Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Streptococcus pneumoniae (pnömokok), çoğu sağlıklı bireyin nazofarenksinde asemptomatik olarak bulunan Gram-pozitif bakterilerdir ^1,2. Tamamen tanımlanmamış faktörler tarafından teşvik edilen pnömokoklar, nazofarenksin iyi huylu kolonizatörlerinden, diğer organlara yayılan patojenlere geçebilir ve bu da otitis media, pnömoni ve bakteriyemi³ dahil olmak üzere ciddi enfeksiyonlara neden olabilir. Pnömokok hastalığı prezentasyonu, kısmen, kapsüler polisakkaritlerin bileşimine dayanan serotip de dahil olmak üzere suşa özgü farklılıklara bağlıdır. Şimdiye kadar karakterize edilen 100'den fazla serotip vardır ve bazıları daha invaziv enfeksiyonlarla ilişkilidir ^4,5. Diğer bazı faktörler pnömokok hastalığı riskini arttırır. Böyle bir faktör, pnömokok pnömonisi riskinin IAV ^6,7 ile 100 kat arttığı viral enfeksiyondur. Tarihsel olarak, S. pneumoniae, influenza sonrası sekonder bakteriyel pnömoninin en yaygın nedenlerinden biridir ve daha kötü sonuçlarla ilişkilidir⁸. Bir diğer önemli risk faktörü ileri yaştır. Aslında, S. pneumoniae, 65 yaşın üzerindeki yaşlı bireylerde toplum kökenli bakteriyel pnömoninin önde gelen nedenidir ^9,10. Yaşlı bireyler, pnömoni ve influenzaya bağlı ölümlerin çoğunluğunu (% >75) oluşturmaktadır, bu da iki risk faktörünün - yaşlanma ve IAV enfeksiyonu - sinerjik olarak hastalık duyarlılığını kötüleştirdiğini göstermektedir^11,12,13,14. Bununla birlikte, viral enfeksiyonun pnömokokların asemptomatik kolonizatörden invaziv patojene geçişini tetiklediği mekanizmalar ve bunun konakçı faktörler tarafından nasıl şekillendirildiği tam olarak tanımlanmamıştır. Bu, büyük ölçüde, asemptomatik pnömokok kolonizasyonundan kritik klinik hastalığa geçişi özetleyen küçük bir hayvan modelinin yokluğundan kaynaklanmaktadır.

Ko-enfeksiyon çalışmaları klasik olarak, influenza enfeksiyonundan 7 gün sonra doğrudan akciğerlere pnömokoklarla aşılanmış farelerde modellenmiştir^15,16. Bu, sekonder bakteriyel pnömoniye duyarlılığı yeniden üretir ve antiviral bağışıklık tepkilerinin antibakteriyel savunmayı nasıl bozduğunu incelemek için idealdir¹⁷. Bununla birlikte, insanlarda yapılan uzunlamasına çalışmalar, bakterilerin asemptomatik biyofilmler oluşturabildiği nazofarenkste pnömokok taşıyıcılığının¹⁸, invaziv hastalıklarla eşit şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir^19,20. Orta kulak, akciğer ve kan enfeksiyonlarından kaynaklanan bakteriyel izolatlar, nazofarenks^20'de bulunanlarla genetik olarak aynıdır. Bu nedenle, IAV enfeksiyonunu takiben asemptomatik taşıyıcılıktan invaziv hastalığa geçişi incelemek için, farelere intranazal olarak biyofilm ile yetiştirilen pnömokokların uygulandığı ve ardından nazofarenksin IAV enfeksiyonunun uygulandığı bir model oluşturulmuştur^21,22. Üst solunum yolunun viral enfeksiyonu, konakçı ortamda, pnömokokların biyofilmlerden dağılmasına ve alt solunum yollarına yayılmasına yol açan değişikliklere yol açmıştır²¹. Bu dağınık bakteriler, enfeksiyon için önemli olan virülans faktörlerinin ekspresyonunu yukarı regüle etmiş, onları kolonizatörlerden patojenlere dönüştürmüştür²¹. Bu gözlemler, virüs, konakçı ve bakteriler arasındaki karmaşık etkileşimi vurgulamakta ve viral enfeksiyon tarafından tetiklenen konakçıdaki değişikliklerin pnömokok davranışı üzerinde doğrudan bir etkiye sahip olduğunu ve bunun da bakteriyel enfeksiyonun seyrini değiştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu model insanlarda gözlenen ciddi hastalık belirtilerini özetlemekte başarısız olur, çünkü muhtemelen virüs burun boşluğu ile sınırlıdır ve viral enfeksiyonun konakçı bağışıklığı ve akciğer hasarı üzerindeki sistemik etkileri özetlenmemiştir.

Son zamanlarda, konakçı ve patojenler arasındaki karmaşık etkileşimi içeren, aynı zamanda insanlarda gözlenen hastalık şiddetini daha yakından taklit eden bir model oluşturduk²³. Bu modelde, fareler ilk önce asemptomatik taşıyıcılık oluşturmak için biyofilm ile yetiştirilen pnömokoklar ile intranazal olarak enfekte edilir, ardından hem nazofarenks hem de akciğerlerin IAV enfeksiyonu izlenir. Bu, akciğerlere bakteriyel yayılım, akciğer iltihabı ve genç farelerin bir kısmında ölümcüllüğe ilerleyen hastalıklarla sonuçlandı²³. Bu önceki çalışma, hem viral hem de bakteriyel enfeksiyonun konak savunmasını değiştirdiğini göstermiştir: viral enfeksiyon bakteriyel yayılımı teşvik etti ve önceki bakteriyel kolonizasyon, konağın pulmoner IAV seviyelerini kontrol etme yeteneğini bozdu²³. İmmün yanıtın incelenmesi, IAV enfeksiyonunun nötrofillerin antibakteriyel aktivitesini azalttığını, bakteriyel kolonizasyonun ise antiviral savunma için kritik olan tip I interferon yanıtını körelttiğini ortaya koymuştur²³. Daha da önemlisi, bu model yaşlanmanın duyarlılığını yeniden üretti. Genç farelerle karşılaştırıldığında, yaşlı fareler daha erken hastalık belirtileri gösterdi, daha ciddi klinik hastalık gösterdi ve enfeksiyona daha sık yenik düştü²³. Bu makalede sunulan çalışma, hastalığın derecesinin bakteriyel suşa da bağlı olduğunu göstermektedir, çünkü invaziv pnömokok suşları IAV enfeksiyonu üzerinde daha etkili yayılım gösterir, pulmoner inflamasyonun daha açık belirtilerini gösterir ve invaziv olmayan suşlara kıyasla daha hızlı hastalık oranlarına neden olur. Bu nedenle, bu S. pneumoniae / IAV ko-enfeksiyon modeli, hem patojen hem de konakçı faktörlerin ayrıntılı olarak incelenmesine izin verir ve hastalık progresyonunun farklı aşamalarında polimikrobiyal enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerini incelemek için çok uygundur.

Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm prosedürler Buffalo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Kimyasal olarak tanımlanmış ortamın (CDM) hazırlanması

1. Stokları aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım I bileşiklerini 100 mL ultra saf suda çözün. −20 °C'de 200 μL alikotlarda saklayın.
   2. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım II bileşiklerini 20 mL 0.1 M NaOH'da çözün. −20 °C'de 100 μL alikotta saklayın.
   3. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım III bileşiklerini 1 mL ultra saf suda çözün. 4 °C'de 10 μL aliquots'ta saklayın.
   4. Karıştırırken Tablo 1'de listelenen karışım IV bileşiğini 1 mL ultra saf suda çözün. −20 °C'de 10 μL alikotta saklayın.
   5. Karıştırırken Tablo 2'de listelenen bileşikleri başlangıçta 15 mL ultra saf suda çözün. Birkaç damla 0,1 M NaOH ile pH'ı 7,0'a ayarlayın ve ultra saf su kullanarak son hacmi 20 mL'ye ayarlayın. −20 °C'de 1 mL alikotta saklayın.
   6. Karıştırma sırasında Tablo 3'te listelenen bileşikleri 90 mL ultra saf suda 50 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde çözün. PH'ı 0,1 M NaOH ile 7,0'a ayarlayın ve ardından ultra saf su kullanarak son ses seviyesini 100 mL'ye ayarlayın. −20 °C'de 5 mL alikotta saklayın.
2. Karıştırırken Tablo 4'teki bileşikleri 70 mL ultra saf suda çözerek marş stoğunu her seferinde taze yapın.
3. Taze başlangıç stoğuna aşağıdaki karışım stoklarını sırayla ekleyin: 200 μL Mix I stoğu (Tablo 1), 80 μL Mix II stoğu (Tablo 1), 10 μL Mix III stoğu (Tablo 1), 10 μL Mix IV stoğu (Tablo 2), 1 mL Vitamin stoğu (Tablo 3) ve 5 mL Amino Asit stoğu (Tablo 4).
4. Stoklar eklendikten sonra, behere 30 mL ultra saf su ekleyerek son hacmi 100 mL'ye ayarlayın.
5. CDM'yi Tablo 4'teki bileşiklerle destekleyin. İyice karıştırıldıktan sonra, filtre sterilize edin ve maksimum 2 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.

2. S. pneumoniae biyofilminin yetiştirilmesi

1. RP-10 ortamını, 445 mL RPMI 1640'ı sırasıyla 10.000 U/mL ve 10.000 μg/mL'de 50 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL penisilin/streptomisin ile karıştırarak hazırlayın.
2. NCI-H292 (H292) mukoepidermoid karsinom hücre hattını büyütün. Satın alınan bir şişedeki hücreleri, T-25 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişede 5 mL RP-10 ortamına ekleyin. %100 birleşmeye ulaşmak için 37 °C/%5 CO_2'de 3-5 gün boyunca inkübe edin.
3. Akıcılığı değerlendirmek için 10x büyütme kullanarak hücreleri ışık mikroskobu altında kontrol edin.
   NOT: Tüm hücreler diğer hücrelerle temas halinde olduğunda ve aralarında boşluk olmadığında, istenen %100 akıcılığa ulaşılır.
4. Hücreleri 5 mL oda sıcaklığında PBS'de 2 kat yıkayın. Bir sonraki adımda EDTA'nın şelatlamasını önlemek için tamponun kalsiyumsuz olduğundan emin olun.
5. Şişeye 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 5-10 dakika boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de inkübe edin. 4 mL RP-10 ortamı ile nötralize edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın ve 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
6. Doku kültürü ile muamele edilmiş 24 delikli bir plakaya kuyucuk başına 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Akıcı bir T-25 şişesinden, 2 × 10 6-4 × 10⁶ hücre / mL bekleyin.
7. Ertesi gün, adım 2.3'te olduğu gibi birleştiklerinden emin olmak için hücreleri ışık mikroskobu altında kontrol edin. Değilse, daha uzun süre inkübe edin.
8. H292 hücreleri 24 delikli plakada% 100 birleştiğinde, antibiyotik veya döküntü içeren hiçbir ortamın kalmadığından emin olmak için hücreleri 1 mL oda sıcaklığında PBS ile 3 kat hafifçe yıkayın.
9. Hücreleri yıkadıktan sonra, hücreleri sabitlemek için 250 μL / kuyucuk% 4 paraformaldehit ekleyin. Buz üzerinde 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
10. Hücre fiksasyonundan önceki gece, S. pneumoniae suşunu kan agar plakalarına çizin ve gece boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de inkübe edin.
    NOT: Burada sunulan veriler, işbirlikçi değişim yoluyla elde edilen aşağıdaki S. pneumoniae suşları ile ilgilidir: serotip 19F otitis media izolatı EF3030 24, klasik serotip 2 Avery suşu D39²⁵ ve serotip 4 bakteriyemi izolatı^{TIGR4 26}. Suşlar, Malzeme Tablosunda atıfta bulunulan genel koleksiyonlardan da temin edilebilir.
11. 20 mL CDM'ye 100 μL oksiraz (30 U/mL) ekleyerek CDM artı oksiraz (0,15 U/mL) hazırlayın.
    NOT: Oksiraz, sıvı kültürde S. pneumoniae'nin verimli büyümesini sağlamak için oksijeni ortadan kaldırmak için kullanılır²⁷.
12. 1 mL CDM + oksiraz ekleyerek bakterileri plakadan yıkayarak ve 1 mL'lik bir pipet ucunun kenarını kullanarak bakteri kolonilerini hafifçe kaldırarak, agar'ı kazımamaya dikkat ederek bakterileri plakadan taze CDM + oksiraza aşılayın. Alternatif olarak, bakterileri kaldırmak ve bunları 1 mL CDM + oksiraz içeren bir tüpe aşılamak için bir aşılama döngüsü kullanın.
13. CDM + oksirazdaki bakterileri 0.05'lik bir başlangıç OD_600'üne seyreltin.
14. Bakterileri, 0.2'lik bir OD_600'e ulaşılana kadar 37 ° C / % 5 CO 2'de duran gevşek kapaklı 50 mL'lik bir konik tüpte büyütün (bu_2-5 saat arasında herhangi bir yerde sürecektir). OD'nin 0,2'yi geçmediğinden emin olmak için OD_600'ü saatte bir kontrol edin.
15. OD 0.2'ye ulaştığında, bakteri kültürü tüpünü vorteks. Sabit H292 hücrelerine 0.5 mL bakteri tohumlayın ve kuyucuk başına 0.5 mL CDM + oksiraz ortamı ekleyin. Bakteri içermeyen kontrol kuyucuklarına 1 mL CDM + oksiraz ekleyin. Plakayı 34 °C/%5 CO_2'de 48 saat inkübe edin.
    NOT: 34 °C'de büyüme, nazofarenks^21'deki düşük sıcaklığı daha yakından taklit etmek için kullanılır.
16. İlk tohumlamayı takiben her 12 saatte bir, ortamın 0.5 mL'sini yavaşça çıkarın ve 0.5 mL taze CDM + oksiraz ile doldurun. Oluşturan biyofilmi bozmamaya dikkat edin. Biyofilm için plakanın altını kontrol edin ve biyofilmin büyümesi nedeniyle zaman geçtikçe artan bulanıklığa bakın. Kirlenmeyi kontrol etmek için, kontrol kuyularının temiz kaldığından emin olmak için kuyuları bakteri içermeyen kontrol edin.
17. Aşılamadan 48 saat sonra, süpernatantı çıkarın ve 1 mL PBS ile 2x çok nazikçe yıkayın. Biyofilmi kaldırmak için 1 mL taze CDM ve pipeti kuvvetlice yukarı ve aşağı doğru askıya alın. Her bakteri suşu için, bakterileri tüm kuyucuklardan 50 mL'lik bir konik tüpe toplayın. Sıkıca kapatılmış tüpü birkaç kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe eğerek iyice karıştırın.
18. 50 mL konik tüpe,% 20 gliserol nihai konsantrasyonuna sahip bir bakteri süspansiyonu elde etmek için CDM'de eşit hacimlerde% 40 gliserol ekleyin. 1 mL'yi mikrosantrifüj tüplerine alın, kuru buzda flaş dondurun ve -80 ° C'de tasarruf edin.
19. Kullanmadan önce, buz üzerinde bir alikotu çözerek, tüpü 5 dakika boyunca 1.700 × g'da döndürerek, süpernatanı çıkararak, peleti 1 mL PBS'de yeniden askıya alarak ve seri seyreltmeleri kan agar plakaları²⁸ üzerine kaplayarak bakterileri numaralandırın.
20. Agar plakalarını gece boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de büyütün ve koloni oluşturan birimlerde (CFU) / mL'de bakteri konsantrasyonunu elde etmek için kolonileri ilgili seyreltmelerde sayın.
    NOT: İlk 24 saat içinde bakteri canlılığında bir düşüş olduğu için stoklardaki bakterilerin donmadan en az bir gün sonra veya daha sonra numaralandırılması önerilir. Saklanan dondurulmuş alikotlar, en fazla 2 ay boyunca farelerin sonraki enfeksiyonu için kullanılabilir.

