İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Summary

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

Abstract

Bu protokol, konformasyonel değişiklik bildiren antikorlar ve yüksek verimli akış sitometrisi kullanarak β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntem oluşturmayı amaçlamaktadır. Yöntem ayrıca diğer antikor bazlı yüksek verimli tarama yöntemleri için bir kılavuz görevi görebilir. β2 integrinler, bağışıklık tepkilerinde çok önemli olan lökositlere özgü adezyon molekülleridir. Nötrofiller, sadece enfeksiyonlarla savaşmak için değil, aynı zamanda çoklu enflamatuar hastalıklara karışmak için kan dolaşımından çıkmak için integrin aktivasyonuna güvenirler. β2 integrin aktivasyonunun kontrol edilmesi, nötrofil ile ilişkili enflamatuar hastalıkların tedavisi için uygun bir yaklaşım sunar. Bu protokolde, izole edilmiş primer insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu ölçmek için β2 integrinlerinin yüksek afiniteli başlığına spesifik olarak bağlanan bir monoklonal antikor olan mAb24 kullanılır. N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP), nötrofil β2 integrinlerini aktive etmek için bir uyarıcı olarak kullanılır. Bu çalışmada 384 oyuklu plaka numunelerini otomatik olarak çalıştırabilen yüksek verimli bir akış sitometresi kullanılmıştır. 320 kimyasalın β2 integrin inhibisyonu üzerindeki etkileri 3 saat içinde değerlendirilir. G proteinine bağlı reseptör tarafından başlatılan integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki β2 integrinlerini veya hedef molekülleri doğrudan hedefleyen moleküller bu yaklaşımla tanımlanabilir.

Introduction

Birçok enflamatuar hastalık, nötrofillerin şişme veya yaralanma bölgesine infiltrasyonu ile karakterizedir¹. Bu dokulara sızmak için nötrofiller, endotelin tutuklanmasını, damar duvarı boyunca ekstravazasyonu ve doku^2'ye alımını içeren nötrofil alım kaskadını tamamlamalıdır. Dolaşımdaki nötrofiller, özellikle tutuklama aşaması için bu kaskadı tamamlamak için β2 integrin aktivasyonuna ihtiyaç duyar. Bu nedenle, nötrofil yapışmasını, ekstravazasyonu ve işe alımını azaltan integrin inhibe edici ilaçlar, enflamatuar hastalıkları etkili bir şekilde tedavi edebilir ^3,4.

β2 integrinleri daha önce inflamatuar hastalıklar için hedeflenmiştir. Doğrudan integrin αLβ2'yi hedef alan bir monoklonal antikor olan Efalizumab, sedef hastalığı^5'i tedavi etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, efalizumab ölümcül yan etkisi nedeniyle geri çekildi - JC virüsü reaktivasyonundan kaynaklanan ilerleyici multifokal lökoensefalopati ^6,7. Yeni anti-inflamatuar integrin bazlı tedaviler, yan etkileri en aza indirmek için lökositlerin anti-enfeksiyon fonksiyonlarını sürdürmeyi düşünmelidir. Efalizumabın yan etkileri, kan dolaşımındaki monoklonal antikorların uzun süreli dolaşımına bağlı olabilir ve bu da uzun vadede bağışıklık fonksiyonlarını inhibe edebilir⁸. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, efalizumabın αLβ2 çapraz bağlanmasına ve α4 integrinlerinin istenmeyen içselleştirilmesine aracılık ettiğini ve yan etkiler için alternatif bir açıklama sağladığını göstermektedir⁹. Bu nedenle, kısa ömürlü, küçük moleküllü antagonistler bu sorunu önleyebilir.

İnsan nötrofillerini kullanarak küçük moleküllü β2 integrin antagonistlerini taramak için yüksek verimli bir yöntem burada sunulmaktadır. β2 integrin aktivasyonu, ligandına erişmek ve bağlanma afinitesini artırmak için integrin ektodomaininin konformasyonel değişikliklerini gerektirir. Kanonik sustalı modelde, bükülmüş-kapalı integrin ektodomain önce uzatılmış-kapalı bir konformasyona uzanır ve daha sonra başlığını tamamen etkinleştirilmiş uzatılmış-açık konformasyona^10,11,12,13 açar. Bükülmüş-kapalıdan bükülmüş-açık ve uzatılmış-açık, sonunda 14,15,16,17,18,19'a kadar uzanan alternatif bir yol da vardır. Konformasyona özgü antikor mAb24, ektodomainin başlığı açık olduğunda insan β2-I benzeri alandaki bir epitopa bağlanır^20,21,22,23.

