ve özgüllüğünün farklı görselleştirmeleri için kullanılabilir24. Örnek olarak, son tabloyu kullanarak ("göreli birleşimler.xls içinde bulunur), ana bileşen analizi ve hiyerarşik kümeleme Şekil 9'da sunulmuştur.

Havuza alınmış kütüphanenin NGS diziliminden normalleştirilmesi, her kapsidin ortalama 0.012'lik bir orana sahip olduğunu gösterir, bu da 82 kapsidin her birinin teorik oranıyla eşleşir ve 0.012'lik (1/82) iyi dengelenmiş bir havuzlanmış kütüphane önerir. Biyoinformatik boru hattı tarafından üretilen "göreceli konsantrasyon.xls" dosyası, Şekil 9'da gösterildiği gibi, dokular arası kapsid biyodağılımını yansıtmaktadır. Isı haritası, doku biyodağılım profiline göre hiyerarşik olarak kümelenmiş havuzlanmış kütüphanenin her bir kapsid için log2 ölçeğinde göreceli konsantrasyon değerlerini gösterir. Ana bileşen analizi, benzer biyodağılım özelliklerine sahip AAV kapsid varyantlarının kümelerini ayırt etmeyi sağlar ve ayrıca dokular arası biyodağılımın benzersiz modellerine sahip dıştaki kapsidleri vurgular. Isı haritası hiyerarşisinin iki ana dalı, kapsid varyantlarının transdüksiyon verimliliğindeki farkı yansıtır. Kapsid varyantlarının çoğunluğuna sahip sol dal, dokuların çoğunda yüksek bir göreceli konsantrasyon değeri gösteren tüm kapsidleri içerir. Çarpıcı derecede yüksek karaciğer özgüllüğünün yanı sıra, diğer üç kapsid (Var60, Var13 ve Var63) diyaframda (Di), iskelet kasında (SM), bisepslerde (BlC) ve beyinde (B) özgüllük sergiledi. Hiyerarşik kümelemenin sağ dalı, duodenum (Du) ve pankreasta (P) belirgin olan genel olarak daha düşük transdüksiyon verimliliğine sahip kapsid varyantlarını içerir. Orijinal alt küme için PCA, yüksek karaciğer özgüllüğüne sahip kapsid varyantları kümesini oluşturur (Var 64, 78, 65, 55, 56) ve Var60 kapsidini olağanüstü kas tropizmi ile özetler.

