Method Article

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/64459

⸱

September 13th, 2022

 ,  , 
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anöploidi, insanlarda erken düşüklere ve gebelik başarısızlığına neden olan önde gelen genetik anormalliktir. Anöploidiye yol açan kromozom ayrışmasındaki hataların çoğu, oositlerde mayoz sırasında meydana gelir, ancak oosit mayozunun neden hataya eğilimli olduğu hala tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre bölünmesi sırasında, hücreler iş mili montaj kontrol noktasını (SAC) etkinleştirerek kromozom ayrışmasındaki hataları önler. Bu kontrol mekanizması, kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılamaya ve iğ lifleri tarafından üretilen gerilimi algılamaya dayanır. KT'ler takılı olmadığında, SAC etkinleştirilir ve hücre döngüsünün ilerlemesini önler. SAC ilk olarak MPS1 kinaz tarafından aktive edilir ve bu da MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1'den oluşan mitotik kontrol noktası kompleksinin (MCC) işe alınmasını ve oluşumunu tetikler. Daha sonra, MCC sitoplazmaya yayılır ve anafazı teşvik eden karmaşık / siklozom (APC / C) aktivatörü olan CDC20'yi ayırır. KT'ler mikrotübüllere bağlandığında ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandığında, SAC susturulur, CDC20 serbest bırakılır ve APC / C aktive edilir, Siklin B ve Sekürin'in bozulmasını tetikler, böylece anafaz başlangıcına izin verir. Somatik hücrelerle karşılaştırıldığında, oositlerdeki SAC o kadar etkili değildir, çünkü hücreler bağlanmamış KT'lere sahip olmalarına rağmen anafaza maruz kalabilirler. SAC'nin neden daha izin verici olduğunu ve bu izin vermenin oositlerde kromozom ayrışma hatalarının nedenlerinden biri olup olmadığını anlamak hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Mevcut protokol, fare oositlerinde SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için üç tekniği açıklamaktadır. Bu teknikler arasında SAC yanıtını değerlendirmek için MT'leri depolimerize etmek için nokodazol kullanılması, Securin yıkımının kinetiğini takip ederek SAC susturulmasının izlenmesi ve MAD2'nin immünofloresan yoluyla KIT'lere alımının değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu teknikler birlikte, SAC bütünlüğünün tam bir değerlendirmesini sağlayarak sağlıklı yumurta üretmek için gerekli mekanizmaları araştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromozom ayrışmasındaki hatalardan kaynaklanan anöploidi, erken düşüklerin önde gelen nedenidir ve mayoz1'deki hatalarla oldukça bağlantılıdır. Mayoz, mitozdan farklıdır, çünkü araya giren bir DNA replikasyon adımı olmadan iki tur hücre bölünmesinden oluşur. Mayoz I'de, homolog kromozomlar ayrılırken, kardeş kromatitler birlikte kalır. Oositlerde, bu adım hataya eğilimlidir ve anöploid yumurta üretimineyol açar 2.

Kromozom ayrışma hatalarını önlemek için, çoğu hücre tipi, iş mili montaj kontrol noktası (SAC) adı verilen hücre döngüsünü duraklatan bir gözetim mekanizmasını etkinleştirir. Bu mekanizma kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılar ve kromozomlar bipolar bir şekilde yönlendirildiğinde gerilim oluşur3. Bağlanmamış kinetochores, SAC'nin ana regülatörü MPS1'in kinetochores 3,4'e işe alınmasıyla başlayan bir SAC yanıtını tetikler. MPS1, mitotik kontrol noktası kompleksini (MCC) oluşturmak için bir platform görevi gören diğer SAC bileşenlerinin işe alımını başlatır. MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1'den oluşan MCC, sitoplazmaya yayılır ve aktivatörü CDC20'yi ayırarak APC / C aktivasyonunu inhibe eder. Tüm kinetochores MT'lere kararlı bir şekilde bağlandıktan ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandıktan sonra, SAC susturulur ve MCC CDC20'yi söker ve serbest bırakır, böylece APC / C aktivasyonuna izin verir. Aktif APC / C, anafaz başlangıcı 5,6'yı tetiklemede iki önemli adım olan Sekürin ve Siklin B'yi bozar. Somatik hücrelerde, SAC sıkıdır, çünkü tek bir bağlanmamış kinetochore tarafından aktive edilir ve hücre döngüsü tutuklamasını indüklemek içinyeterlidir 6. Bununla birlikte, oosit mayozu sırasında, SAC daha izin verir ve oositler bir veya daha fazla bağlanmamış kinetochores 6,7,8,9,10 ile anafaz I'e girebilir. SAC'nin oositlerde neden daha izin verici olduğunu anlamak, bu alanda devam eden bir odak alanıdır. SAC aktivasyonunda veya SAC susturmasında kusurlara neden olan mekanizmalar, kromozom ayrışmasında hatalara veya uzun süreli hücre döngüsü durmasına ve hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle, oositlerde SAC bütünlüğünü koruyan mekanizmaların değerlendirilmesi, sağlıklı, öploid yumurtaların oluşma sürecini anlamak için önemlidir.