Burada, β24 integrinlerinin aktive edilip edilmediğini belirlemek için mAb2-APC kullanılır. Nötrofilleri ve integrini aktive etmek için, nötrofil β2 integrinlerini²⁴ aktive edebilen bakteri kaynaklı kısa bir kemotaktik peptit olan N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) bu protokolde uyarıcı olarak kullanılır. fMLP, nötrofiller üzerindeki Fpr1'e bağlandığında, G-proteinleri, fosfolipaz Cβ ve fosfoinositid 3-kinaz γ içeren aşağı akış sinyal kaskadları aktive edilir. Bu sinyal olayları nihayetinde içten dışa sinyal yolu^18,25 aracılığıyla integrin aktivasyonu ile sonuçlanır. β2 integrinlerine doğrudan bağlanan ve integrin aktivasyonu^26'nın konformasyonel değişikliklerini önleyen küçük molekül antagonistlerinin yanı sıra, β2 integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki bileşenleri inhibe edebilen bileşikler de bu yöntemle tespit edilecektir. Otomatik akış sitometreleri, yüksek verimli tarama sağlar. Yeni antagonistleri tanımlamak, yalnızca integrin fizyolojisi anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda integrin bazlı anti-inflamasyon tedavisine translasyonel içgörü sağlayabilir.

Protocol

Heparinize tam kan örnekleri, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak, UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı üzere, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, kimliksizleştirilmiş sağlıklı insan donörlerden elde edildi. Tüm donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışma için dahil etme/hariç tutma kriterleri, katılımcıların uygunluğunu sağlamak ve potansiyel riskleri en aza indirmek için dikkatlice geliştirilmiştir. Uygun katılımcılar 18 ila 65 yaşları arasında, herhangi bir etnik kökene sahip, akıcı İngilizce bilen ve bilgilendirilmiş onam verebilen katılımcılardı. Hariç tutulan katılımcılar arasında, yasal olarak yetkili bir temsilciye ihtiyaç duyanlar, 18 yaşın altındaki veya 65 yaşın üzerindeki bireyler, hapsedilen bireyler ve hamile kadınlar gibi kendileri için bilgilendirilmiş onam sağlayamayanlar yer aldı. Ek olarak, katılımcıların anti-enflamatuar ilaç kullanımından ve enflamatuar koşullardan arınmış olmaları gerekiyordu. Mevcut enfeksiyonlar veya devam eden kronik veya akut inflamatuar durumlar da dışlama kriterleriydi. Son olarak, mevcut veya yakın zamanda COVID-19 enfeksiyonu öyküsü olan kişiler çalışma için uygun değildi. Bu kriterler, çalışma sonuçlarını etkileyebilecek potansiyel kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirirken katılımcı güvenliğini ve uygunluğunu sağlamak için tasarlanmıştır.

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Nötrofil ortamı: Fenol kırmızısı olmadan RPMI-1640'a %2 insan serum albümini ekleyerek nötrofil ortamını hazırlayın (bkz.
2. fMLP çözeltisi: fMLP çözeltisini, fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ile 10 mM fMLP dimetil sülfoksit (DMSO) depolama çözeltisinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 kez seyrelterek hazırlayın, bu da 100 μM fMLP çözeltisi elde edilmesini sağlar.
3. Antikor çözeltisi: 120 μL allofikosiyanin (APC) konjuge monoklonal antikor mAb24'ü (mAb24-APC) seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu), 10 mL nötrofil ortamında β2 integrininin yüksek afiniteli konformasyonunu bildirerek 1.2 μg/mL mAb24-APC çözeltisi oluşturur.
4. Bileşik kütüphanesi: Sıvı işleyiciyi kullanarak 384 oyuklu plakalarda 5 μL 10 mM kütüphanesi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 45 μL DMSO'ya ekleyerek ilk bileşik kütüphaneyi 10 mM ila 1 mM konsantrasyonla seyreltin. Daha sonra, sıvı işleyiciyi kullanarak 1 mM bileşik kitaplığının oyuklu başına 5 μL'yi boş bir 384 oyuklu plakaya aktarın.
5. Şekil 1'de gösterildiği gibi, dört sütun ( 1, 2, 23, 24) yalnızca DMSO içeriyordu, ancak taramada pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet eden bileşikler içermiyordu. Fenol kırmızısı içermeyen 45 μL RPMI-1640 ekleyerek her bir kuyucuğu daha da seyreltin, bu da tüm bileşikler için 100 μM'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlanır.