Şekil 1: AAV2 rastgele 7-mer peptit görüntüleme kütüphanesi için klonlama stratejisine genel bakış.
Rastgele 7-mer peptid yerleştirme dizisine sahip oligonükleotid, BglI sindirim bölgesini ve amplifikasyon reaksiyonu için bir bağlanma bölgesini içeren dizilerle çevrilidir. Vektör pRep2Cap2_PIS SfiI sitelerini içerir. BglI ve SflI sindirimi tarafından üretilen çıkıntılar tamamlayıcıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Oligonükleotid ikinci iplik sentezinin biyoanalizör kalite kontrolü.
Dejenere oligonükleotidlerin ikinci iplikçik sentezi, bir biyoanalizör üzerinde yapılan analizlerle doğrulanır. Üç, 10 ve 30 döngülü amplifikasyonlu PCR reaksiyonları karşılaştırılmıştır ve en verimli olanın üç amplifikasyon döngüsü olduğu gösterilmiştir. (A) Jel görüntüsü olarak gösterilen biyoanalizör verileri. (B-D) 15 ve 1500 bp'de görülebilen standart piklere kıyasla floresan birimlerine (FU, y ekseni) karşı çizilmiş parça uzunlukları (bp, x ekseninde). Kırmızı oklar çift sarmallı oligonükleotidleri gösterir. Çift sarmallı oligonükleotidlerin en yüksek DNA konsantrasyonunu temsil eden en yüksek FU değerinin, üç amplifikasyon döngüsünden (kırmızı oklar) sonra gözlendiğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir AAV2 peptid görüntüleme kütüphanesinin dd-PCR kullanılarak titrasyon.
(A) Şablon dışı su kontrolü ve 1:10 6 seyreltilmiş virüs örneği için kanal 1'deki (FAM,Kanal 1) rep2 pozitif damlacıkların tespiti. (B) Kanal 2'deki (HEX, Kanal 2) ITR-pozitif damlacıkların tespiti. (C) Hem rep2 hem de ITR için pozitif olan damlacıkların tespiti (turuncu renkle vurgulanır). Mor çizgiler, pozitif ve negatif damlacıkların tespiti için eşikleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: NGS için kullanılan DNA fragmanına genel bakış ve piton analizi ayarları.
NGS PCR, 96 nükleotid bölgesini güçlendirir. PCR parçası NGS kütüphanesini oluşturmak için kullanılır. Biyoinformatik analiz için, yerleştirme bölgesinin sağ ve sol tanıma dizilerinin her iki iplik için ve ayrıca DNA fragmanının başlangıcından itibaren olan mesafe için verilmesi gerekir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: AAV kütüphanelerinin in vivo yinelemeli seçimi.
Farelere AAV kütüphanesi enjekte edilir. Hedef ON- ve OFF- dokular 1 hafta sonra toplanır ve NGS ve analize tabi tutulur. ON-hedef dokusu, ana vektöre klonlanan kapsid genini kurtarmak için kullanılır. Seçilen AAV kütüphanesi üretilir ve yukarıda belirtilen seçim döngüsünü tekrarlamak için kullanılır. Bu rakam BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Barkodlu AAV kütüphanesi üretimine genel bakış.
(A) ITR'ler tarafından kuşatılmış CMV promotör güdümlü eyfp transgeni taşıyan kendi kendini tamamlayan bir AAV genomunun grafik gösterimi. 3' UTR, eyfp ve sığır büyüme hormonu (BGH) poliadenilasyon sinyali arasındaki 3' UTR'de bulunan 15 nükleotid uzunluğunda bir barkod (BC) içerir. BC, DNA ve mRNA seviyesinde kapsid izlemeyi mümkün kılar. (B) AAV üretimi sırasında, benzersiz bir barkodlu genom, kapsid tanımlamasını kolaylaştıran kapak geninin tek bir varyantı tarafından paketlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Barkodlu bir AAV kütüphanesinin dd-PCR kullanılarak titrasyon.
(A) Şablon olmayan bir su kontrolü ve 1:10 6 seyreltilmiş vektör numunesi için kanal 1'deki (FAM,Kanal 1) YFP-pozitif damlacıkların tespiti. (B) Kanal 2'deki (HEX, Kanal 2) ITR-pozitif damlacıkların tespiti. (C) Hem rep2 hem de ITR için pozitif olan damlacıkların tespiti (turuncu renkle vurgulanır). Mor çizgiler, pozitif ve negatif damlacıkların tespiti için eşikleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: NGS için kullanılan DNA fragmanına genel bakış ve Python analizi için ayarlar.
NGS PCR, 113 nükleotid bölgesini güçlendirir. Biyoinformatik analiz için, barkodun sağ ve sol tanıma dizilerinin her iki iplik için ve DNA fragmanının başlangıcından itibaren olan mesafenin yanı sıra verilmesi gerekir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Ana bileşen analizi (PCA) ve hiyerarşik küme analizi.
(A) Tüm dokulardaki 82 kapsid için nispi konsantrasyon değerlerinin PCA'sı, benzer özelliklere sahip kapsid varyantlarının kümelerinin ve benzersiz transdüksiyon paternlerine sahip varyantların tanımlanmasına izin verir. (B) Yüksek nüfuslu kümeyi daha iyi ayırmak için, dıştaki benzersiz varyantların kayıtları matristen çıkarıldı ve PCA analizi tekrarlandı. (C) Hiyerarşik küme analizi, dokular arasındaki varyant transdüksiyon profillerini bir ısı haritası grafiği olarak görsel olarak değerlendirmeyi sağlar (Li = karaciğer, Lu = akciğer, FatB = kahverengi yağ, H = kalp, Di = diyafram, SM = düz kas, Du = duodenum, P = pankreas, C = kolon, BIC = biseps, O = yumurtalıklar, St = mide, I = iç kulak, K = böbrek, Aa = abdominal aort, At = torasik aort, B = beyin, FatW = beyaz yağ ve S = dalak). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: AAV2 peptid görüntüleme kitaplığının ("AAV2lib") ve barkodlu EYFP vektör kitaplığının ("BCAAVlib") titrasyon sonuçları.

D.G., AaviGen GmbH'nin kurucu ortaklarından biridir. D.G. ve K.R., bağışıklıktan kaçan AAV kapsid varyantlarının üretilmesiyle ilgili bekleyen bir patent başvurusunda mucitlerdir. Yazarların geri kalanının açıklayacak hiçbir şeyi yok.