3. Biyofilm ile yetiştirilen S. pneumoniae ile farelerin intranazal aşılaması

1. Fareleri satın alın ve istediğiniz yaşta kullanın.
   NOT: Genç konakçıları modellemek için 3-4 aylık fareler tercih edilir ve 29 yaş >65 yaş yaşlı bireyleri modellemek için^21-24 aylık fareler kullanılabilir. Burada sunulan veriler C57BL/6 erkek farelere aittir.
2. Biyofilm tarafından yetiştirilen bakteriyel alikotları buz üzerinde çözün ve 5 dakika boyunca 1.700 × g'da döndürün. Peletleri bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın, peleti 1 mL PBS'de yeniden askıya alarak bakterileri yıkayın ve 5 dakika boyunca 1.700 × g'da tekrar döndürün. Süpernatantı çıkarın ve peleti istenen konsantrasyona ulaşmak için gereken hacimde yeniden askıya alın (intranazal aşılama için 5 × 10⁶ CFU / 10 μL'yi hedefleyin). Hazırlanan inokulumun 2.19. adımda olduğu gibi kan agar plakaları üzerine kaplanmasıyla uygulanan bakteri miktarlarını onaylayın.
3. Seyreltilmiş inokulumun 5 μL'sini her bir narise pipetleyerek fareleri intranazal olarak 5 ×^{10 6} CFU ile aşılayın. Fareleri sıkıca tuttuğunuzdan emin olun, hacim solunana kadar kafayı stabilize edin (tipik olarak hacmi nares'e pipetledikten sonraki saniyeler içinde). İnokulumun pulmoner aspirasyonunu önlemek için anestezi yokluğunda bu adımı uygulayın.

4. İnfluenza A virüsü (IAV) ile viral enfeksiyon

1. S. pneumoniae ile intranazal aşılamayı takiben 48 saatte, buz üzerinde ilgilenilen IAV suşunu çözün.
   NOT: Burada sunulan veriler, işbirlikçi değişim 30 yoluyla elde edilen influenza A virüsü A / PR / 8/³⁴ H1N1'in fareye uyarlanmış bir suşu ile ilgilidir.
2. Virüs çözüldükten sonra, PBS'deki virüsü istenen konsantrasyona seyreltin; intratrakeal enfeksiyon için 20 plak oluşturucu ünite (PFU)/50 μL ve intranazal enfeksiyon için 200 PFU/10 μL hedeflenmiştir. Alay ile enfekte olmuş ve yalnızca bakteri içeren gruplar için, fareleri aşılamak için PBS kullanın.
3. Oftalmik kayganlaştırıcıyı anesteziden önce farelerin gözlerine yerleştirin. Fareleri% 5 izofluran kullanarak uyuşturun ve sıkı bir ayak parmağı sıkışmasıyla anesteziyi onaylayın.
4. Hayvan uyuşturulduktan sonra, izofluran odasından çıkarın ve dili ağızdan çıkarmak ve sıvı hacmini trakeadan aşağı pipetlemek için künt cımbız kullanarak anestezi altındaki farelere derhal 50 μL (20 PFU) IAV intratrakeal olarak bulaştırın.
5. Fareleri ayrı bir kafese yerleştirin ve tamamen iyileşene kadar izleyin (sternal yatmayı koruyabilirler [göğsün üzerine dik durabilirler]).
6. İyileşmeyi takiben, adım 3.3'teki aşılama yöntemini kullanarak fareleri derhal intranazal olarak 10 μL (200 PFU) IAV ile aşılayın.
7. Aynı enfeksiyon grubuyla tek veya çift bakteriyel ve viral enfeksiyon geçirmiş ev fareleri ve onları diğer gruplardan ayırır.