2. İnsan kanından nötrofil izolasyonu

1. Serolojik bir pipet kullanarak, 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde (Şekil 2A) ticari olarak temin edilebilen bir yoğunluk gradyan ortamının 8 mL üzerine 4 mL kanı dikkatlice katmanlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Kanı 550 × g'da 20 °C'de 30-50 dakika santrifüj edin. Rotoru kademeli olarak yavaşlatın (yavaşlama faktörü 1).
   NOT: Nötrofillerin ( Şekil 2B'de bant 2) kırmızı kan hücrelerinden başarılı bir şekilde ayrılması donörler arasında değişebilir. Çoğu donör için 30 dakikalık bir santrifüj yeterlidir. Bununla birlikte, bazı donörler için, ayırma başarılı olmazsa 10-30 dakikalık ek bir santrifüjleme gerekebilir (Şekil 2C).
3. Plazmayı (üstteki sarı sıvı) ve mononükleer hücreleri (üstteki bulutlu bant; Şekil 2B'deki PBMC bandı) 1 mL'lik bir pipet kullanarak.
4. Alt bulutlu banttan ( Şekil 2B'deki nötrofil bandı) ve berrak sıvının yaklaşık 3-4 mL altından nötrofilleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Nötrofil süspansiyonunu 2-3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
5. Süspansiyonu 400 × g'da 20 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltarak dikkatlice çıkarın.
6. Peletleri 5 mL PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin ve 20 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve vakum emiş kullanarak tüp ağzının çevresinde ve tüp duvarında kalan süpernatanı dikkatlice ortadan kaldırın. Peletin 1 mL nötrofil ortamında yeniden süspanse edilmesi.
8. Bir hemositometre kullanarak hücre sayılarını sayın. Tipik olarak, 8 mL insan kanından 1 ila 4 × 10⁷ nötrofil elde edildi.
   NOT: Nötrofil süspansiyonunda kırmızı kan hücresi kontaminasyonu olabilir. Kırmızı kan hücreleri çoğu tahlili önemli ölçüde etkilemez ve nötrofil aktivasyonunu / hazırlamayı^{önleyebilir 27}. Doğru bir nötrofil konsantrasyonu elde etmek için kırmızı kan hücrelerinin sayımdan önce parçalanması gerekir. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için 10-30 saniye boyunca 891 μL deiyonize suya 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin, ardından ozmotik basıncı dengelemek için nötrofillerin parçalanmasını önlemek için 99 μL 10× PBS ekleyin.
9. Nötrofil ortamı ekleyerek hücre yoğunluğunu 6.25 × 10⁵ hücre / mL'ye ayarlayın.

3. 384 oyuklu plakanın hazırlanması

1. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 μg/mL mAb24-APC çözeltisi oluşturmak için 1 mL antikor çözeltisini (1.2 μg/mL mAb24-APC) 0.2 mL nötrofil ortamı ile birleştirin. Daha sonra, bu karışımdan 25 μL'yi 384 oyuklu bir plakadaki negatif kontrol kuyucuklarına ekleyin ( Şekil 1'deki mavi kuyucuklar).
2. 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 μg/mL mAb24-APC ve 200 nM fMLP içeren bir çözelti oluşturmak için 9 mL antikor solüsyonunu 21.6 μL fMLP solüsyonu (100 μM) ve 1.7784 mL nötrofil ortamı ile karıştırın. Daha sonra, bu karışımdan 25 μL'yi 384 oyuklu bir plakadaki pozitif kontrol ve test kuyucuklarına ekleyin ( Şekil 1'deki kırmızı ve mavi kuyucuklar).
3. Çok kanallı bir pipet kullanarak 5 μL'lik 100 μM bileşik çözeltilerini bileşik kitaplık plakasından 384 oyuklu plakaya aktarın.
4. Sıvıyı oda sıcaklığında 500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Plakaları santrifüjlemek için bir döner kova rotoru ve plaka kovaları gereklidir.