Bu protokol, kontrol noktasının farklı kritik adımlarını inceleyerek fare oosit mayozunda SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için teknikleri açıklar. İlk olarak, SAC aktivasyonunu indükledikten sonra SAC yanıtının değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu aktivasyon, MTs11'i depolimerize eden bir ilaç olan nocodazole kullanılarak bağlanmamış kinetochores üretilerek elde edilir. İkincisi, SAC'nin susturulmasını izlemek için bir yöntem, oosit olgunlaşması sırasında Sekürin yıkımının dinamiklerini izleyerek açıklanmaktadır. Son olarak, MCC bileşenlerinden biri olan MAD2'nin kinetochores'e alımını ölçmek için immünofloresan tabanlı bir tahlil kullanılır. Birlikte, bu testler oosit mayotik olgunlaşması sırasında SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokollerde kullanılan tüm fareler, Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi (Protokol 201702497) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına göre barındırılmış ve yetiştirilmiştir. Bu düzenleyici kurumlar, hayvan çalışmalarını içeren tüm deneysel prosedürleri onayladı. Bu çalışmada kullanılan tüm fareler 6-8 haftalık CF-1 dişileriydi.

1. Deneysel hazırlık

  1. SAC değerlendirmelerine başlamadan önce, daha önce yayınlanan rapor12'yi takiben fare oositlerini toplayın. Toplanan yumurtaları eşit büyüklükte üç gruba bölün ve mayotikyeniden başlamayı önlemek için 2.5 μM milrinon içeren Chatot, Ziomek ve Bavister (CZB) kültür ortamlarında saklayın (bkz.
    NOT: CZB bileşimi: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1.2 mM MgSO,4-7H 2O; 0.27 mM Piruvat; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-Laktik Asit; 7 mM Taurin; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamisin; ve% 0.3 BSA.
  2. Daha önce tarif edildiği gibi mikroenjeksiyon için cRNA'yı hazırlayın 12,14. Fare Securin genini fare germinal vezikül oositlerinden klonlanan cDNA'dan yükseltin, ardından Gfp dizisi15,16'yı içeren pMDL2 vektörüne alt klonlama yapın.
    1. Securin-Gfp cRNA'yı hazırlamak için, plazmidi Nde I sindirimi ile doğrusallaştırın. T3 RNA polimeraz kullanarak ve cRNA16'yı saflaştırarak in vitro transkripsiyon gerçekleştirin.
      NOT: cRNA'yı kullanana kadar -80 °C'de 2-3 μL'lik alikotlarda saklayın.

