Yöntem makalesi

In Vitro Konjonktival Goblet Hücrelerinde Cinsiyete Dayalı Farklılıkları İnceleme Yöntemi

DOI:

10.3791/64456

⸱

28 Temmuz 2023

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenol kırmızısı içermeyen/fetal sığır serumu içermeyen ortam, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde konjonktival goblet hücrelerinin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için gelişmiş RPMI'den daha iyi bir seçenektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuru göz, oküler yüzey sağlığını etkileyen çok faktörlü bir hastalıktır ve kadınlarda görülme sıklığı çok yüksektir. Konjonktival goblet hücreleri (CGC'ler) tarafından oküler yüzeye salgılanan jel oluşturan müsinin bozulması, çoklu oküler yüzey hastalıklarına katkıda bulunur. Ekzojen seks hormonlarının eliminasyonu, CGC'lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların in vitro çalışması sırasında tutarlı sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bu makale, fizyolojik işlevlerini korurken CGC'lerdeki cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde eksojen hormonların varlığını en aza indirmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Her iki cinsiyetten postmortem insan donörlerinden alınan CGC'ler, RPMI ortamındaki konjonktiva parçalarından% 10 fetal sığır serumu (FBS) (tam ortam olarak adlandırılır) ile birleşene kadar kültürlendi. Deneylerin başlamasından yaklaşık 48 saat önce, CGC'ler fenol kırmızısı veya FBS olmadan,% 1 BSA (fenol-kırmızı içermeyen ortam olarak adlandırılır) ile RPMI ortamına aktarıldı. Normal hücresel fonksiyon, fura 2 / asetoksimetil () mikroskobu kullanılarak karbakol (Cch, 1 x 10-4 M) stimülasyonundan sonra hücre içi [Ca 2+] ([Ca2 +] i) artışı ölçülerek incelenmiştir. Sonuç, CGC'lerin 48 saat sonra fenol kırmızısı içermeyen ortamda normal işlevini sürdürdüğünü göstermektedir. Cch stimülasyonu üzerine fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı ile tam ortam arasında [Ca2+] i yanıtında anlamlı bir fark gözlenmedi. Bu nedenle, cinsiyete dayalı farklılıkların incelenmesinde CGC'lerin normal işlevini değiştirmeden eksojen hormonları ortadan kaldırmak için% 1 BSA ile fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamının kullanılmasını öneririz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cinsiyete dayalı farklılıklar oküler yüzeyin çoklu süreçlerini etkiler 1,2,3. Bu cinsiyete dayalı farklılıkların klinik tezahürü, kuru göz ve konjonktivit gibi birçok oküler yüzey hastalığının erkekler ve kadınlar arasındaki prevalansındaki farklılıktır 4,5,6. Kanıtlar, cinsiyete dayalı farklılıkların, X ve Y kromozomları7 üzerindeki farklı gen profilleri ve hormonların8 etkileri dahil olmak üzere çoklu biyolojik seviyelerden kaynaklandığını göstermektedir. Cinsiyete dayalı farklılıkların moleküler temelini incelemek, hastalığın daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir ve nihayetinde kişiselleştirilmiş tıbbı geliştirebilir.

Oküler yüzey, üstteki gözyaşı filmi, kornea ve konjonktivadan oluşur. Gözyaşı filmi 9,10, kornea11, gözyaşı bezi 12,13 ve gözyaşı salgılayan meibomian bezleri 12 dahil olmak üzere oküler yüzeyin birçok bileşeninde cinsiyete dayalı farklılıklar gözlenir. Çok sayıda mekanik çalışma, seks hormonlarının kornea ve ilişkili bileşenleri üzerindeki etkisini araştırmıştır14,15; Bununla birlikte, konjonktiva ve kadeh hücrelerindeki cinsiyete dayalı farklılıklar hakkında çok az şey bilinmektedir. Konjonktiva, sklerayı ve göz kapağının iç yüzeyini kaplayan bir mukoza zarıdır. Konjonktiva epiteli, keratinize olmayan, çok katmanlı, tabakalı skuamöz hücrelerdenoluşur 16.

Konjonktivanın tabakalı skuamöz hücreleri arasında, epitelin apikal yüzeyine serpiştirilmiş goblet hücreleri (CGC'ler) vardır. Bu goblet hücreleri, apikal kutup17'de bulunan çok sayıda salgı granülü ile karakterize edilir. CGC'ler, oküler yüzeyi nemlendirmek ve yanıp sönme sırasında yağlamak için jel oluşturan müsin MUC5AC'yi sentezler ve salgılar17. Müsin sekresyonu, hücre içi [Ca 2 +] ([Ca 2+] i) ve Ras'a bağımlı hücre dışı sinyal regüle kinazın (ERK1 /2) aktivasyonu tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir18. Müsin salgılanamaması, oküler yüzeyin kuruluğuna ve patolojik anormalliklerin sekellerine neden olur. Bununla birlikte, iltihaplı bir oküler yüzeyde, enflamatuar mediatörler tarafından uyarılan geniş müsin salgısı, gözün yapışkanlığı ve kaşıntısı algısına yol açar19. Müsin salgısının bozulduğu bu koşullar sonunda oküler yüzeyin bozulmasına yol açacaktır.