4. Hücrelerin tedavisi

1. 16 kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 20 μL nötrofil süspansiyonu ekleyin (384 oyuklu plakanın her bir sütunu için 5-50 μL aralığı). Pipeti kullanarak 5-10 kez nazikçe karıştırın ve her pipetleme arasında tutarlı bir zaman aralığı sağlayın.
   NOT: Kuyucuklardaki nihai konsantrasyonlar aşağıdaki gibidir: nötrofiller 2.5 × 10⁵ hücre/mL (tüm kuyucuklar); mAb24-APC 0.5 μg/mL (tüm kuyucuklar); fMLP 100 nM (pozitif kontrol ve test kuyuları); bileşikler 10 μM (test kuyuları).
2. Plakayı bir çalkalayıcı üzerinde 300 rpm'de, oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.
3. 16 kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 3 μL %16 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin (son PFA konsantrasyonu ~%0.91). Ardından, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: Nötrofiller ve PFA eklerken farklı sütunlar arasında tutarlı bir zaman aralığının korunması önerilir. Bu, her kuyucuktaki nötrofillerin fMLP ve mAb24-APC ile aynı inkübasyon süresine sahip olmasını sağlar.

5. Akış sitometrisi

1. Akış sitometresini açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve cihaza bağlı bilgisayarın da açık olduğundan emin olun.
2. Kılıf sıvı kabının dolu olduğundan ve atık kabının boş olduğundan ve cihaza doğru şekilde bağlandığından emin olun.
3. 384 oyuklu plakayı akış sitometresinin numune yükleyicisine yükleyin. Plakanın A1 kuyusunun yükleyici üzerindeki A1 işaretiyle hizalandığından emin olun.
4. Yazılımı açın ve yeni bir deney oluşturun. 384 kuyusunu seçin ve istediğiniz floroforları seçin. Ardından, Plaka kurulumu'na tıklayın, tüm kuyucukları seçmek için sürükleyin ve ardından Örnek'e tıklayın. "Yüksek verim" anahtarını açın ve oran panelinin altında Yüksek'i seçin.
   1. Birim kutusuna 50 girin. Tek sayılı sütunlardaki örnekleri seçin ve ardından "Çalkalama" anahtarını etkinleştirin. Son olarak, örnekleri sağ panelde adlandırın.
5. Arsa ve kapıya tıklayın. Ardından, Uygula düğmesine (yeşil dolu bir daire üzerinde iki ok) tıklayın ve ardından oynat düğmesine (üçgen şekli) tıklayın. İlk kuyudan bazı hücreleri gözlemlemek için birkaç saniye bekleyin ve ardından duraklat düğmesine tıklayın.
   1. Grafikteki hücrelerin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlamak için FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın. Edinme'ye tıklayın ve ardından testi başlatmak için oynat düğmesine (üçgen şekli) tıklayın.
6. Akış sitometresi, her kuyucuktan sırayla ~50 μL 1000-3000 nötrofil örnekleyecektir. 384 oyuklu plakanın tamamının tamamlanması yaklaşık 3 saat sürecektir.
7. Tüm örnekleri tamamladıktan sonra, bir sonraki adım için .fcs dosyalarını dışarı aktarın.