2. Nokodazol tedavisi ve canlı görüntüleme

  1. Kontrol olarak 5 μM nokodazol (NOC), 5 μM NOC artı 0,5 μM reversin (NOC + REV) içeren 1 mL kültür ortamı ve Dimetil sülfoksit (DMSO) (1:2000) içeren 1 mL kültür ortamı (CZB) hazırlayın (bkz.
  2. Yumurta olgunlaşması ve canlı görüntüleme için, inkübatörde 37 ° C,% 5 CO2 ve% 80 nemde önceden ısıtılmış 96 delikli bir plaka kullanın. İlk kuyuda, kontrol DMSO tedavisinin 150 μL'sini yükleyin; ikinci kuyuda, 150 μL NOC tedavisi yükleyin; ve üçüncü kuyuda, 150 μL NOC + REV tedavisi yükleyin. Plakayı inkübatörde ihtiyaç duyulana kadar yukarıdakiyle aynı koşullar altında tutun.
    NOT: 96 delikli plakada, kenarlığın gölgesi görüntülerin kalitesini bozduğundan, ilk satırı ve ilk sütunu kullanmaktan kaçının.
  3. Mayotik olgunlaşmayı başlatmak için milrinonu çıkarın. Yumurtaları 30x-64x arasında büyütme kullanarak bir stereomikroskop altında görüntülerken, oositleri DMSO içeren altı damla 100 μL milrinon içermeyen kültür ortamından sırayla aktararak milrinonu ortamdan yıkayın ve elle veya ağızla çalışan bir pipet kullanarak 96 delikli plakanın ilgili kuyucuğuna yerleştirin.
    1. Oositleri, elle veya ağızdan çalıştırılan bir pipet kullanarak toplayarak ve herhangi bir kaybetmemek için bir sonraki damlaya teslim ederek sayın. Yumurtalar tek, büyük (~ 80 μm çapında) ve yuvarlak hücrelerdir. Çekirdek, hücrenin merkezinde bir düğme gibi görünecek ve zar ve zona pellucida oositi çevreleyecektir.
      NOT: Mümkün olan en az miktarda sıvıyı hareket ettirirken yumurtaları damlalar arasında aktarın. Bu, milrinonun kültür ortamından en uygun şekilde çıkarılmasını sağlar. Oositler mayoza devam edemezse, milrinonun etkili bir şekilde çıkarılmamış olması muhtemeldir.
  4. NOC ve NOC + REV tedavisi için aynı işlemi tekrarlayın (adım 2.3).
  5. Oositleri, şu koşullar altında kontrollü bir ortama sahip bir inkübatör odasıyla donatılmış parlak bir mikroskop kullanarak görüntüleyin: 37 ° C,% 5 CO2 ve% 80 nem. Oositlerin orta düzleminde 24 saat boyunca 20 dakikalık aralıklarla görüntü yakalayın.
  6. Asimetrik sitokinezden geçen hücreleri tanımlayarak polar bir cismi (PB) ekstrüzyon yapan oositlerin sayısını ölçün. Sonuç, yumurtanın yanında ve paylaşılan zona pellucida içinde küçük bir hücre (PB) olacaktır. Görüntüleri görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleyin (ImageJ, bkz.
  7. Görüntü dizisini görüntü analiz yazılımına aktarın ve bir veya daha fazla hücre asimetrik sitokinezden geçene kadar çerçeveleri ilerletin. Toplam oosit17'nin PB'sini ekstrüzyon yapan oositlerin yüzdesini hesaplayın.

