Yöntem makalesi

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

DOI:

10.3791/64462

⸱

16 Eylül 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyinciğin hassas ve zamanında gelişimi sadece doğru motor koordinasyon ve denge için değil, aynı zamanda biliş için de çok önemlidir. Ek olarak, serebellar gelişimdeki bozulma, otizm, dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve şizofreni dahil olmak üzere birçok nörogelişimsel bozuklukta rol oynamıştır. İnsanlarda serebellar gelişimin araştırılması daha önce sadece ölüm sonrası çalışmalar veya nörogörüntüleme yoluyla mümkün olmuştur, ancak bu yöntemler, birçok nörogelişimsel bozukluğun ortaya çıktığı erken gelişim sırasında in vivo olarak meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri anlamak için yeterli değildir. Somatik hücrelerden insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) üretme tekniklerinin ortaya çıkması ve iPSC'leri nöronlara daha fazla yeniden ayırt etme yeteneği, erken beyin gelişiminin in vitro modellemesinin yolunu açmıştır. Bu çalışma, 2 boyutlu (2B) tek katmanlı bir yapı gerektiren uygulamalar için serebellar hücreler üretmeye yönelik basitleştirilmiş adımlar sunmaktadır. Erken gelişim aşamalarını temsil eden serebellar hücreler, aşağıdaki adımlarla insan iPSC'lerinden türetilir: ilk olarak, embriyoid cisimler 3 boyutlu (3D) kültürde yapılır, daha sonra serebellar kader spesifikasyonunu teşvik etmek için FGF2 ve insülin ile muamele edilir ve son olarak, poli-l-ornitin (PLO) / laminin kaplı substratlar üzerinde tek katmanlı olarak terminal olarak farklılaştırılırlar. 35 günlük farklılaşmada, iPSC kaynaklı serebellar hücre kültürleri, ATOH1, PTF1α, PAX6 ve KIRREL2 dahil olmak üzere serebellar belirteçleri eksprese eder, bu da bu protokolün glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncüllerin yanı sıra Purkinje hücre progenitörleri ürettiğini düşündürür. Ayrıca, farklılaşmış hücreler farklı nöronal morfoloji gösterir ve TUBB3 gibi nöronal kimliğin immünofloresan belirteçleri için pozitiftir. Bu hücreler, semaforin-4C, pleksin-B2 ve nöropilin-1 dahil olmak üzere aksonal rehberlik moleküllerini eksprese eder ve nörit büyümesinin ve sinaptik bağlantının moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model olarak hizmet edebilir. Bu yöntem, 2D tek katmanlı formatlar gerektiren gen ekspresyonu, fizyolojik ve morfolojik çalışmalar dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yararlı insan serebellar nöronları üretir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan serebellar gelişimini ve bu sürecin kritik zaman pencerelerini anlamak, sadece nörogelişimsel bozuklukların olası nedenlerini çözmek için değil, aynı zamanda terapötik müdahale için yeni hedeflerin belirlenmesi için de önemlidir. İnsan serebellar gelişiminin in vitro olarak modellenmesi zor olmuştur, ancak zamanla, insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) veya iPSC'leri serebellar soy kaderleriyle farklılaştıran birçok protokol ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8 . Ayrıca, tekrarlanabilir sonuçlar üreten, nispeten basit (hatayı azaltmak için) ve parasal maliyetler üzerinde ağır olmayan protokoller geliştirmek önemlidir.

Serebellar farklılaşma için ilk protokoller, kaplanmış embriyoid cisimlerden (EB'ler) 2D kültürlerden üretildi ve WNT, BMP'ler ve FGF'ler 1,9 dahil olmak üzere in vivo gelişime benzer çeşitli büyüme faktörleriyle serebellar kaderi indükledi. Daha yeni yayınlanan protokoller, öncelikle FGF2 ve insülin ile 3D organoid kültüründe farklılaşmaya neden oldu, ardından eşkenar dörtgen dudak benzeri yapılar3,4 için FGF19 ve SDF1 izledi veya FGF2, FGF4 ve FGF85'in bir kombinasyonunu kullandı. Her iki serebellar organoid indüksiyon yöntemi de benzer 3D serebellar organoidlerle sonuçlandı, çünkü her iki protokol de aynı zaman noktalarında benzer serebellar belirteç ekspresyonu bildirdi. Holmes ve Heine, 2D serebellar hücrelerin 3D agregalar olarak başlayan hESC'lerden ve iPSC'lerden üretilebileceğini göstermek için 3D protokol5'lerini genişletti. Ek olarak, Silva ve ark.7, 2D'deki olgun serebellar nöronları temsil eden hücrelerin, 3B'den 2B'ye geçmek ve büyüme ve olgunlaşma süresini uzatmak için farklı bir zaman noktası kullanarak, Holmes ve Heine'e benzer bir yaklaşımla üretilebileceğini göstermiştir.