Goblet hücrelerinin oküler müsinin ana kaynağı olarak rolü uzun zamandır bilinmektedir20, ancak hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda müsin regülasyonundaki cinsiyete dayalı farklılıklar keşfedilmemiştir. Bir in vitro sistem, kadeh hücrelerinin işlevini hormonal etki olmadan veya hassas bir şekilde kontrol edilen bir seks hormonu seviyesiyle izlemek için yararlı olacaktır. Konjonktival epitel hücre hattı21 gelişmiş olmasına rağmen, fonksiyonel müsin sekresyonu olan goblet hücre hattı mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro16'da cinsiyete dayalı farkı analiz etmek için bir yöntem oluşturmak için geliştirdiğimiz birincil insan CGC kültürümüzü değiştirdik ve aşağıdaki gibi sunduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm insan dokusu, bilimsel araştırmalarda kullanılmak üzere bağışçının önceden bilgilendirilmiş onayı ve izni ile göz bankasına bağışlandı. İnsan konjonktival dokusunun kullanımı Massachusetts Göz ve Kulak İnsan Çalışmaları Komitesi tarafından gözden geçirildi ve muaf olduğu ve insan deneklerle yapılan araştırma tanımına uymadığı belirlendi.

1. Birincil insan kadeh hücre kültürü

  1. Göz bankasından insan konjonktival dokusuelde edin 16.
  2. % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 2 mM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 2 mM sodyum piruvat, 100 μg / mL penisilin-streptomisin ve 2 mM 4- (2-hidroksietil) -1- piperazineetansülfonik asit (HEPES) ile desteklenmiş kültür ortamı, RPMI-1640 kültür ortamını hazırlayın.
  3. Birincil hücre kültürünü aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    1. Dokuyu steril bir neşter ile1 mm 3 parçaya bölün ve bir kültür başlığındaki kültür plakalarına tohumlayın. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört parça tohumlayın, 1 mL tam RPMI ortamında. Doku parçasının oryantasyonu hücre büyümesini etkilemese de, neşter bıçağını kullanarak büyümeyi sağlamak için parçaların kültür plakasına yapıştığından emin olun.
    2. Doku parçalarını 37 °C'de %95 hava ve %5CO2 içeren inkübatöre yerleştirin. Goblet hücreleri yaklaşık 14 gün içinde% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar aynı kültür ortamını her iki günde bir yenileyin. Tohumlamadan yaklaşık 72 saat sonra doku tıkacını çıkarın.
      NOT: İnsan konjonktival epiteli esas olarak tabakalı skuamöz hücreler ve goblet hücreleri içerir. RPMI, goblet hücreleri için seçici bir ortamdır. Nadiren insan CGC kültüründe, fibroblastlar 7. gün civarında büyüyebilir. Kültürü saflaştırma yöntemi önceki bir yayında açıklanmıştır 22.
    3. Sitokeratin (CK)7 ve Helix pomatia lektin-1 (HPA-1)22'yi hedefleyen immünofloresan mikroskobu (IFM) kullanarak GC kültürünün saflığını,19'da açıklanan standart IFM yöntemini izleyerek doğrulayın; Temsili sonuçlara bakın.

2. İnsan konjonktival goblet hücre geçişi ve deneysel hazırlık

  1. Hücreleri PBS (pH = 7.4) ile durulayın ve 1x EDTA'da% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri tripsinizasyon ile ayırın. Hücreleri her dakika mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler alttan ayrıldıktan sonra, tam RPMI ortamını kullanarak tripsini devre dışı bırakın.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüjleyin. Hücre peletini tam RPMI kültür ortamında yeniden süspanse edin ve [Ca2 +] i ölçümü için cam tabanlı kültür kaplarına yeniden tohumlayın. Ortamın toplam hacmi çanak başına 300 μL'dir. Ortamı yemeğin cam kısmının ortasında tutun.
  3. Kültür ortamındaki hormonların eliminasyonu: Kültür ortamı, özellikle FBS olmak üzere seks hormonları içerebilir. RPMI-1640'ta bulunan fenol kırmızısı östrojenik aktiviteye 23,24 sahip olduğundan, RPMI ortamını fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamıyla değiştirin ve tüm ortamı hazırladıktan sonra pH şeritleri kullanarak pH'ı 7.45'e ayarlayın. Komple ortamda bulunan HEPES, pH'ı nispeten küçük bir aralıkta tutar.