3. Mayotik olgunlaşma sırasında Securin-gfp bozunma paterninin izlenmesi

  1. 4 °C 18'de 30 dakika boyunca 19.283 x g'de 3 μL Securin-Gfp cRNA(adım1.2) santrifüj.
    NOT: Mikroenjeksiyon sırasında iğne tıkanmasına neden olabilecek yükleme safsızlıklarını önlemek için süpernatantı kullanın.
  2. Referans12'de kapsamlı bir şekilde açıklanan adım adım oosit mikroenjeksiyonunu takip edin. Adım 1.2'de hazırlanan 100 ng/μL Securin-gfp cRNA ile mikroenjekte edilen faz I-arrested oositler.
  3. Mikroenjeksiyondan sonra, oositlerin CO2 inkübatöründe RNA'yı en az 3 saat boyunca iyileşmesine ve çevirmesine izin verin. GFP sinyalini görüntülemek için oositleri otomatik çok kanallı floresan görüntüleme sisteminde gözlemleyerek ifadeyi kontrol edin (bkz.
  4. Adım 2.2'de açıklandığı gibi, 96 kuyucuklu bir plakanın üç farklı kuyucuğuna 5 μM nokodazol içeren veya olmayan 150 μL kültür ortamı ve 0,5 μM reversin içeren 150 μL kültür ortamı yükleyin.
  5. Mikroenjekte edilen oositleri altı damla milrinon içermeyen kültür ortamından yıkayın ve yumurtaların 1 / 3'ünü her tedaviye aktarın.
  6. Plakayı inkübatörde 37 ° C'de, oositler mayoza devam edene kadar% 5 CO2 ve% 80 nem ile, milrinon yıkamadan yaklaşık 3 saat sonra tutun.
    NOT: Nükleer zarf parçalanmasını mayotik yeniden başlatmanın bir işareti olarak değerlendirmek için 30x-64x arasında büyütmeli bir stereomikroskop kullanın.
  7. Adım 2.6'da açıklandığı gibi bir inkübatör odası ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak oosit olgunlaşmasının görüntülerini kaydedin. Kuyudaki yumurtaları bulmak için parlak alan ayarlarını kullanın. Securin-gfp sinyalini algılamak için bir 488 filtresi kullanın ve hücrelerin aşırı pozlanmasını önlemek için floresan yoğunluğunu ayarlayın.
    1. Görüntüleme sistemi otomatikse, oositlerin konumlarını her bir kuyucukta kaydedin. Securin-gfp sitoplazmaya eşit olarak dağıldığından, oositlerin orta düzleminde 24 saat boyunca 20 dakikalık aralıklarla görüntüler yakalayın. Bir resimdeki yumurta gruplarını yakalamak için, 10x gibi daha düşük büyütmeli bir objektif lens kullanın.
  8. Securin-gfp yıkımını ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. GFP kanalının görüntülerini açın. 1. zaman noktasından başlayın. Tercih edilen analiz yazılımında, her oositi işaretlemek ve her hücre için bir ilgi alanı (ROI) oluşturmak için bir seçim veya şekil aracı kullanın.
    1. Daha sonra çıkarılacak bir arka plan alanı seçmek için aynı YG'yi kullanın. Her YG'deki GFP piksel yoğunluğunu ölçün.
  9. Adım 3.8'de üretilen her oosit için ROI'leri kullanarak, GFP yoğunluğunu tüm zaman noktalarında ölçün.
    NOT: Bazı yazılım programlarında, "Analiz" sekmesi Ölçüm işlevinin seçilmesine izin verir.
    1. Ardından, bir sonraki zaman dilimine ilerleyin ve GFP'nin yoğunluğunu her zaman diliminde ölçmek için bu işlemi tekrarlayın. Son olarak, her GFP değerine, adım 3.8'de seçilen arka planda YG ölçümünü çıkarın. Bu analiz, her zaman noktasında her oosit için Securin-gfp yoğunluğu için bir değer verecektir.
  10. Securin yıkımı modelinden farklı parametreler çıkarın: (a) Securin-gfp bozunmasının başladığı zaman. Bu, SAC susturmanın ne zaman başladığını söyler; (b) Securin-gfp minimum sinyalinin zamanı. Bu, SAC susturmalarının yüksek APC / C aktivasyonuna ve tam Securin-GFP bozulmasına izin vermek için bir eşik seviyesinin altına ne zaman düştüğünü söyler; (c) Securin-gfp yıkım oranı19. Bu, SAC aktivitesinin APC / C aktivasyonu ve Securin-GFP bozunması için bir eşik seviyesinin altına ne kadar hızlı düştüğünü gösterir.

4. Mayotik olgunlaşma sırasında immünofloresan ile kinetochores'te MAD2 alımı

NOT: Yumurta toplanması ve olgunlaşması için, daha önce yayınlanmış rapor12'ye bakınız.