5. Farelerin hastalık belirtileri açısından izlenmesi

1. Fareleri en az 10 gün boyunca günlük olarak izleyin ve aşağıdaki gibi hastalık belirtileri için körü körüne puan alın:
   1. Kilo kaybı için aşağıdaki gibi puan: 0 =% 5 veya daha az; 1 = %5-%10; 2 = %10-%15; 3 = %20 veya daha fazla. Kilo kaybı skoru 3 olduğunda CO₂ inhalasyonu kullanarak fareleri ötenazi yapın.
   2. Etkinlik için aşağıdaki gibi puan: 0 = normal/aktif; 1 = hareketli ancak biraz azalmış; 2 = azalmış; 3 = ciddi şekilde azalmış / uyuşuk (sadece dokunulduğunda hareket eder), 4 = koma / hareketsiz. Aktivite puanı 3 olduğunda fareleri ötenazi yapın.
   3. Duruş için aşağıdaki gibi puan: 0 = önsezi yok (normal); 1 = hafif kambur duruş; 2 = şiddetli önsezi. Duruş skoru 2'de olduğunda fareleri ötenazi yapın.
   4. Gözler için aşağıdaki gibi puan: 0 = normal; 1 = çıkıntılı; 1 = batık; 1 = kapalı; 1 = deşarj. Bu bir kombinasyon olabilir. Son göz skoru için toplamları ekleyin.
   5. Nefes almak için aşağıdaki gibi puan: 0 = Normal solunum; 1 = düzensiz veya değiştirilmiş (daha yüksek/daha düşük oran); 2 = emek harcandı (abartılı çaba veya nefes alma). Solunum skoru 2'de olduğunda fareleri ötenazi yapın.
2. Yukarıdaki kriterlere dayanarak, toplam sağlıklı (0) klinik skor için bireysel puanları aşırı hastaya (15) ekleyin. Toplam puanı 2'nin üzerinde gösteren herhangi bir farenin hasta olduğunu düşünün. Toplam puanı 9'un üzerinde veya her kriter için belirtilen puanları gösteren fareleri insancıl olarak ötenazi yapın ve hayatta kalma eğrisinde işaretleyin.

6. Bakteriyel numaralandırma için enfekte dokuların işlenmesi

1. IAV enfeksiyonunu takiben 48 saatte, fareleri ötenazi yapın.
2. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. % 70 etanol kullanarak, kürkü temizlemek için farenin göğsüne ve karnına püskürtün. Forseps kullanarak, kürkü ve cildi farenin ortasına sıkıştırın ve bölgeyi karaciğerden göğsüne kadar açığa çıkarmak için kürkü diseksiyon makaslarında 4.5 ile kesin.
3. Kan alımı
   1. Diseksiyon makası kullanarak, karaciğeri açığa çıkarmak için periton boşluğuna yavaşça kesin. Forseps kullanarak, karaciğerin tepesindeki hepatik portal veni diyaframın yakınında açığa çıkarın. Diseksiyon makası kullanarak hepatik portal veni kesin. Kan periton boşluğunda birikmeye başladığında, bir mikropipet kullanarak 10 μL kan toplayın ve bakteri yükünü kaplamak için bir mikrosantrifüj tüpünde 90 μL antikoagülan çözeltisine (PBS'de 50 mM EDTA çözeltisi) yerleştirin.
   2. Kanın geri kalanını toplamak için bir P-1000 mikropipeti kullanın, bir kan toplama tüpüne yerleştirin ve serumu toplamak için 2 dakika boyunca 7.600 × g'da santrifüj yapın. İstenilen herhangi bir sitokin veya metabolitin daha sonraki analizi için serumu -80 ° C'de mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
4. Akciğer koleksiyonu
   1. Diseksiyon makası kullanarak, açıkta kalan göğüs kafesinin kenarlarını kesin ve kalbi açığa çıkarmak için kaburgaları yavaşça farenin başına doğru çekin. PBS ile önceden doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 25 G'lik bir iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve yavaşça karıştırmaya başlayın. Başarılı perfüzyonun bir göstergesi olarak akciğerlerin ağartılmasını arayın. Akciğer dokusunun kırılmasını önlemek için yavaşça yıkayın.
   2. Kalbi forseps ile kaldırın ve akciğerleri ve kalbi ayırmak için bir kesim yapın. Ayrıldıktan sonra, akciğerin tüm loblarını forseps ile toplayın ve kalan kanı çıkarmak için steril PBS içeren bir tabakta durulayın. Bir Petri kabında, akciğerleri küçük parçalara ayırın ve iyice karıştırın. Bakteriyel CFU veya viral PFU'nun belirlenmesi için akciğer karışımının yarısını çıkarın ve homojenizasyon için 0,5 mL PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak tabanlı 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
      NOT: Çeşitli değerlendirmeler için aynı akciğerin farklı loblarını almamak önemlidir. Bunun yerine, tüm loblar kıyılmalı, birlikte iyice karıştırılmalı ve farklı değerlendirmeler için eşit olarak ayrıştırılmalıdır.
   3. Akciğerin diğer yarısını akış sitometrisi için çıkarın (aşağıdaki bölüm 7) ve her bir kuyucuk 0.5 mL RP-10 ile önceden doldurulmuş doku kültürü ile muamele edilmemiş 24 delikli bir plakaya yerleştirin. İşleme girene kadar oda sıcaklığında bırakın.
5. Nazofarenks koleksiyonu
   1. Boyunda, kürkü kesmek için diseksiyon makasını kullanın ve ardından kası kesin ve trakeayı açığa çıkarın.
      NOT: Trakea, kas altında bulunan tüp benzeri bir yapıdır.
   2. Trakeanın altına, stabilize etmek için farenin çenesinden 1 cm mesafede küçük forsepsler yerleştirin. Diseksiyon makası kullanarak, trakeanın ön kısmında yavaşça 0.1 cm'lik bir yarık açın ve trakeayı tamamen kesmekten kaçının.
   3. 25 G iğneye bağlı 0,58 mm boru ile 0,5 mL PBS ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırınga hazırlayın. Tüpü nazofarenkse doğru yukarı doğru giden trakeaya sokarak burun yıkamayı toplayın. Burun boşluğuna direnç girildiği hissedildiğinde, buruna bir mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve burun lavajını toplamak için PBS'yi trakeadan yavaşça yıkayın.
   4. Fareyi yüzüstü bir konuma getirin. Farenin kafasını etanol ile püskürtün. Farenin kafa kemiğini ortaya çıkarmak için kürkü ve mistasyal pedi kesmek için diseksiyon makası kullanın.
   5. Diseksiyon makasını kullanarak, mandibulanın kenarlarını ve gözlerin arasını 1 cm kesin. Forseps kullanarak, burun boşluğunu ortaya çıkarmak için yüz kemiklerini yavaşça vücuttan çekin.
   6. Burun dokusunu nazikçe çıkarmak için forseps kullanın ve homojenizasyon için 0,5 mL PBS ile önceden doldurulmuş yuvarlak bir alt tüpe yerleştirin.
6. Toplanan dokuyu homojenize etmek için, önce homojenizatör probunu %70 etanol içine koyarak ve homojenizatörü %60 güçte 30 sn boyunca açarak temizleyin. Adımı steril suda 10 saniye tekrarlayın. Her dokuyu 1 dakika boyunca homojenize edin. Homojenizatör probunu her numune arasında steril suda ve her organ ile numune grubu arasında %70 etanol içeren taze bir tüpte temizleyin.
7. Bakteri sayılarının sayımı
   1. Tüm organlar toplandıktan ve homojenize edildikten sonra, kan agar plakaları üzerinde seri seyreltmeler yapın. Toplam CFU'yu hesaplamak için 10 μL kullanarak plaka kullanın ve her numune için mL cinsinden son hacmi not edin. Nazofarenks örneklerini, S. pneumoniae'nin büyümesini seçmek ve bu dokuyu kolonize eden diğer mikroorganizmaların büyümesini inhibe etmek için 3 μg / mL gentamisin ile desteklenmiş kan agar plakaları üzerine plakalayın. Gece boyunca 37 °C/%5 CO_2'de inkübe edin.
   2. Akciğer ve nazofarenks için bakteriyel CFU'yu numaralandırmak için, önce kan agar plakalarındaki kolonileri sayın. Ardından, mL başına miktarı ve toplam sayıyı hesaplamak için denklem (1) ve denklem (2) kullanın.
      mL başına miktar = 100 (1) × seyreltme faktörü × koloni sayısı
      Toplam sayı = mL başına miktar × numune başına toplam hacim (2)
      NOT: Denklem (1)'de, 10 μL kaplandığı için çarpmak için 100 kullanılır, bu da 1 mL'lik 100 katlı bir seyreltmedir. Denklem (2)'deki numune başına toplam hacim, organ başına 100 tespit sınırıyla sonuçlanan adım 6.7.1'den alınmıştır.
   3. Bakteriyel CFU'yu numaralandırmak için Bakteriyemi için, önce kan agar plakalarındaki kolonileri sayın. Ardından, mL kan başına miktarı belirlemek için denklem (3) kullanın.
      mL kan başına miktar = 100 × 10 × seyreltme faktörü × koloni sayısı (3)
      NOT: Denklem (3)'te, 100, 1 mL'lik 100 kat seyreltme olan 10 μL kaplanırken kullanılır ve 10, antikoagülanda kanın 1:10 seyreltilmesini gösterir. Bu, 1.000/mL'lik algılama sınırıyla sonuçlanır.

