Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dokuz Günlük Fare Yenidoğanlarında Ekstrahepatik Safra Kanalı ve Safra Kesesi Diseksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Murin neonatal safra kanallarının diseksiyonu zor olarak tanımlanmıştır. Tarif edilen standart çalışma prosedürünün temel amacı, fare yenidoğanlarında ekstrahepatik safra kanalının (EBD) hazırlık sırasında safra kanalına zarar vermeden izole edilmesidir. Kolanjiyositler hücre hattına kıyasla son derece yakın preparasyonu ve tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin (EBDS) toplanması nedeniyle, tarif edilen yaklaşım, biliyer atrezi gibi yenidoğan safra kanalı bozukluklarının hayvan modellerinin araştırılmasında son derece yararlıdır. Ötanaziden sonra periton boşluğuna erişildi ve safra kanalı sistemi, duodenum ve karaciğer benzersiz En-bloc-Rezeksiyon (EbR) ile ekstrakte edildi. Ekstrakte edilen numune bir köpük paspas üzerine yerleştirilir ve EBD, gerekli dokunuş olmadan atravmatik olarak kirletici hücrelerden diseke edilir. EBDS'nin tamamının diseksiyonu bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Safra kanalı dokusunun küçük boyutu ve miktarı nedeniyle dikkatli olunmalıdır. Tarif edilen tekniği kullanarak, kolanjiyositlere zarar verilmez. Ayrıca, tekniğin saflığı tekrarlanabilir (n = 10). Bu nedenle, optimum şekilde karşılaştırılabilir numuneler toplanabilir. Ayrıca, safra kanalı dokusu zarar görmez, çünkü safra kanalı sistemi ile herhangi bir temas, hazırlık sırasında önlenebilir ve safra sıvısı safra kesesi içinde bırakılır. En önemlisi, son safra kesesi ve safra kanalı diseksiyonu yapılırken, safra kanalının sadece biraz yanalında sıkılmadan atravmatik mikroaletler kullanıldı. Bu, temiz ve sağlam bir numunenin anahtarıdır ve daha fazla histolojik araştırma veya kolanjiyositlerin izolasyonu için gereklidir. Özetlemek gerekirse, açıklanan yenilikçi diseksiyon tekniği, EBDS'yi mümkün olduğunca temiz bir şekilde izole etmek için gerekli ekipmana sahip özellikle deneyimsiz operatörlere olanak tanır.
Giriş
Biliyer atrezi, primer sklerozan kolanjit (PSK) ve primer biliyer kolanjit (PBK) gibi kolanjiyopatilerin oluşumu ve progresyonu bilinmemekte veya tamamlanmamıştır 1,2. Bu hastalıkların kökeni ve ilerlemesinin sınırlı bir şekilde anlaşılması, tedavi seçeneklerinin azlığına yol açmaktadır3. Yenidoğan safra yolu hastalıklarının incelenmesindeki en zor engel, patofizyolojinin moleküler olarak anlaşılmasını sağlamaktır. Moleküler patolojinin daha iyi anlaşılmasının temel anahtarlarından biri, etkilenen dokunun mümkün olan en iyi şekilde gözlemlenmesidir. Biliyer atrezi4'ün<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik onayı takiben (N045/2021), erkek ve dişi C57BL/6 fare yenidoğanları 9 günlük olana kadar gözlendi. Hayvanlar, Hamburg, Almanya'daki Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi'nin hayvan tesisi tarafından deneysel amaçlar için doğdu ve sağlandı. Yenidoğanlar, ebeveyn hayvanlarıyla birlikte bir kafese yerleştirildi. Çevre koşulları sıcaklık (20-24 °C), 12:12 saat açık-karanlık döngüsü ve %40-%70 bağıl nem oranlarında kontrol edildi.
1. Deneysel hazırlık
- Makas, forseps vb. dahil olmak üzere cerrahi operasyon için gerekli ekipmanı hazırlayın (bkz.