  1. Yumurtaları üç gruba ayırın. Her bir oosit grubunu 100 μL damla milrinon içermeyen kültür ortamına aktarın. Damlaları mineral yağ ile örtün ve sırasıyla erken prometafaz I, geç prometafaz I ve metafaz I aşamasına ulaşmak için 3 saat, 5 saat ve 7 saat boyunca inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2 ve% 80 nem) yerleştirin.
    NOT: Aynı kabın inkübatörden birkaç kez çıkarılmasını önlemek için her zaman noktasını farklı bir kaba yerleştirin, bu da mayotik olgunlaşmanın düzenli zamanlamasını etkiler.
  2. Belirlenen zaman noktalarında, oositleri, daha önce tarif edildiği gibi 9 delikli bir cam tabak kullanarak, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1x PHEM tamponunda% 2 PFA'nın500 μL damlasına aktararak sabitleyin. Daha sonra, hücreleri 500 μL'lik bir blokaj çözeltisi damlası içeren temiz bir kuyuya aktarın (PBS +% 0.3 BSA +% 0.01 Ara-20 +% 0.02 NaN3).
    NOT: PHEM bileşimi: 60 mM BORULAR; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; ve 2 mM MgCl2.
    NOT: Bu noktada durabilir ve oositleri, immünofloresansı tamamlamak için uygun zamana kadar 4 ° C'de 9 delikli plakada bloke edici çözeltide saklayabilir.
  3. MAD2 tespitine devam etmek için, yumurtaları 500 μL'lik bir permeabilizasyon çözeltisi damlası içeren temiz bir kuyuya aktarın (PBS +% 0.3 BSA +% 0.1 TritonX-100 +% 0.02 NaN3). Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra hücreleri yeni bir bloke çözeltisi kuyusuna aktarın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. İmmünofloresan adımlarının geri kalanı için, daha önce tarif edildiği gibi girintili 96 kuyucuklu bir bulaşık kapağı kullanın20. Işığa maruz kalmayı ve buharlaşmayı önlemek için nemlendirilmiş karanlık bir oda kullanın. Oositleri, anti-MAD2 antikoru (1:1000, tavşan) ve anti-sentromerik antikor (ACA) (1:30, insan) (bakınız Malzeme Tablosu) ile 30 μL'lik bir bloke edici çözeltiye aktarın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: 96 delikli çanak kapağı, aynı anda birkaç protein ve grubun işlenmesi için yer sağlar.
  5. Fazla birincil antikorları yıkamak için, hücreleri% 0.5 Triton ile desteklenmiş 30 μL'lik bir damla 1x PHEM tamponuna aktarın ve nemlendirilmiş odada 10 dakika boyunca inkübe edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
  6. Dördüncü yıkamayı gerçekleştirin, hücreleri% 0.5 1x Triton olmadan 30 μL'lik bir damla 1x PHEM tamponuna aktarın ve 10 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Hücreleri, anti-insan-633 (1:200) ve anti-tavşan-568 (1:200) gibi ikincil antikorlar içeren 30 μL'lik bir bloke çözeltisi damlasına aktarın (bkz.
    NOT: Mikroskop lazerlerinize veya filtrelerinize bağlı olarak florofor kombinasyonunu seçin.
  8. Fazla ikincil antikorları yıkamak için, 4.5-4.6 adımlarını tekrarlayın.
  9. Hücreleri mikroskop slaydına monte etmek için, hücreleri DAPI (0.1 mg / mL) içeren 10 μL'lik bir montaj ortamı damlasına aktarın (bkz. Kapak kapağının her köşesine küçük petrol jölesi noktaları ekleyin, bunları dikkatlice montaj ortamı damlasının üzerine yerleştirin ve dağıtmak için yavaşça bastırın. Kapak kapağını slayta kapatmak için şeffaf oje kullanın. Montaj işleminin daha ayrıntılı bir açıklaması için, referans20'ye bakın.
  10. 40x veya 63x objektifle donatılmış bir konfokal mikroskop (bakınız Malzeme Tablosu) kullanan görüntü kinetochorları. ACA sinyalini kullanarak, tüm kromozom alanının görüntülenmesini sağlayan z-aralığını belirleyin.
    NOT: Bazı görüntüleme sistemlerinde 4,0 optik yakınlaştırma ve 0,5 μm z adım boyutu kullanılabilir. Bu parametreler sistemden sisteme değişebilir ve optimizasyon gerekli olacaktır.