7. Akciğer örneklerinin akış sitometrisi için işlenmesi

1. Gerekli ortamı aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. RP-10'u adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
   2. RP-10'u 2 mg/mL kollajenaz ve 30 μL/mL DNaz I ile karıştırarak sindirim tamponu hazırlayın.
   3. 8.29 g NH₄Cl, 1 g NaHCO₃ ve 0.038 g EDTA'yı 1 L_H2O içinde çözerek lizis tamponu hazırlayın.
   4. 450 mL HBSS'yi 50 mL ısı ile aktive FBS ve 5 g sodyum azid ile karıştırarak 10x FACS tamponu hazırlayın.
   5. 450 mL HBSS'de 50 mL 10x FACS tamponunu seyrelterek 1x FACS tamponu hazırlayın.
2. Akciğer örneklerini adım 6.4.3'ten alın ve 24 delikli bir plakaya yerleştirin. Her bir oyuğa 500 μL sindirim tamponu ekleyin. 37 ° C /% 5 CO_2'de 45 dakikadan 1 saate kadar inkübe edin.
3. Her numune için 50 mL konik tüpleri 5 mL RP-10 ile önceden doldurun. Kuluçka bittiğinde, 50 mL konik tüpün üstüne 100 μm'lik bir filtre yerleştirin ve 1 mL RP-10 ile ıslatın.
4. Bir P-1000 mikropipet kullanarak, sindirilmiş akciğerleri hareket ettirin ve filtreye yerleştirin. Organı ezmek için 3 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın. Her seferinde 1 mL RP-10 ile 2 kat durulayın.
5. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C ve 327 × g'da döndürün. Süpernatantı aspire edin ve peleti 1 mL lizis tamponunda yeniden askıya alın. Kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına izin vermek için 3 dakika bekletin. 5 mL RP-10 ile nötralize edin.
6. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C ve 327 × g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin, peletleri 1 mL RP-10'da yeniden askıya alın ve numuneleri saymak için 10 μL alın.
7. Numuneleri 5 dakika boyunca 4 °C ve 327 × g'da döndürün. Süpernatantı aspire edin ve peleti RP-10'da 2 × 10 6-4 × 10⁶ hücre / mL'de yeniden askıya alın. Adım 7.9, Tablo 5 ve Tablo 6'da listelenen istenen hücre tipleri²³ için boyamak üzere 96 delikli bir plakaya her numuneden 60 μL ekleyin.
8. Plakayı 5 dakika boyunca 4 ° C ve 327 × g'da döndürün.
9. Bu arada, antikor ana karışımlarını, floresan eksi bir (FMO'lar) ve tek lekeli kontrolleri istenen antikorlarla hazırlayın. Polimorfonükleer lökositler (PMN'ler), makrofajlar, monositler, dendritik hücreler ve T hücreleri için boyama yapmak için, Tablo 5 ve Tablo 6'da listelenen antikorları ve son seyreltmeleri kullanın. Antikor karışımının toplam 100 μL/kuyucuk hacmini kullanın. Ana karışımın uygun hacmini ve gerekli bireysel antikorları belirlemek için tablolarda listelenen seyreltmeleri izleyin.
10. Spin tamamlandığında (adım 7.8), süpernatanı boşaltın, topakları antikor karışımlarının, FMO'ların veya tek lekeli kontrollerin 100 μL'sinde yeniden askıya alın ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
11. Kuyucuklara 150 μL FACS tamponu ekleyerek ve plakayı 4 ° C'de ve 327 × g'da 5 dakika boyunca döndürerek hücreleri 2 kat yıkayın.
12. Spin tamamlandığında, süpernatanı boşaltın, peletleri 100 μL sabitleme tamponunda yeniden askıya alın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
13. Kuyucuklara 150 μL FACS tamponu ekleyerek ve plakayı 4 ° C'de ve 327 × g'da 5 dakika boyunca döndürerek hücreleri 2 kat yıkayın.
14. 200 μL FACS tamponu ile etiketli FACS tüpleri hazırlayın. Peletleri 150 μL FACS tamponunda tekrar askıya alın. Her numuneyi 100 μm'lik bir filtre kullanarak karşılık gelen FACS tüpüne ayrı ayrı filtreleyin. Buz üzerinde veya 4 °C'de tutun ve analize hazır olana kadar ışıktan koruyun.
15. Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin.