Mevcut protokol, insülin ve FGF2 kullanarak serbest yüzen embriyoid cisimler (EB'ler) üreterek ve daha sonra EB'leri 2D büyüme ve farklılaşma için 14. günde FK / laminin kaplı tabaklara kaplayarak besleyicisiz iPSC'lerde serebellar kaderi indüklemektedir. 35. günde, serebellar kimliğe sahip hücreler elde edilir. Serebellar gelişimin erken aşamalarını, özellikle 2D bir ortamda, özetleme yeteneği, araştırmacıların tek katmanlı bir yapı ile deneyler gerektiren belirli soruları cevaplamalarını sağlar. Bu protokol aynı zamanda istenen hücre popülasyonlarını zenginleştirmek için mikro desenli yüzeyler, aksonal büyüme testleri ve hücre sıralama gibi daha ileri modifikasyonlara da uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan denekleri araştırması, 201805995 Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu onay numarası ve Iowa Üniversitesi İnsan Pluripotent Kök Hücre Komitesi onay numarası 2017-02 altında onaylanmıştır. Deneklerden deri biyopsileri yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra alındı. Fibroblastlar DMEM'de %15 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 MEM-esansiyel olmayan amino asit solüsyonu ile 37 °C'de ve %5 CO2'de kültürlendi. Fibroblastlar, elektroporasyon için bir nükleofektör kullanılarak üreticinin protokolünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) takiben epizomal bir yeniden programlama kiti kullanılarak yeniden programlandı. Tüm prosedürler Sınıf II Tip A2 biyolojik güvenlik kabininde ("kısaca "başlık") gerçekleştirildi. Tüm hücre kültürü ortamları antibiyotik içermiyordu; bu nedenle, davlumbaza giren her bileşen %70 etanol ile temizlendi. Tüm hücre kültürü ortamları ve bileşenleri, sterilitelerini korumak için steril filtrelenmiş veya davlumbazda açılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