  11. Görüntü analiz yazılımını kullanarak kinetochores'teki MAD2 yoğunluğunu analiz edin. Bir z-stack maksimum projeksiyonu yapın ve ardından kanalları bölün.
  12. İlk olarak, tüm kinetochore sinyallerini tanımlayan bir eşik oluşturmak için ACA kanalını seçerek ACA kanalını kullanarak bir maske oluşturun. Düzenle sekmesine gidin ve bir seçim oluşturun. Ardından, bu seçimle bir yatırım getirisi oluşturun.
  13. MAD2 kanalını seçin ve adım 4.12'de oluşturulan seçimi getirin. MAD2 sinyaline daha iyi uyum sağlayan bir eşik yöntemi seçin. Yoğunluğu ölçün.
    NOT: Kontrol tedavisinde eşik yöntemini seçin ve farklı tedavileri analiz ederken sabit tutun.
  14. Göreceli piksel yoğunluğu hesaplamaları yapmak için, her hücrenin yoğunluğunu deneydeki WT oositlerinin ortalama yoğunluğuna bölün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOKODAZOL tedavisi ile SAC yanıtının değerlendirilmesi
Bu deneyin amacı SAC aktivasyonunu ve gücünü değerlendirmektir. İş mili mikrotübüllerini depolimerize etmek için nokodazol kullanılarak, tüm kinetochores bağlanmamış olacak ve bu da SAC aracılı hücre döngüsü durmasına neden olacaktır. Mevcut görüntüleme sisteminde, DMSO ile tedavi edilen kontrol oositleri, milrinondan salındıktan yaklaşık 14 saat sonra polar bir gövdeyi ekstrüde etti (Şekil 1, üst paneller). SAC aktiv...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İş mili montaj kontrol noktası, kromozom ayrışma hatalarını önlemek için tasarlanmış hücre bölünmesi sırasında kritik bir kontrol mekanizmasıdır. Hücrenin yanlış KT-MT eklerini düzeltmek için yeterli zamana sahip olmasını sağlar. Oositlerde mayoz, kromozom yanlış ayrışmasının çoğunun mayoz I sırasında meydana geldiği ve insanlarda erken düşüklerin ve kısırlığın ana nedeni olan anöploid yumurtaların üretilmesine yol açan hataya eğilimli bir süreçtir 1,24. Kadın ma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu projenin finansmanı Ulusal Sağlık Enstitüleri (R35GM136340 - KS) tarafından sağlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA4503
DAPIYaşam TeknolojileriD1306
Dimetil-sülfoksit (DMSO)SigmaD5879
Eşek-anti-tavşan-Alexa-568Yaşam TeknolojileriA10042
EVOS FL Otomatik Görüntüleme SistemiYaşam TeknolojileriFloresan mikroskobu
EVOS Sahnede İnkübatörYaşam TeknolojileriKuluçka odası
Cam Alt 96 kuyulu plakalar N 1.5 kaplamasızMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
keçi-anti-insan-Alexa-633Yaşam TeknolojileriA21091
HEPESSigmaH3537
İnsan anti-ACAAntikorları Dahil15-234Seyreltme 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8, 63&, 1.40 NA yağa daldırma objektifiLeica
MgSO4 ve orta nokta ile donatılmıştır; 7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NokodazolSigmaM1404
Paraformaldit (PFA)SigmaP6148
BORULARSigmaP6757
Tavşan anti-MAD2Biyoefsane924601Seyreltme 1/1000; daha önce Covance #PRB-452C
Tersine DönüşCayman Kimyasal10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
VectashieldVektör laboratuvarlarıH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851(2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442(2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783(2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489(2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346(2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327(2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spindle Assembly CheckpointMouse OocytesChromosome SegregationAneuploidy MechanismsSAC IntegrityLive ImagingImmunofluorescence AnalysisSecurin DegradationMAD2 RecruitmentConfocal Microscopy

Related Articles