8. IAV'nin numaralandırılması için plak tahlili

1. Gerekli ortamı aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. 2.5 g sığır serum albümini (BSA) 40 mL DMEM içinde çözerek ve çözünene kadar 10-20 dakika boyunca 37 ° C'de karıştırarak enfeksiyon ortamını hazırlayın. 460 mL DMEM'e filtre uygulayın-sterilize edin.
   2. 1.2 mg mikrokristalin selülozu sıvı ortamında 50 mL_H2O. Otoklav içinde çözerek% 2.4 mikrokristalin selüloz hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   3. 2.5 g BSA'yı 40 mL DMEM içinde çözerek ve 37°C'de 10-20 dakika karıştırarak %5 BSA DMEM hazırlayın. 50 mL'lik son hacim için kalan 10 mL DMEM'i ekleyin. Filtreleyin-sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
   4. 1 mL'lik %5'lik BSA DMEM'i 9 mL'lik 2x MEM ile karıştırarak 2x MEM/%0,5 BSA hazırlayın.
   5. 1:1 oranında %2,4 mikrokristalin selüloz ve 2x MEM/%0,5 BSA'yı 1 mg/mL TPCK (kimotripsin inhibitörü) tripsin ile karıştırarak düşük viskoziteli kaplama ortamı hazırlayın.
   6. 450 mL Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) ile 50 mL ısı ile inaktive FBS'yi karıştırarak EMEM/%10 FBS'yi hazırlayın.
2. Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücre hattını büyütün. Satın alınan bir şişedeki hücreleri, T-25 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişede 5 mL EMEM / % 10 FBS'ye ekleyin. Hücreler %100 birleşene kadar 37 °C/%5 CO_2'de 3-5 gün inkübe edin. Adım 2.3'teki gibi akıcılığı kontrol edin.
3. Kültür ortamını çıkarın ve atın ve 5 mL oda sıcaklığında PBS ile 2 kat durulayın. Şişeye 1 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılana kadar 10-15 dakika boyunca 37 °C / % 5 CO_2'de inkübe edin. Kaldırıldıktan sonra, 2 × 10⁵ hücre/mL'de bir hücre süspansiyonu elde etmek için 4mL EMEM / 10% FBS ile nötralize edin.
4. Plak tahliline başlamadan 1 gün önce, MDCK hücrelerini 12 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada, kuyu başına 1 mL askıya alınmış hücre ekleyerek (2 × 10⁵ hücre / kuyuda) tohumlayın.
   NOT: Kullanmadan önce hücrelerin %100 akıcılığa ulaştığından emin olun ve akıcılığa ulaşmak için gerekirse daha uzun süre inkübe edin.
5. Standart olarak kullanmak için, adım 8.1.1'de listelenen enfeksiyon ortamında IAV stoğunun (bilinen bir titrenin) 10 kat seri seyreltmesini (10^{6-10 1}) yapın. Üçlü olarak test etmek için her seyreltmeden 1,2 mL yapın.
6. Organ buz üzerinde homojenleşir. 2.000 × g'lık bir masa üstü santrifüj üzerinde döndürün ve berrak süpernatanı toplayın.
7. Adım 8.5'i, ancak adım 8.6'daki örneklerdeki süpernatant ile yineleyin.
8. Ortamı hücrelerden aspire edin ve tüm FBS'yi çıkarmak için 1 mL PBS ile 2 kat yıkayın.
9. Her bir standart seyreltmeden 300 μL ekleyin veya seri olarak seyreltilmiş numuneyi, en yüksek seyreltmeden başlayarak en düşüğe kadar her bir kuyucuğun kenarına nazikçe ekleyin ve bunu üçlü olarak yapın.
10. Plakaları inkübatöre 37 ° C / 5% CO_2'de yerleştirin, plakayı her 10 dakikada bir toplam 50 dakika boyunca sallayın. Onları inkübatöre düz bir şekilde yerleştirdiğinizden ve istiflemediğinizden emin olun.
11. 50 dakika sonra, hücreleri 1 mL PBS ile 2x yıkayın.
12. En düşük seyreltmeli ve virüssüz kuyular hariç her bir kuyucuğa 2 mL düşük viskoziteli kaplama ortamı ekleyin; Bunlara enfeksiyon ortamı ve tripsin ekleyin.
13. Çıplak gözle görselleştirilebilen plaklar elde etmek için plakayı 2-4 gün boyunca 37 ° C / % 5 CO_2'de inkübatöre geri yerleştirin.
14. Her bir kuyucuğa yandan hızlı bir şekilde 2 mL PBS ekleyerek plakaları yıkayın ve yerleşmiş düşük viskoziteli kaplama ortamını askıya almak için hafifçe çalkalayın.
15. Ortamı yavaşça pipetleyerek kuyudaki tüm sıvı hacmini atın.
16. Yıkamayı her bir oyuğa 2 mL PBS ile bir kez daha tekrarlayın ve ardından tüm sıvı hacmini nazik pipetleme ile atın.
17. Plakları sabitlemek için, her bir oyuğa 500 μL% 4 paraformaldehit ekleyin, çalkalayın ve 30 dakika bekletin.
18. 1 mL PBS ile yavaşça aşağı doğru yıkayın; Ardından, sıvıyı yavaşça atın.
19. Hücre tek katmanını örtmek için her bir kuyucuğa 500 μL% 1 kristal menekşe (suda seyreltilmiş) ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin.
20. 1 mL musluk suyu ile yıkayın. Kuyucuktaki tüm sıvıyı nazik pipetleme ile attığınızdan emin olun. Plakayı gece boyunca kuruması için bir bebek bezi pedi üzerine baş aşağı yerleştirin.
21. Plakları görsel olarak sayın ve görüntüleri mevcut herhangi bir görüntüleyiciye kaydedin.

Biyofilm ile yetiştirilen S. pneumoniae (Şekil 1A), anestezi yapılmamış farelere intranazal olarak verilen küçük bir 10 μL inokülum kullanılarak fareleri enfekte etmek için kullanıldı (Şekil 1B). Bu küçük hacimli inokulum, sistemik yayılımı önlerken (Şekil 2B, C, +sp grupları) nazofarenks (Şekil 2A, +sp grupları) ile sınırlı tutarlı pnömokok taşıyıcılığı ile sonuçlanır. İntranazal aşılamadan iki gün sonra, fareler, nazofarenks ve akciğerlere spesifik miktarların tutarlı bir şekilde verilmesini sağlamak için hem intranazal hem de intratrakeal olarak verilen murine uyarlanmış bir H1N1 influenza A virüsü A / PR / 8/34 (IAV) 22,30 ile enfekte edildi23.