6. Veri analizi

1. Akış sitometrisi veri analizi yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Tüm .fcs dosyalarını içeren klasörü seçin ve yazılım penceresine sürükleyin, ardından verileri yazılıma aktarmak için bırakın.
2. Bir örneğe çift tıklayın, Şekil ^28,29,30'te gösterildiği gibi^, açılan pencerede FSC ve SSC 3'a dayalı tek nötrofiller açın. Geçitli satırları seçin ve klasöre sürükleyin, ardından geçiti bu klasördeki tüm örneklere uygulamak için bırakın.
3. Yazılımın tablo düzenleyici işlevini kullanarak her bir kuyucuktan nötrofillerin APC medyan floresan yoğunluğunu (MFI) hesaplayın ve dışa aktarın. Düzenle sekmesi altındaki Sütun Ekle'ye tıklayın. İstatistik sekmesinde Medyan'ı seçin, geçitli popülasyon nötrofillerini seçin ve parametre olarak APC'yi seçin. Tamam düğmesine tıklayın.
4. "Tablo düzenleyici" sekmesine dönün, "Grup" sekmesinde Tüm Örnekler'i seçin ve Tablo oluştur düğmesine basın. Oluşturulan tabloyu gösteren yeni bir pencere açılacaktır. Metin, CSV veya Excel dosyası olarak kaydedin.
5. Dışa aktarılan tabloyu açın, pozitif ve negatif kontrol numuneleri için APC MFI'nin ortalama değerini ve standart sapmasını hesaplayın (Şekil 4).
6. Denklemi kullanarak plakanın Z' faktörünü (Z') hesaplayın:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   burada_σ p ve σ n sırasıyla pozitif ve negatif kontrollerin standart sapmalarıdır ve μ_p ve μ_n sırasıyla pozitif ve negatif kontrollerin ortalamalarıdır ³¹.
   NOT: Z' faktörü, pozitif ve negatif kontrol dağılımlarının ayrıldığını gösterir. 0'lık bir Z' ayrılık olmadığı anlamına gelirken, 0.5'lik bir Z' eşit ayrılmayı gösterir. Daha önceki bir çalışmada³¹ belirtildiği gibi, Z' > 0.5, bileşik tarama için mükemmel bir testi gösterir. 0,5 ila 0 aralığında bir Z' kabul edilebilir, ancak tahlilde yalnızca ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirecek güçlü isabetleri tanımlayabilir.
7. Bileşikle muamele edilmiş nötrofillerin APC MFI'si, pozitif kontrol MFI'sinden çıkarılan pozitif kontrol MFI'sinin standart sapmasının üç katından düşük olduğunda, bileşikleri tarama için "isabet" olarak düşünün (P = 0.0013, Şekil 4'teki noktalı çizgi ile temsil edilir).

Results

Temsili bir 384 oyuklu plaka taramasından elde edilen veriler (Şekil 4), negatif kontrollerin MFI'sinin 3236 ± 110 mAb24-APC'ye sahip olduğunu, pozitif kontrollerin ise 7588 ± 858'lik bir mAb24-APC MFI'sine sahip olduğunu ortaya koydu. Bu plaka için Z' faktörü yaklaşık 0.33'tür ve bu kabul edilebilir bir^{aralık 31'dir}. Bununla birlikte, Z' ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirir.

Verileri normalleştirmek için, tüm değerler pozitif ortalamaya maksimum 1 ve negatif ortalamaya minimum 0 değeri atayacak şekilde ölçeklendirildi. Z' faktörü, ikincil tahlillerde daha titiz bir doğrulamaya tabi tutulacaktır. Bu plaka için kesme değeri 0.41 olarak ayarlanmıştır, bu da 0.41'den düşük bir nispi MFI'ye sahip numunelerin, insan nötrofillerinde fMLP ile indüklenen β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden isabetler olarak kabul edileceği anlamına gelir. Bu plakadan herhangi bir isabet tespit edilmedi.

Protokolün etkinliğini doğrulamak için, Rac-1 fonksiyonunu antagonize ederek β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden Nexinhib20 ve integrin αLβ2'yi doğrudan^32,33 antagonize eden lifitegrast kullanıldı. Bununla birlikte, inkübasyon süreleri Nexinhib20 için bir saat ve lifitegrast için yarım saat olarak ayarlandı. Bu deneylerden elde edilen veriler, yukarıda açıklanan aynı ölçeklendirme yöntemi kullanılarak normalleştirildi. Bu veri noktaları daha sonra plaka sonuçlarıyla birleştirildi ve toplu olarak analiz edildi (Şekil 4).

