Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Summary

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Abstract

Anöploidi, insanlarda erken düşüklere ve gebelik başarısızlığına neden olan önde gelen genetik anormalliktir. Anöploidiye yol açan kromozom ayrışmasındaki hataların çoğu, oositlerde mayoz sırasında meydana gelir, ancak oosit mayozunun neden hataya eğilimli olduğu hala tam olarak anlaşılamamıştır. Hücre bölünmesi sırasında, hücreler iş mili montaj kontrol noktasını (SAC) etkinleştirerek kromozom ayrışmasındaki hataları önler. Bu kontrol mekanizması, kinetochore (KT)-mikrotübül (MT) ataşmanlarını algılamaya ve iğ lifleri tarafından üretilen gerilimi algılamaya dayanır. KT'ler takılı olmadığında, SAC etkinleştirilir ve hücre döngüsünün ilerlemesini önler. SAC ilk olarak MPS1 kinaz tarafından aktive edilir ve bu da MAD1, MAD2, BUB3 ve BUBR1'den oluşan mitotik kontrol noktası kompleksinin (MCC) işe alınmasını ve oluşumunu tetikler. Daha sonra, MCC sitoplazmaya yayılır ve anafazı teşvik eden karmaşık / siklozom (APC / C) aktivatörü olan CDC20'yi ayırır. KT'ler mikrotübüllere bağlandığında ve kromozomlar metafaz plakasında hizalandığında, SAC susturulur, CDC20 serbest bırakılır ve APC / C aktive edilir, Siklin B ve Sekürin'in bozulmasını tetikler, böylece anafaz başlangıcına izin verir. Somatik hücrelerle karşılaştırıldığında, oositlerdeki SAC o kadar etkili değildir, çünkü hücreler bağlanmamış KT'lere sahip olmalarına rağmen anafaza maruz kalabilirler. SAC'nin neden daha izin verici olduğunu ve bu izin vermenin oositlerde kromozom ayrışma hatalarının nedenlerinden biri olup olmadığını anlamak hala daha fazla araştırmaya ihtiyaç duymaktadır. Mevcut protokol, fare oositlerinde SAC bütünlüğünü kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için üç tekniği açıklamaktadır. Bu teknikler arasında SAC yanıtını değerlendirmek için MT'leri depolimerize etmek için nokodazol kullanılması, Securin yıkımının kinetiğini takip ederek SAC susturulmasının izlenmesi ve MAD2'nin immünofloresan yoluyla KIT'lere alımının değerlendirilmesi yer almaktadır. Bu teknikler birlikte, SAC bütünlüğünün tam bir değerlendirmesini sağlayarak sağlıklı yumurta üretmek için gerekli mekanizmaları araştırır.

Introduction

Kromozom ayrışmasındaki hatalardan kaynaklanan anöploidi, erken düşüklerin önde gelen nedenidir ve mayoz^1'deki hatalarla oldukça bağlantılıdır. Mayoz, mitozdan farklıdır, çünkü araya giren bir DNA replikasyon adımı olmadan iki tur hücre bölünmesinden oluşur. Mayoz I'de, homolog kromozomlar ayrılırken, kardeş kromatitler birlikte kalır. Oositlerde, bu adım hataya eğilimlidir ve anöploid yumurta üretimine^{yol açar 2}.

Kromozom ayrışma hatalarını önlemek için, çoğu hücre tipi, iş mili montaj kontrol noktası (SAC) adı verilen hücre döngüsünü duraklatan bir gözetim mekanizmasını etkinleştirir. Bu mek....

Protocol

Bu protokollerde kullanılan tüm fareler, Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi (Protokol 201702497) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına göre barındırılmış ve yetiştirilmiştir. Bu düzenleyici kurumlar, hayvan çalışmalarını içeren tüm deneysel prosedürleri onayladı. Bu çalışmada kullanılan tüm fareler 6-8 haftalık CF-1 dişileriydi.

1. Deneysel hazırlık

1. SAC değerlendirmelerine başlamadan önce, daha önce yayınlanan rapor^12'yi takiben fare oositlerini toplayın. Toplanan yumurtaları eşit büyüklükte üç gruba bölün ve mayotik^{yeniden başlamayı}

Results

NOKODAZOL tedavisi ile SAC yanıtının değerlendirilmesi
Bu deneyin amacı SAC aktivasyonunu ve gücünü değerlendirmektir. İş mili mikrotübüllerini depolimerize etmek için nokodazol kullanılarak, tüm kinetochores bağlanmamış olacak ve bu da SAC aracılı hücre döngüsü durmasına neden olacaktır. Mevcut görüntüleme sisteminde, DMSO ile tedavi edilen kontrol oositleri, milrinondan salındıktan yaklaşık 14 saat sonra polar bir gövdeyi ekstrüde etti (Şekil 1, üst paneller). SAC aktiv.......

Discussion

İş mili montaj kontrol noktası, kromozom ayrışma hatalarını önlemek için tasarlanmış hücre bölünmesi sırasında kritik bir kontrol mekanizmasıdır. Hücrenin yanlış KT-MT eklerini düzeltmek için yeterli zamana sahip olmasını sağlar. Oositlerde mayoz, kromozom yanlış ayrışmasının çoğunun mayoz I sırasında meydana geldiği ve insanlarda erken düşüklerin ve kısırlığın ana nedeni olan anöploid yumurtaların üretilmesine yol açan hataya eğilimli bir süreçtir ^1,24. Kadın ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Yaşam Teknolojileri	D1306
Dimetil-sülfoksit (DMSO)	Sigma	D5879
Eşek-anti-tavşan-Alexa-568	Yaşam Teknolojileri	A10042
EVOS FL Otomatik Görüntüleme Sistemi	Yaşam Teknolojileri		Floresan mikroskobu
EVOS Sahnede İnkübatör	Yaşam Teknolojileri		Kuluçka odası
Cam Alt 96 kuyulu plakalar N 1.5 kaplamasız	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
keçi-anti-insan-Alexa-633	Yaşam Teknolojileri	A21091
HEPES	Sigma	H3537
İnsan anti-ACA	Antikorları Dahil	15-234	Seyreltme 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8, 63&, 1.40 NA yağa daldırma objektifi	Leica
MgSO4 ve orta nokta ile donatılmıştır; 7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nokodazol	Sigma	M1404
Paraformaldit (PFA)	Sigma	P6148
BORULAR	Sigma	P6757
Tavşan anti-MAD2	Biyoefsane	924601	Seyreltme 1/1000; daha önce Covance #PRB-452C
Tersine Dönüş	Cayman Kimyasal	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vektör laboratuvarları	H-1000