Burada, model, bakteriyemiye ilerleyen pnömoni ile sonuçlanan invaziv suşlar olan TIGR4 ve D39 ve bir otitis media suşuolan EF3030 dahil olmak üzere farklı S. pneumoniae suşları ile intranazal olarak zorlanan farelerde viral enfeksiyonu takiben hastalığın seyrini karşılaştırmak için kullanılmıştır. S. pneumoniae/IAV ile birlikte enfekte olmuş farelerde hastalık prezentasyonu bakteriyel suşa bağlıydı (Şekil 2). Herhangi bir suş arasında nazofarenksin bakteri sayılarında anlamlı bir fark bulunmazken (Şekil 2A), S. pneumoniae TIGR4 ve D39, ancak EF3030 değil, IAV enfeksiyonundan 48 saat sonra akciğerlere yayılmıştır (Şekil 2B). S. pneumoniae TIGR4 ile intranazal olarak enfekte olmuş farelerin yüzde kırkı, akciğerlere bakteriyel yayılım gösterdi ve bunların yarısı, önceki bulgularla tutarlı olarak bakteriyemik hale geldi (Şekil2C) 23.

S. pneumoniae D39 ile intranazal olarak enfekte olmuş fareler daha etkili yayılma göstermiştir, çünkü birlikte enfekte olmuş farelerin% 100'ünde akciğerlere yayılma gözlenmiştir (Şekil 2B). S. pneumoniae TIGR4'e benzer şekilde, bunların yarısı bakteriyemi yaşadı (Şekil 2C). Genel sağkalımın izlenmesinde, bakteri suşundan bağımsız olarak, birlikte enfekte olmuş farelerin hayatta kalma oranı, test edilen tüm suşlar için tek başına S. pneumoniae ile tek başına meydan okunan farelerden önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 2D). Tek başına IAV ile mücadele eden kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında, intranazal olarak S. pneumoniae TIGR4 ve D39 ile enfekte olmuş, ancak EF3030 ile enfekte olmayan fareler, hızlandırılmış hastalık oranları göstermiştir. IAV enfeksiyonu sonrası 2. günde, farelerin% 30'u (D39) ve% 20'si (TIGR4) yenik düşerken, sadece IAV'li kontrol grupları 5. güne kadar yenilmeye başlamadı (Şekil 2D). S. pneumoniae EF3030 ve IAV ile birlikte enfekte olan fareler, yalnızca IAV kontrollerine benzer şekilde semptomları geciktirmiştir (Şekil 2D). Bu bulgular, ko-enfeksiyon modelinin bakteriyel suşa bağımlı genç sağlıklı farelerde hastalığa neden olduğunu göstermektedir, bu da hastalığın ilerlemesinin her adımında gerekli olan bakteriyel faktörleri araştırmak için idealdir.

Bu model, farklı S. pneumoniae suşları ile intranazal olarak aşılanmış farelerde IAV enfeksiyonunu takiben akciğerlerde çeşitli bağışıklık hücrelerinin varlığını (Şekil 3'teki hücre tipleri ve geçit stratejisi) değerlendirmek için kullanılmıştır. IAV enfeksiyonunu takiben akciğerlere dağılan D39 ve TIGR4 bakteri suşları, nötrofiller (PMN'ler) ve monositler gibi dolaşımdan enflamatuar bağışıklık hücrelerinin akışında bazal çizginin üzerinde (enfekte olmayan) önemli bir artışa neden olurken, EF3030 bunu yapmadı (Şekil 4A-C). Tek başına IAV enfeksiyonu, NK hücreleri ve gama-delta T hücreleri gibi viral enfeksiyona karşı konak savunması için önemli olan bağışıklık hücrelerinin akışında taban çizgisinin üzerinde anlamlı bir artışa neden olmuştur (Şekil 4A-C). Bu antiviral yanıtlar, viral meydan okumadan önce intranazal olarak S. pneumoniae ile enfekte olmuş farelerde anlamlı derecede körelmiştir (Şekil 4A-C). Bu, S. pneumoniae taşıyıcısının tip I interferonların üretimini körelttiğini ve konağın akciğerlerdeki IAV yüklerini kontrol etme yeteneğini bozduğunu bulan sitokin yanıtlarını değerlendiren önceki çalışmalarla tutarlıdır23. Bu bulgular, ko-enfeksiyon modelinin, mono ve polimikrobiyal enfeksiyonlarda bağışıklık tepkilerinin nasıl değiştiğini incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu model aynı zamanda S. pneumoniae TIGR4 ile intranazal olarak enfekte olmuş farelerde yaşlanmanın IAV enfeksiyonunu takiben hastalığın seyri üzerindeki etkisini değerlendirmek için de kullanılmıştır. Tek başına enfekte olmuş farelerde, viral titreler genç ve yaşlı kohortlar arasında değişmedi (Şekil 5A)23. Önceki çalışmalardaolduğu gibi 23, yaşlı fareler, daha yüksek klinik skorların gösterdiği gibi, genç meslektaşlarına kıyasla daha erken ve önemli ölçüde daha şiddetli hastalık belirtileri göstermiştir (Şekil 5B). Hastalık semptomlarıyla tutarlı olarak, S. pneumoniae ile aşılanan yaşlı fareler, IAV enfeksiyonundan sonraki 24 saat içinde daha hızlı ölmeye başladı ve hepsi hastalığa yenik düşerken, genç kontroller enfeksiyondan anlamlı derecede yüksek (% 33) bir oranda kurtuldu (Şekil 5C). Bu bulgular, ko-enfeksiyon modelinin savunmasız konakçılarda daha şiddetli hastalıkları tespit etmek için kullanılabileceğini ve ko-enfeksiyona direnç veya duyarlılık kazandıran konakçı faktörlerini araştırmak için ideal olduğunu göstermektedir.