Şekil 1: Bileşik tarama için plaka düzeni. 384 oyuklu bir plakada tarama bileşiklerinin ve kontrollerin düzenini gösteren şematik bir diyagram. Negatif kontrol kuyuları mavi (sütun 1 ve 23) ve pozitif kontrol kuyuları kırmızı (sütun 2 ve 24) ile gösterilmiştir. Test kuyucukları bej renkle temsil edilir (sütun 3 ila 22). Oklar, plakayı okuma sırasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Yoğunluk gradyanlı ortam kullanılarak nötrofil ayrımı. Yoğunluk gradyan ortamı kullanılarak nötrofillerin başarılı ve başarısız ayrılmasını gösteren temsili fotoğraflar. (A) Başlangıçta, 4 mL kan, 8 mL yoğunluk gradyan ortamı üzerine katmanlanır. (B) Santrifüjlemeden sonra, iki bulutlu bant görünmelidir: esas olarak periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) içeren üst bant ve bazı kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) ile çoğunlukla nötrofilleri içeren alt bant. RBC'lerin çoğu altta peletlenir. (C) RBC'lerin peletlenmediği ve nötrofil bandının gözlenmediği başarısız bir ayırma. Nötrofil bandını ayırmak için ek santrifüjleme (10-30 dakika) gerekecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: FSC/SSC grafikleri kullanılarak nötrofillerin geçitlenmesi. Nötrofilleri tanımlamak için geçit stratejisini gösteren temsili ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) grafikleri. (A) Nötrofiller, akış sitometresi tarafından kaydedilen ileri saçılma (FSC-A) ve yan saçılma (SSC-A) alanına göre kapılanır. (B) Tek hücreler, ileri saçılmanın genişliğine (FSC-W) ve yüksekliğine (FSC-H) ve (C) yan saçılmanın genişliğine (SSC-W) ve yüksekliğine (SSC-H) göre daha fazla geçitlenir. Renk skalası, yoğunluk azaldıkça kırmızıdan sarıya, yeşile ve maviye geçiş yapan hücre yoğunluğunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tarama, temsili bir 384 oyuklu plaka ile sonuçlanır. Tarama, 0.3'lük bir Z' faktörü gösteren temsili bir 384 oyuklu plakadan kaynaklanır. Negatif ve pozitif kontroller sırasıyla mavi ve kırmızı noktalarla gösterilir. Çeşitli bileşiklerle muamele edilen test numuneleri bej noktalar olarak temsil edilir. Kesikli çizgi, isabetleri tanımlamak için ortalama floresan yoğunluğu (MFI) sınırını temsil eder. Test edilen bileşiklerin hiçbiri β2 integrin antagonistleri olarak tanımlanmadı, çünkü test edilen tüm bileşikler kesme çizgisinin üzerinde MFI değerleri gösterdi. Bilinen β2 integrin antagonistlerini farklı inkübasyon süreleriyle (1 saat boyunca Nexinhib20, yarım saat boyunca lifitegrast) test eden bağımsız deneylerden elde edilen sonuçlar bu şekilde sunulmak üzere bir araya getirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Nötrofil stimülasyonu ve boyamanın başlatılması ve sonlandırılması, nötrofillerin ve fiksatif PFA'nın eklenmesiyle belirlenir. Bu nedenle, nötrofillerin veya PFA'nın her sütuna pipetlenmesi arasında aynı zaman aralığının sağlanması çok önemlidir. Bu, her bir kuyucuktan nötrofillerin uyarılma ve boyama süresinin tutarlı kalmasını sağlar. Nötrofillerin kısa ömrü nedeniyle, donörlerden kan toplanmasından akış sitometrisinin tamamlanmasına kadar tüm deney aynı gün yapılmalıdır. Nötrofiller sıcaklık değişimlerine karşı oldukça hassastır ve 4 °C'den oda sıcaklığına veya oda sıcaklığından 37 °C'ye geçiş gibi hızlı sıcaklık artışlarına maruz kaldıklarında aktive olabilirler. Ek olarak, önceki deneyimlerimize dayanarak, fMLP kaynaklı nötrofil β2 integrin aktivasyonu, hücreler buz üzerinde veya 4 ° C'de depolandığında meydana gelmez (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, fiksasyondan önce, tam kan ve nötrofiller oda sıcaklığında veya 20 ° C'de tutulmalıdır (izolasyon santrifüj aşaması sırasında). Tam kan ve nötrofilleri buzun üzerine koymayın.

Negatif kontrollerde mAb24'ün boyanması çok düşük sonuçlar vermelidir. Bir deneyde yüksek bir mAb24 boyama seviyesi gözlemlenirse, lütfen aşağıdakileri kontrol edin: (1) fiksasyondan önce deney sırasında önemli bir sıcaklık değişikliği olup olmadığı; (2) nötrofil ortamında fMLP veya endotoksin kontaminasyonu olup olmadığı; (3) pipetleme ve karıştırma sırasında kabarcık oluşturmak gibi numune işlemenin çok agresif olup olmadığı.

