Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması
Bu makalede
Özet
Özet
Endometriyal doku uterusun iç boşluğunu kaplar ve östrojen ve progesteronun döngüsel kontrolü altındadır. Luminal ve glandüler epitel, stromal kompartman, vasküler ağ ve kompleks immün hücre popülasyonundan oluşan bir dokudur. Fare modelleri, endometriyumu incelemek için güçlü bir araç olmuştur ve implantasyonu, plasentasyonu ve kanseri kontrol eden kritik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. 3D endometriyal organoid kültürlerin son zamanlardaki gelişimi, endometriyal biyolojinin altında yatan sinyal yollarını incelemek için son teknoloji ürünü bir model sunmaktadır. Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal organoidler oluşturmak, transkriptomlarını analiz etmek ve morfolojilerini tek hücreli bir çözünürlükte görselleştirmek, endometriyal hastalıkların incelenmesi için çok önemli araçlardır. Bu makale, farelerden endometriyal epitelin 3D kültürlerini oluşturma yöntemlerini özetlemekte ve gen ekspresyonunu ölçmek ve organoidlerin histolojisini analiz etmek için teknikleri açıklamaktadır. Amaç, endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunu ve morfolojik özelliklerini oluşturmak, kültürlemek ve incelemek için kullanılabilecek bir kaynak sağlamaktır.
Giriş
Endometriyum - uterus boşluğunun iç astar mukozal dokusu - bir kadının üreme sağlığında kritik rol oynayan benzersiz ve oldukça dinamik bir dokudur. Üreme ömrü boyunca, endometriyum, yumurtalık hormonlarının - östrojen ve progesteronun uyumlu etkisiyle koordine edilen yüzlerce proliferasyon, farklılaşma ve parçalanma döngüsüne girme potansiyeline sahiptir. Genetiği değiştirilmiş fareler üzerinde yapılan çalışmalar, hormonlara endometriyal yanıtı ve embriyo implantasyonunun, stromal hücre desidualizasyonunun ve gebeliğin kontrolünü destekleyen temel biyolojik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır1. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, gele....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fare kullanımı ve deneysel çalışmalar, Baylor College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından oluşturulan kılavuzlar kapsamında gerçekleştirilmiştir.
1. Uterus epitelinin enzimatik ve mekanik yöntemler kullanılarak farelerden izole edilmesi
NOT: Bu bölümde, jel matris iskelesi kullanarak farelerden epitelyal endometriyal organoidlerin kurulması, geçişi, dondurulması ve çözülmesi için gereken adımlar açıklanmaktadır. Önceki çalışmalar, fare endometriyal organoidlerinin o....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleri
Ekli protokolde açıklandığı gibi WT fare endometriyal epitelinden organoidler oluşturduk ( Şekil 1'deki şemaya bakınız). Fare endometriyal epitelinin enzimatik ayrışmasını takiben, epitel tabakaları uterus stromal hücrelerinden mekanik olarak ayrıldı ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kollajenaz ile ayrıştı. Doğru yapılırsa, bu epitel ve stromal hücre ayırma yöntemi, karşı hücre tipinin% 10-15'inden da.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, fare endometriyumundan endometriyal epitel organoidleri üretme yöntemlerini ve bunların aşağı akış analizi için rutin olarak kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Endometriyal organoidler, endometriozis, endometriyal kanser ve implantasyon başarısızlığı gibi endometriyal ilişkili hastalıkları kontrol eden mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır. 2017 yılında yayınlanan dönüm noktası çalışmaları, fare ve insan epitelinden endometriyal organoidlerin uzun vadeli ve yenilenebilir kültürlerini kültüre
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Dr. Stephanie Pangas ve Dr. Martin M. Matzuk'a (M.M.M.) makalemizin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalar, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü hibeleri R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.), ve R01-HD110038 (M.M.) ve NCI- P30 Kanser Merkezi Destek Hibesi (NCI-CA125123) tarafından desteklenmiştir. Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund'dan Yeni Nesil Hamilelik Ödülü'ne sahiptir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Organoid Medya Formülasyonu< / güçlü > | |||
| < güçlü > İsim< / güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü | > < güçlü > nihai konsantrasyon< / güçlü > |
| Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran Matrisi, *LDEV içermeyen | Corning | 354230 | %100 |
| Sığır Pankreasından Tripsin | Sigma Aldrich | T1426-1G | %1 |
| Gelişmiş DMEM/F12 | Yaşam Teknolojileri | 12634010 | 1X |
| N2 takviyesi | Yaşam Teknolojileri | 17502048 | 1X |
| B-27 ve ticaret; Takviye (50X), eksi A vitamini | Yaşam Teknolojileri | 12587010 | 1X |
| Primosin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 & mikro; g/mL |
| N-Asetil-L-sistein | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamin | Yaşam Teknolojileri | 25030024 | 2 mM |
| Nikotinamid | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inhibitörü, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Rekombinant insan EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Rekombinant insan Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Rekombinant insan Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Rekombinant insan FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| Rekombinant insan HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R& D sistemleri | 5036-WN | 200 ng / mL |
| < güçlü > Diğer malzemeler ve reaktifler< / güçlü > | |||
| < güçlü > İsim< / güçlü > < | güçlü > Şirket< güçlü > | < güçlü > Katalog Numarası< / güçlü > | < güçlü > nihai konsantrasyon < / güçlü > |
| Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg / Sığır |
| pankreasından mL Deoksiribonükleaz | I Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Polistiren Mikroplakalar (24 Kuyulu) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Polistiren Mikroplakalar (12 Kuyulu) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Hücre Süzgeçleri, 40 & mikro; m | Fisher Scientific | # 08-771-1 | |
| Doğrudan-zol RNA MiniPrep (50 & mikro; g) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reaktifi | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM / F-12, HEPES, fenol içermez | kırmızı ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Sığır Serumu, Kömür soyulmuş | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2 |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehit sulu% 16 çözüm, EM Sınıfı | VWR | 15710 | %4 |
| Epredia Kaset 1 Oluklu Doku Kasetleri | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Paslanmaz Çelik Gömme Taban Kalıpları | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Etanol, 200 kanıt (% 100) | Fisher Scientific | 22-032-601 & | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Montaj Ortamı | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Naylon Biyopsi Torbaları | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Numune İşleme Jeli | VWR | 83009-992 | |
| Hematoksilen çözeltisi Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (sarımsı) çözelti Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Tampon, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Sitrik asit | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Sodyum sitrat tribazik dihidrat | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Sığır Serum Albümini (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | % 3 |
| DAPI Çözeltisi (1 mg / mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 seyreltme |
| VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı Vector | Labs | H-1000-10 | |
| Şeffaf Oje | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Mikro Kapak Camları | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master | Mix ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antikoru (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 seyreltme |
| Vimentin Antobody | Hücre Sinyali | 5741S | 1:200 seyreltme |
| Eşek anti-sıçan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil < Br / > Antikor, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | 1:250 seyreltme |
| Eşek anti-Rabbin IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | 1:250 seyreltme |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Mikroskop | ZEISS ZEISS | ||
| Axio Vert.A1 dijital kameralı ters çevrilmiş rutin mikroskop | ZEISS | ||
| güçlü>Primer Sırası | güçlüİleri (5'-3') | güçlüTers (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Laktoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCT | ACCCACTTTTCATCTCGTTC | |
| Progesteron (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATTTCCGG | |
| Gliseraldehit 3 fosfat dehidrojenaz (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCTTCTT |
Kaynaklar
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
