Peptitlerin Candida albicans'a Karşı Antifungal Aktivitesinin Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, peptitlerin ve küçük moleküllü antifungal ajanlar gibi diğer bileşiklerin Candida albicans'a karşı antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için bir yöntemi açıklar. Büyüme inhibisyonunu ölçmek için koloni oluşturan birimleri saymak yerine optik yoğunluk kullanımı, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlar.

Özet

Candida albicans için antifungal duyarlılık testi yapmak için geleneksel yöntemler zaman alıcıdır ve nicel sonuçlardan yoksundur. Örneğin, yaygın bir yaklaşım, agar plakaları üzerinde farklı konsantrasyonlarda antifungal moleküllerle muamele edilmiş hücrelerin kaplanmasına ve daha sonra molekül konsantrasyonu ile büyüme inhibisyonu arasındaki ilişkiyi belirlemek için kolonilerin sayılmasına dayanır. Bu yöntem, kolonileri saymak için birçok plaka ve önemli bir zaman gerektirir. Başka bir yaygın yaklaşım, büyümeyi engellemek için gereken minimum konsantrasyonu belirlemek için antifungal ajanlarla muamele edilen kültürleri görsel olarak inceleyerek plakaları ve kolonilerin sayımını ortadan kaldırır; Bununla birlikte, görsel muayene sadece kalitatif sonuçlar üretir ve subinhibitör konsantrasyonlarda büyüme hakkında bilgi kaybolur. Bu protokol, C. albicans'ın antifungal peptitlere duyarlılığını ölçmek için bir yöntem açıklar. Kültürlerin optik yoğunluk ölçümlerine dayanarak, yöntem farklı peptit konsantrasyonlarında kültür büyümesi üzerinde nicel sonuçlar elde etmek için gereken zamanı ve malzemeleri azaltır. Mantarın peptitlerle inkübasyonu, uygun bir tampon kullanılarak 96 delikli bir plakada, büyüme inhibisyonu ve tam büyüme inhibisyonunu temsil etmeyen kontrollerle gerçekleştirilir. Peptit ile inkübasyonu takiben, elde edilen hücre süspansiyonları peptid aktivitesini azaltmak için seyreltilir ve daha sonra gece boyunca büyütülür. Gece boyunca büyümeden sonra, her bir kuyucuğun optik yoğunluğu ölçülür ve her peptid konsantrasyonunda ortaya çıkan büyüme inhibisyonunu hesaplamak için pozitif ve negatif kontrollerle karşılaştırılır. Bu tahlili kullanan sonuçlar, kültürleri agar plakalarına kaplamanın geleneksel yöntemini kullanan sonuçlarla karşılaştırılabilir, ancak bu protokol plastik atıkları ve kolonileri saymak için harcanan zamanı azaltır. Bu protokolün uygulamaları antifungal peptitlere odaklanmış olsa da, yöntem bilinen veya şüphelenilen antifungal aktiviteye sahip diğer moleküllerin test edilmesine de uygulanacaktır.

Giriş

Candida albicans, ağız boşluğu, cilt, gastrointestinal sistem ve vajina¹ dahil olmak üzere çok sayıda yeri kolonize eden insan mikrobiyotasının bir üyesidir. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ve immünsüpresif tedaviler gibi hastalıklar nedeniyle bağışıklık sistemi baskılanmış hastalar için, C. albicans'ın kolonizasyonu lokal veya sistemik kandidiyazise yol açabilir ^2,3. Amfoterisin B, azoller veya ekinokandinler gibi şu anda mevcut olan küçük moleküllü antifungal terapötiklerin kullanımı, çözünürlük ve toksisite sorunları ve enfeksiyonların terapötiklere direnci ile k....

Protokol

Maryland Üniversitesi, College Park, Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nden (IBC) bu protokolde C. albicans ile yapılan çalışmalar için onay alınmıştır (PN 274). Bu çalışmada C. albicans suşu SC5314 (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır; Bununla birlikte, başka herhangi bir suş da kullanılabilir.

1. Tamponun, steril suyun ve kültür ortamının hazırlanması

1. pH 7,4'te steril 0,1 M sodyum fosfat tamponu (NaPB)²⁶ hazırlayın ve steril suyla 2 mM ve 1 mM'ye kadar seyreltin. 2 mM NaPB ve 1 mM NaPB'nin her biri 100 mL hazırlamak, bu protokolün çoğu uygulaması için f....

Sonuçlar

Antifungal peptitler nedeniyle büyümedeki azalmayı ölçmek için OD₆₀₀ ölçümlerinin kullanılması, numunelerin kaplanması ve CFU'ların sayılmasına kıyasla önemli ölçüde zaman kazandırır. Bu protokolde açıklanan yöntem, adımların üç farklı günde tamamlanmasını gerektirir. İlk gün, tamponları ve ortamları hazırlamak (sterilizasyon süresi hariç) ve C. albicans'ın başlangıç kültürünü gece boyunca inkübasyon için aşılamak için yaklaşık 1 saate ihtiyaç vardır. İkinci günde, adımlar 17 saatlik inkübasyon için 9.......

Tartışma

Bu protokol, mantar patojeni C. albicans'a karşı AMP'lerin antifungal aktivitesi hakkında nicel veriler elde etmek için etkili bir yaklaşımı açıklamaktadır. Peptitleri ve diğer antifungal ajanları test etmek için yaygın bir alternatif yaklaşım, Klinik Laboratuvar Standartları Enstitüsü'nün (CLSI) standardı M27^18'de açıklanan et suyu mikrodilüsyonudur, ancak bu standart nicel sonuçlar yerine nitel görsel sonuçlar elde etmeye odaklanmaktadır. Başka bir alternatif yaklaşım, peptitleri hazırl.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 kuyucuklu plakalar (yuvarlak altlı)	VWR	10062-902
Absorbans mikroplaka okuyucu	N/A	N/A	Mevcut herhangi bir mikroplaka okuyucu yeterlidir
C. albicans strain SC5314	ATCC	MYA-2876	Diğer C. albicans de kullanılabilir
Hemositometre	N/A	N/A	Hücre numarasını OD < alt > 600 < / alt ile ilişkilendiren standart bir eğri yapmak için kullanılabilir >
Mikroplaka çalkalayıcı	VWR	2620-926
Peptit (ler)	N / A	N / A	Peptitler, herhangi bir güvenilir satıcı tarafından ticari olarak sentezlenebilir; &ge saflığı; %95 ve trifloroasetik asit tuzunun hidroklorür tuzuna uzaklaştırılması önerilir
Çok kanallı pipetleyiciler için reaktif rezervuarları	VWR	18900-320	Çok kanallı pipetleyici ile çok kuyulu plakalara pipetlemeyi basitleştirir
Sodyum fosfat, dibazik	Fisher Scientific	BP332-500	NaPB yapmak için
Sodyum fosfat, monobazik	Fisher Scientific	BP329-500	NaPB yapmak için
UV spektrofotometresi	N/A	N/A	Mevcut herhangi bir UV spektrofotometresi yeterlidir
YPD orta toz	BD Life Sciences	242820	Maya özütü, pepton ve dekstrozdan da yapılabilir