Mevcut protokol, β24 integrin başlığının açıldığını bildirmek için mAb2 kullanır. Teorik olarak, β2 integrinlerinin 34,35 uzantısını bildiren bir monoklonal antikor olan KIM127^, β2 integrin konformasyonunu kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için mAb24 ile birlikte kullanılabilir. Bununla birlikte, KIM127 boyamanın (1,5 ila 2 kat) sinyal-gürültü oranı, 384 oyuklu plaka tahlilinde tipik olarak tatmin edici bir Z' faktörü sağlamayan mAb24'ünki (5 ila 10 kat) kadar elverişli değildir. 96 oyuklu plaka tahlilinde, akış sitometrisi yapılmadan önce numuneler yıkanabilir, bu da çözünür antikordan türetilen arka plan sinyallerini azaltır. Bu nedenle, KIM127 bazlı tahlil, 384 oyuklu plaka tahliline kıyasla daha düşük verime sahip olan 96 oyuklu plaka tahlilinde gerçekleştirilebilir.

Bu yöntem, ilaçların integrin inhibitör etkisini değerlendirmek için bir okuma olarak floresan yoğunluğunu kullandığından, bazı floresan ilaçlar sonuçlara müdahale edebilir. Ek olarak, 10 dakikalık stimülasyon süresi içinde nötrofil ölümünü indükleyen toksik ilaçların da integrin inhibisyonunu bildirdiği görülecektir. Nötrofil degranülasyonunu inhibe eden ilaçlar genel β2 integrin ekspresyonunu baskılayacaktır. Bu degranülasyon inhibitörleri de taramamızda tanımlanacaktır. Bu nedenle, isabetlerin inhibitör etkilerini doğrulamak için diğer kontrollerle ikincil taramaya ihtiyaç vardır. İkincil ekranlara, isabetlerin etki mekanizmasını hem doğrulamak hem de belirlemek için bir araç olarak başvurulur. mAb24 testlerinin tekrarlanmasına ek olarak, hücre yüzeyindeki toplam CD18 ekspresyonu, bir pan anti-insan CD18 antikoru kullanılarak değerlendirilecektir. mAb24 ile ölçülen aktif β2 integrin seviyesi, toplam CD18 ekspresyonu ile normalleştirilecektir. Bu, ajanın etki mekanizmasının antagonize edici integrin aktivasyonunu ve/veya hücre yüzeyinde CD18 ekspresyonunu inhibe etmeyi içerip içermediğini belirlememizi sağlayacaktır. İsabetlerin toksik etkilerini dışlamak için ikincil ekranda bir canlılık testi de yapılmalıdır.

Bu protokolün sınırlamaları vardır. İlk olarak, mAb24, β2 I benzeri alanı yalnızca integrinin yüksek afiniteli bir durumda olduğu durumlarda tespit edebilir. Bu nedenle, mAb24 bağlanmasını azaltarak lifitegrast gibi α/β I benzeri allosterik antagonistleri tanımlayamaz. Lifitegrast daha fazla mAb24 bağlanmasını^{indükler 32} ve mAb24 ile anormal derecede artmış bir MFI değeri gösterir (Şekil 4). Bu tür anormal değerler için, bu isabetlerin α/β I-benzeri allosterik antagonistler olup olmadığını doğrulamak için başka tahliller gerekebilir. İkincisi, bu tahlil için Z' faktörü yetersizdir ve otomatik pipetleme ve çalkalama kullanılarak potansiyel olarak geliştirilebilir. Ne yazık ki, laboratuvarımız bu hipotezi test etmek için gerekli donanıma sahip değildir. Tahlillerin çoğaltılması veya üçe küçe bölünmesi, Z' faktörünün yukarıdaki yöntemlerle daha da geliştirilememesi durumunda yanlış pozitiflerin ve negatiflerin belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Ayrıca, inhibitör etkiler üretmek için bir saatlik inkübasyon gerektiren bilinen β2 integrin aktivasyon inhibitörü Nexinhib20'de gözlemlendiği gibi, daha fazla isabet tanımlamak için inkübasyon süresini uzatmak faydalı olabilir. Bu çalışma, hızlı etkili ajanların belirlenmesine odaklanmıştır. Araştırmacılar, kuluçka süresini kendi özel ihtiyaçlarına göre değiştirebileceklerini unutmamalıdır.