3. [Ca2+]i ölçümü için fura-2/asetoksimetil () testi

  1. Fura-2/yüklemesini aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
    1. Hücreleri cam alt tabaklarda 37 ° C'de, ortam atmosferinde 1 saat inkübe edin ve Krebs-Ringer bikarbonat tamponu (KRB; 119 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.0 mM CaCl 2, 1.2 mMMgSO4 ve 25 mM NaHCO3 içeren) ile ışıktan korunarak %0.5 HEPES (Tablo 1) artı %0.5 BSA, 0.5 μM fura-2/, 8 μM pluronik asit F127 ve 250 μM sülfinpirazon.
    2. Kullanmadan önce bir pH metre kullanarak pH'ı 7.45'e ayarlayın. Fura-2/ile yükledikten sonra, hücreleri [Ca 2+]i ölçümünden hemen önce250 μM sülfinpirazon içeren KRB ile yıkayın.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi [Ca2+]i ölçümü gerçekleştirin.
    1. Fura-2 yüklü hücreleri içeren tabakları mikroskop altına yerleştirin, 20x büyütmede 20 hücre ile 50 hücre arasında temsili bir alan bulun ve yazılıma arka plan floresansının ne olduğunu ve ne olmadığını belirtmek için her hücrenin etrafına bir taslak çizmek için Freehand işlevini kullanın.
    2. Yazılımın arka plan floresansını ölçümden otomatik olarak çıkarmasını bekleyin ve Deneyi Başlat düğmesine tıklayın.
    3. Ardından, ilgilenilen agonisti dikkatlice pipetlemeden önce hücrelerdeki bazal kalsiyum seviyelerini belirlemek için 8 saniye ile 15 saniye arasında bekleyin. Agonisti ekledikten sonra veya kalsiyum seviyeleri taban çizgisine dönene kadar en az 120 saniye boyunca ölçmeye devam edin.
  3. Aşağıda açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin.
    1. Uyaranların eylemlerini temsil etmek için tepe [Ca2+]i'deki değişikliği kullanın. Ölçümlerin ilk 8-15 saniyesinden itibaren her hücredeki ortalama bazal kalsiyum seviyesini hesaplayın. Bu sayı 500 nM'ye eşit veya üzerindeyse, apoptoz veya nekroz geçiren bu hücreyi veri kümesinden çıkarın.
    2. Her hücrenin bazal seviyesi hesaplandıktan sonra, bu miktarı aynı hücre için ölçülen maksimum [Ca2 +] i'den çıkarın. Belirli bir tabaktaki tüm hücreler için tepe [Ca2+] I'deki değişimin ortalamasını alın.
    3. Tutarlılığı sağlamak için, her bir uyaranın yanıtlarını iki kopya olarak kaydedin ve kopyalardan elde edilen tepe [Ca2 +] i'deki değişikliklerin ortalama değerini, bireysel insan örneğinden tek bir veri noktası olarak hesaplayın. Çalışma tasarımına dayalı olarak uygun bir veri analizi yöntemi kullanarak farklı gruplardan elde edilen verileri karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oküler dokulardaki cinsiyete dayalı farklılıkların araştırılması, bir cinsiyeti orantısız bir şekilde etkileyen hastalıkların, özellikle kuru göz ve alerjik konjonktivitin süreçlerini anlamaya yardımcı olur 4,5,6. Bu çalışmalar için hayvan modelleri kullanılabilse de, doğrudan insan dokusundan elde edilen veriler, in vivo insan hücrelerine en yüksek benzerlik nedeniyle önemlidir. Mevcut deney ortamında kullanılan konjon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü Hibe EY019470 (DAM) tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x EDTA ile% 0.05 tripsinGibco (Grand Island, NY)25300-054
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asitFisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)BP310-500
Gelişmiş RPMI ortamıGibco (Grand Island, NY)12633020
carbacholCayman Chemical (Ann Arbor, MI)144.86
Fetal Bovin SerumuAr-Ge D (Minneapolis, MN)S11150H
Fura-2-asetoksimetil ester & nbsp;Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ABD)F1221
İnsan konjonktival dokusuEversight Göz Bankası (Ann Arbor, MI)
inorganik tuzbir marka işe yarayacak
Lonza Grubu (Basel, İsviçre)17-605F
esansiyel olmayan amino asitlerGibco (Grand Island, NY)11140-050
penisilin / streptomisinGibco (Grand Island, NY)15140-122
fenol kırmızısı içermeyen RPMI ortamı Gibco (Grand Island, NY)11835055
Pluronic asit F127MilliporeSigma (Burlington, MA, ABD)P2443-250G
RPMI-1640 kültür ortamıGibco (Grand Island, NY)21875034
neşterThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ABD)12460451Herhangi bir steril cerrahi neşter işe yarayabilir
sodyum piruvatGibco (Grand Island, NY)11360-070
sülfinpirazMilliporeSigma (Burlington, MA, ABD)S9509-5G
KRB tamponu Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) için N/A Herhangi L-glutamin 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
  3. Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
  4. Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
  5. Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
  6. Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
  7. Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).
  8. Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
  9. Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
  10. Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
  11. Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
  12. Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
  13. Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
  14. Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
  15. Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
  16. Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
  17. Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
  18. Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
  19. Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
  20. Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
  21. García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).
  22. Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
  23. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
  24. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
  25. García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
  26. Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
  27. Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
  28. Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
  29. Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
  30. Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Conjunctival Goblet CellsSex Based DifferencesDry Eye DiseaseIntracellular Calcium MeasurementPrimary Cell CulturePhenol Red Free MediumMucin SecretionImmunofluorescent StainingCarbachol StimulationHuman Conjunctiva

İlgili makaleler