Şekil 1: İmmün hücre akışı ve patojen yükünün değerlendirilmesi için ko-enfeksiyon ve organ işlemenin zaman çizelgesi. (A) Streptococcus pneumoniae, biyofilmlerde yetiştirilir. (B) Fareler, nazofarengeal taşıyıcılık oluşturmak için belirtilen biyofilm tarafından yetiştirilen S. pneumoniae suşunun 5 × 106 CFU'su ile intranazal olarak aşılanır veya tedavi edilmeden bırakılır. Kırk sekiz saat sonra, fareler ya PBS ile taklit edilir ya da intranazal olarak 200 PFU influenza A virüsü PR8 ve intratrakeal olarak 20 PFU alırlar. Fareler klinik hastalık skorları ve sağkalım için zaman içinde izlenir. (C) IAV enfeksiyonundan sonraki 48 saatte, farklı organlarda bakteriyel CFU veya viral PFU veya akciğerlerdeki bağışıklık hücresi akışı değerlendirilir. Kısaltmalar: CFU = koloni oluşturan birimler; PFU = plak oluşturan birimler; IAV = influenza A virüsü PR8; IT = intratrakeal; NP = nazofaringeal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: S. pneumoniae ile aşılanmış farelerin ikili intranazal/intratrakeal IAV enfeksiyonu, bakteriyel yayılmaya ve bakteriyel suşa bağlı hastalığa yol açar. Genç (10-12 haftalık) erkek C57BL/6 (B6) fareler Şekil 1'deki gibi enfekte oldu. (A) nazofarenks, (B) akciğerler ve (C) kandaki bakteri sayıları, IAV enfeksiyonundan 48 saat sonra belirlendi. (B,C) Yüzdeler, yayılma gösteren farelerin fraksiyonunu gösterir. (D) Sağkalım IAV enfeksiyonundan sonraki 10 gün boyunca izlendi. Grup başına (A,B) n = 5, (C) n = 11 ve (D) n = 6 fareden toplanan veriler gösterilir. Her daire bir fareye karşılık gelir ve kesikli çizgiler algılama sınırını gösterir. (A-C) *, Kruskal-Wallis testi ile belirlenen belirtilen gruplar arasında anlamlı bir fark (p < 0.05) olduğunu gösterir. (D) *, log-rank (Mantel-Cox) testi ile belirlenen bakteri suşu başına +sp ve Co-inf fareler arasında anlamlı bir fark (p < 0.05) olduğunu gösterir. Kısaltmalar: +sp = sadece belirtilen suşu kullanarak intranazal olarak bakterilerle enfekte olmuş fareler; Co-inf = IAV ile enfekte olmuş bakteriyel enfekte fareler; IAV = influenza A virüsü alan fareler; CFU = koloni oluşturan birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İmmün hücre geçit stratejisi. Akciğerler toplandı ve bağışıklık hücresi akışı akış sitometrisi ile belirlendi. Farklı hücre tiplerinin temsili geçit stratejisi gösterilmiştir. (A) CD45+, canlı tek hücreler (B) PMN'ler (Ly6G+, CD11b+), makrofajlar (Ly6G-, Ly6C-, F480+) ve monositler (Ly6G-, Ly6C+), (C) DC'ler (Ly6G-, CD11c+) ve NK hücreleri (NK1.1+, CD3-), (D) TCR- γΔ ve CD8 (CD8+, TCRβ+) ve CD4 (CD4+, TCRβ+) yüzdeleri ve yüzdeleri ) T hücreleri belirlendi. Kısaltmalar: SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; FSC-H = ileri saçılma-tepe yüksekliği; SSC-W = yan dağılım-tepe genişliği; L/D = canlı/ölü; FMO = floresan eksi bir; NK = doğal katil; PMN = polimorfonükleer lökosit; DC = dendritik hücre; TCR = T hücre reseptörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Pulmoner immün yanıtlar bakteriyel suşa bağımlıdır. Genç (10-12 haftalık) C57BL/6 erkek fareler ya enfekte olmamış, belirtilen Streptococcus pneumoniae suşu (+sp) ile tek başına aşılanmış, IAV (IAV) ile tek başına mücadele etmiş ya da S. pneumoniae ve IAV (Co-inf) ile birlikte enfekte olmuştur. IAV enfeksiyonundan kırk sekiz saat sonra (Şekil 1'deki deneysel tasarıma bakınız), akciğerler toplandı ve bağışıklık hücresi akışı, Şekil 3'teki geçit stratejisini takip eden akış sitometrisi ile belirlendi. (A) CD45 kapısı içinde belirtilen her hücre tipinin ortalama yüzdeleri, ısı haritasındaki tüm tedavi grupları için görüntülenir. (B) Her fare grubu için tedaviler arasında önemli farklılıklar gösteren hücre tiplerinin temsili nokta grafikleri gösterilir. (C) Belirtilen bağışıklık hücresi tiplerinin yüzdeleri gösterilir. Her daire bir fareye karşılık gelir. (A,C) Grup başına n = 5 fareden toplanan veriler gösterilir. *, Co-inf ve enfekte olmamış arasında anlamlı bir fark (p < 0.05) gösterir; $, IAV ile enfekte olmamış arasında anlamlı bir değer olduğunu gösterir; #, tek başına Co-inf ve IAV arasında önemli bir fark olduğunu gösterir. Her hücre tipi için meydan okuma grupları arasındaki anlamlı farklılıklar ANOVA tarafından belirlendi ve ardından Tukey testi yapıldı. Kısaltmalar: NK = doğal katil; PMN = polimorfonükleer lökosit; DC = dendritik hücre; TCR = T hücre reseptörü; IAV = influenza A virüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yaşlanma ve konakçının IAV/Streptococcus pneumoniae ko-enfeksiyonuna duyarlılığının artması. Genç (10-12 haftalık) ve yaşlı (21-22 aylık) C57BL/6 erkek fareler S. pneumoniae TIGR4 i.n. ve IAV i.n. ve i.t. (Şekil 1'de olduğu gibi) ile birlikte enfekte olmuş veya tek başına IAV ile tek başına mücadele etmiştir. (A) Viral titreler 48 saat sonra belirlendi. Yıldız işaretleri, Öğrencinin t-testi tarafından belirlenen istatistiksel anlamlılığı (p < 0.05) gösterir. Veriler, grup başına n = 4 fareden toplanır. (B) Klinik skor ve (C) sağkalım zaman içinde izlendi. (B) Grup başına n = 6 fareden toplanan ortalama ± SEM gösterilir. Yıldız işaretleri, Mann-Whitney testi tarafından belirlenen belirtilen zaman noktasında genç ve yaşlı fareler arasındaki istatistiksel anlamlılığı (p < 0.05) gösterir. (C) Veriler, grup başına n = 6 fareden toplanır. Yıldız işaretleri, log-rank (Mantel-Cox) testi ile belirlenen genç ve yaşlı fareler arasındaki istatistiksel anlamlılığı (p < 0.05) gösterir. Kısaltmalar: IAV = influenza A virüsü; i.n. = intranazal; i.t. = intratrakeal; SEM = ortalamanın standart hatası. Şekil 5A, Joma ve ark.23'ün izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: CDM için I, II, III ve IV stoklarını karıştırın. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

Tablo 2: CDM için Vitamin Karışımı Stoğu. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

Tablo 3: CDM için Amino Asit Stoğu. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

Tablo 4: CDM için başlangıç stoğu ve son takviyeler. Kısaltma: CDM = kimyasal olarak tanımlanmış ortam.

Tablo 5: Antikor paneli 1.

Tablo 6: Antikor paneli 2.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.