Bildiğimiz kadarıyla, bu β2 integrin antagonistleri için ilk yüksek verimli tarama yöntemidir. Bu yaklaşım, β2 integrinlerine doğrudan bağlanan küçük moleküllü bileşikleri tanımlamak ve yakın zamanda αIIbβ3 ve α4β1²⁶ integrinleri için tanımlanan "agonistik" özelliklere sahip olmayan antagonistlere benzer şekilde orta/yüksek afiniteli integrin durumlarına yol açan konformasyonel değişiklikleri önlemek için kullanılabilir. Nötrofiller, miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı 36, sepsis³⁷ ve otoimmün hastalıklar^38,39 gibi birçok inflamatuar hastalıkta kritik öneme sahiptir. Küçük moleküllü ilaçlar, antikor bazlı ilaçlara kıyasla bu hastalıkların tedavisinde daha fazla esneklik sunabilir. Ekranımızdaki isabetler, enflamatuar hastalıklar için potansiyel tedaviler sağlayabilir.

Mevcut yöntem, floresan antikor bazlı, yüksek verimli bir ekrandır. β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 ve αL integrinleri^47,48,49,50 için aktivasyon raportör antikorları da mevcut olduğundan^, bu yöntem diğer integrinler için antagonistleri tanımlamaya genişletilebilir. β1 hibrid alanına 51,52,53 bağlanan HUTS-21 gibi konformasyonel olarak hassas bir antikor, çok geç antijen-4 (VLA-4^, integrin α4β1) allosterik antagonistlerini tanımlamak için yüksek verimli bir ekranda kullanılmıştır ⁵⁴. Mevcut tarama yöntemi, kistik fibroz (KF) hücrelerinde kistik fibroz transmembran iletkenlik regülatörü (CFTR) yüzey ekspresyonunu artıran bileşikler gibi diğer yüzey reseptörlerinin ekspresyonunu inhibe eden veya teşvik eden ilaçları bulmak için de değiştirilebilir ve genişletilebilir. KF'de, çoklu mutasyonlar CFTR'nin yanlış katlanmasına yol açar ve hücre zarında CFTR'nin ekspresyonunun olmamasına neden^{olur 55}. Küçük moleküllü ilaçların CFTR ekspresyonunu geri kazandırdığı gösterilmiştir⁵⁶. Protokol modifikasyonları için, protein ekspresyon değişikliklerinin meydana gelmesine izin vermek için ilaçların inkübasyon süresini birkaç saate çıkarmak gerekir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 kanallı pipetler	Thermo	4661090N	Alet
384 kuyulu plaka	Greiner	784201	Malzemeler
APC anti-insan CD11a/CD18 (LFA-1) Antikor Klonu: m24	BioLegend	363410	Reaktifler
Bravo  Otomatik Sıvı İşleme Platformu	Agilent	16050-102	384 çok kanallı sıvı işleyici
Santrifüj	Eppendorf	Model 5810R	Enstrüman
AkışıJo	Becton, Dickinson & Şirket	NA
Yazılımı İnsan Serumu Albümin Çözeltisi (%25)	GeminiBio	800-120	Reaktifler
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reaktifler
Nexinhib20	Tocris	6089	Reaktifler
N-Formil-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reaktifler
Paraformaldehit% 16 çözelti	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710	Reaktifler
Plaka kovaları	Eppendorf	UL155	Aksesuar
Plaka çalkalayıcı	Fisher	88-861-023	Enstrüman
PolimorfHazırlığı	PROGEN	1895 (önceki 1114683)	Reaktifler
Prestwick Kimya Kütüphanesi Bileşik Plakalar (10 mM)	Prestwick Kimya Kütüphaneleri	Ver19_384	1520 küçük molekül, %98 pazarlanan onaylı ilaçlar (FDA, EMA, JAN ve diğer kurumlar onaylı)
RPMI 1640 Orta, fenol kırmızısı yok	Gibco	11-835-030	Reaktifler
Salıncak kova rotoru	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Hücre Analiz Cihazı	Bio-Rad Laboratuvarları	Model ZE5	Cihazı