- Dezenfekte edilmiş ve otoklavlanmış ale....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1A , tarif edilen teknikle diseke edilen bir murin yenidoğanının EBDS'sini göstermektedir. Mikroskopik olarak, başka karaciğer dokusu görülmez. Hepatik doku, protokolün son izolasyon aşamalarında çıkarılmıştır ve renk ve kıvam açısından safra kanalı dokusundan kolayca ayırt edilebilir. Şekil 1B , milimetre ölçeğine kıyasla izole edilmiş numuneyi göstermektedir. EBD'nin uzunluğu (safra kesesinden duodenal papillaya kadar ölçülür) 10 mm'den azdır. Çok hassas.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, ötenazi yenidoğan farelerinin EBDS'lerinin çıkarılması için yeni bir cerrahi yaklaşımın oluşturulması ve doğrulanması bildirilmiş ve tartışılmıştır. Mikroskopik ve histolojik bulgular, yaklaşımın EBD'leri hızlı bir şekilde tespit ettiğini ve yenidoğan farelerde bile kanal kenarlarına yakın bir yerde diseke ettiğini ortaya koymaktadır. Tarif edilen protokol için sadece cerrahi aletler ve 20x büyütmeli bir mikroskop gereklidir. Ayrıca, yaklaşım tüm EBDS'nin izolasyonuna izin verir. Teknik son derece verimli, b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl ve Magdalena Trochimiuk'a katkılarından dolayı teşekkür eder. Hans Christian Schmidt, Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Bursu (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dehidrasyon ajanı olarak kullanılan | 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 |
| 30 G kanül | B Braun/Sterican, Melsungen, Almanya | 4656300 | numunenin hidrasyonu için kanül |
| Hava menfezi | C + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Almanya | Tec-Ononmic AZ 1200 | bir havalandırma deliğinin kullanılması, formalin içeren fiksatiflerin solunmasını önlemeye yardımcı olur |
| Aqua ad enjektabilia Braun | B, Braun, Melsungen, Almanya | 2351744 | salin; Konteyner: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, steril |
| Daha büyük mikrocerrahi Forseps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | düz, 180 mm (7"), platform ucu, yuvarlak sap, genişlik: 0,800 mm, elmas tozu kaplı, steril olmayan, tekrar kullanılabilir gözlem ve son hazırlık hariç her hazırlık aşaması için isteğe bağlı alet; Peritonun derisini bölmek |
| Kamera " SmartCAM 5 inç | Basler ve Vision Engineering, Send, Birleşik Krallık | EVC131A | isteğe bağlı Lynx Exo kamera modülü: sensör tipi: CMOS, çözünürlük 2560 x 1920 piksel, sensör boyutu: 1/2"; Video prodüksiyonu ve teknik değerlendirme için kullanılır |
| Dehidrasyon makinesi/Citadel 2000 Doku İşlemcisi | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Almanya | 12612613 | otomatik dehidrasyon için kullanılır, kısa program (yaklaşık 4,8 saat) |
| Dehidrasyon süngeri | Carl Roth, Karlsruhe, Almanya | TT56.1 | sünger, inç başına minimum 60 gözenek boyutuna sahip diğer süngerler/köpük pedler de uygundur, gömme kasetlerinin delinmesinden kaymayı önlemek için numuneyi aşağıdan ve yukarıdan kaplamak için gömme kaseti başına iki köpük ped kullanılması önerilir |
| Dulbecco&akut; s Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Gibco | 14190-144 | Akut; t Calzium veya Magnezyum içerir, 500 mL |
| Gömme kasetleri | Engelbrecht GmbH, Edermü nde, Almanya | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Almanya | 41-6660-00 | boyama solüsyonu, kullanıma hazır |
| İnce Makas CeramaCut | FST, Heidelberg Almanya | 14959-09 | İpuçları: Keskin-Keskin, Alaşım / Malzeme: Seramik Kaplı Paslanmaz Çelik, Tırtıklı:, Evet; Özellik: CeramaCut, Uç Şekli: Düz, Kesme Kenarı: 22 mm, Uzunluk: 9 cm; Cilt insizyonu, periton penceresinin insizyonu |
| Graefe Forseps FST | , Heidelberg Almanya | 11051-10 | Uzunluk: 10 cm, Uç Şekli: kavisli, tırtıklı, Uç genişliği: 0,8 mm, Uç Boyutları: 0,8 x 0,7 mm, Alaşım / Malzeme: Paslanmaz Çelik |
| Hematoksilen | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Almanya | 41-5130-00 | boyama solüsyonu, kullanıma hazır |
| Highresolotion mikroskobu Vizyon | Mühendisliği, Gönder Birleşik Krallık | EVO503 | 60x büyütmeye kadar büyütme yeteneğine sahip, sadece 6x ila 20x büyütme kullanıldı |
| Mikroskop | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Almanya | BX60F5 | |
| Mikroskop Kapağı Glases | Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Almanya | 101244 | 60 mm genişliğinde, SCHOTT D 263 camdan yapılmıştır |
| Mikroskop Slaytları | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Almanya | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nuß loch, Almanya | SM2010R | Kesit alma aracı (2 & mikro; m-dilimler) |
| Omnifix-F 1 mL şırınga | B Braun, Melsungen, Almanya | 9161406V | kanülsüz şırınga |
| Parafin | Sakura Finetec, Torrance, ABD | 4511 | Tissue-Tek Parafin Wax Tek III, DMSO |
| Parafin gömme makinesi | olmadan MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Almanya | TES 99 | Bu çalışmada kullanılan gömme makinesi aşağıdaki üç ayrı modülü içeriyordu: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. Numune, dehidrasyondan hemen sonra Parafine gömülmelidir, buzdolabındaki olası büzülme ve nem nedeniyle buzdolabında ara depolama yapılmamalıdır |
| Paraformaldehit (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Karaciğer numuneleri için 2 mL Eppendorf konik Tüplerde 1 mL Alikot ve ekstrahepatik safra kanalı örnekleri için 1 mL Eppendorf konik Tüplerde 0,5 mL Alikot hazırlayın, PBS ph 7.4 'de% 4; |
| Küçük Mikrocerrahi Forseps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Almanya | (00)165 | Yuvarlak sap, düz, 0,3 mm uç, gözlem ve hazırlığın her aşamasında kullanılan alet, özellikle son hazırlıkta kullanışlıdır |
| Paslanmaz Çelik Cetvel | Agntho'nun AB, Lidingö, İsveç | 30085-15 | 150mm Metrik ve İnç Mezuniyetler |
| Cerrahi Makas – Kafa kesme için keskin kör | FST, Heidelberg Almanya | 14001-14 | Kafa kesme cihazı |
| Isıtma kabini | Haraeus, Hanau, Almanya | T 6060 | Dilimlenmiş numuneler, numunenin mikroskop lamlarına yapışmasını sağlamak için ısıtma kabininde tutulmalıdır |
Kaynaklar
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