  1. Bodrum membran matrisi (BMM) kaplı plakalar hazırlayın.
    NOT: BMM, daha sıcak sıcaklıklarda daha hızlı katılaşır. Plakalar hızlı bir şekilde hazırlanmalı ve depolanması için hemen 4 ° C'ye yerleştirilmelidir.
    1. BMM'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde, 4 °C'de en az 2 saat veya gece boyunca çözün.
    2. DMEM/F12 ve BMM'yi 80 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar karıştırın. BMM çözeltisini doku kültürü kaplarına dağıtın (35 mm için 1 mL ve 60 mm tabaklar için 2 mL) ve hücreleri kaplamadan önce en az 1 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Kullanılmayan tabaklar 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
  2. Poli-L-ornitin/laminin (PLO/laminin) kaplı plakalar hazırlayın.
    1. Steril DPBS +/+ içinde 20 μg / mL PLO ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Ertesi gün, FKÖ'yü bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve DPBS + / + ile iki kez yıkayın. Kaputta hava kurutulur.
      NOT: Havada kurutulmuş plakalar, gelecekte kullanılmak üzere alüminyum folyoya sarılmış olarak 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.
    3. DPBS +/+ içinde 10 μg / mL laminin (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde en az 3 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Laminini bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 1 mL orta veya steril DPBS + / + ekleyin.
      NOT: Laminin kaplama kurumamalıdır. Bunu önlemek için PBS veya uygun bir kültür ortamı derhal eklenmelidir. Kaplamalı plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
  3. PSC passaging çözümünü hazırlayın.
    NOT: PSC geçiş çözeltisi10'u yapmak için bir ozmometre (Malzeme Tablosuna bakınız) gereklidir.
    1. 11.49 g potasyum klorür (KCl) ve 0.147 g sodyum sitrat dihidrat (HOC (COONa) (CH 2 COONa) 2 * 2H 2 O) 400 mL steril hücre kültürüsınıfı suda çözün (bkz.
    2. Çözeltinin hacmini ölçün ve başlangıç hacmi (Vi) olarak kaydedin.
    3. Ozmolariteyi ölçün ve Vi × Oi = Vf × 570 mOsm formülünü kullanarak steril hücre kültürü sınıfı su ekleyerek 570 mOsm'a ayarlayın.
    4. Çözeltiyi 0.20 μm'lik bir filtre ile filtreleyerek sterilize edin ve 10 mL alikot yapın. Alikotları oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.
  4. Pluripotent kök hücre (PSC) ortamı hazırlayın.
    NOT: iPSC'ler, ısıya dayanıklı FGF2 içeren bir ortamda tutulur ( Malzeme Tablosuna bakınız), hafta sonu içermeyen bir besleme programı sağlar. Ticari olarak temin edilebilen diğer PSC ortamları bu protokol için denenmemiştir.
    1. PSC orta takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözün.
    2. 500 mL bazal PSC ortamına 10 mL PSC ortam takviyesi ekleyin. 25 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Dondurulmuş alikotlar 6 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Çözülmüş alikotlar 4 ° C'de saklanmalı ve 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Hücreler, %10 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir PSC ortamında uzun süreli depolama için dondurulabilir.
  5. PSC çözme ortamını hazırlayın.
    1. 50 nM kroman, 1.5 μM emricasan, 1x poliamin takviyesi ve 0.7 μM trans-ISRIB (CEPT kokteyli11) ile PSC ortamını destekleyin (bkz.
    2. 0,20 μm filtre ile filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
  6. Çekilmiş cam pipetler hazırlayın.
    1. 22,9 cm (9 inç) cam Pasteur pipetleri bir Bunsen brülörün üstünde, boynun ~2 cm altında iki parçaya çekerek iki pipet oluşturun, daha ince tarafı diğerinden ~4 cm daha kısadır.
    2. Alevin yardımıyla, pürüzsüz bir "r" oluşturmak için çekilen tarafın uçlarını bükün.
    3. Çekilen pipetleri sterilizasyon için otoklav manşonlarına ve otoklavlara yerleştirin.
  7. Serebellar farklılaşma ortamı (CDM) hazırlayın.
    1. IMDM ve Ham'ın F12 besin karışımını 1: 1 oranında karıştırın. Karışımı 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi,% 1 (v / v) kimyasal olarak tanımlanmış lipit konsantresi, 0.45 mM 1-tiyo-gliserol, 15 μL / mL apo-transferrin, 5 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 7 μg / mL insülin ile destekleyin (bkz.
    2. 0,20 μm filtre ile filtre sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.
  8. Serebellar olgunlaşma ortamı (CMM) hazırlayın.
    1. 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi ve 1x N-2 takviyesi ile nörobazal ortamı destekleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
    2. 0,20 μm filtre ile filtre sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde kullanın.

2. Besleyicisiz iPSC kültürü

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri çözün.
    1. Hücreleri çözmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca jelleşmek için 37 °C inkübatöre bir BMM plakası (adım 1.1) yerleştirin.
    2. 37 °C'de önceden ısıtılmış 10 mL PSC çözme ortamı (adım 1.5).
    3. Kriyovyali hücrelerle sıvı azottan 37 ° C'de bir su banyosuna aktarın.
      NOT: Hücre kültürü alanında bir kontaminasyon kaynağı oluşmasını önlemek için, standart bir su banyosu kullanılması önerilmez. Bunun yerine, tatlı su, bir kerelik kullanım su banyosu oluşturmak için küçük bir beherde 37 ° C'ye ısıtılabilir.
    4. Tüpte küçük bir buz parçası kaldığında, su banyosundan çıkarın, tüpü kurutun ve% 70 etanol ile püskürtün. Tüpü davlumbaza aktarın ve hücreleri nazikçe 15 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için 2 mL veya 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    5. Konik tüpü döndürürken hücrelere damla damla 8 mL PSC çözme ortamı ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    6. Süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Hücreleri 2 mL PSC çözme ortamında yeniden askıya alın.
    7. BMM'yi plakadan aspire edin ve eşit dağılım için yeniden askıya alınmış hücreleri plakanın her yerine damla damla ekleyin.
    8. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de,% 5 CO2'ye yerleştirin. PSC ortamı ile ertesi gün ortamı yenileyin. Bundan sonra, ortamı günlük olarak değiştirin.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri koruyun.
    1. Gerekli PSC ortam hacmini 37 ° C'de önceden ısıtın (örneğin, 35 mm plaka başına 1 mL ortam).
    2. Diferansiye hücreler veya koloniler için plakaları araştırın ve farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipetle çıkarın (adım 1.6).
      NOT: iPSC kolonileri, morfolojik olarak aynı hücrelere sahip pürüzsüz kenarlara sahiptir.
    3. Harcanan ortamı günlük olarak değiştirin ve her 3-4 günde bir veya% 70 akıcılığa ulaşıldığında geçiş yapın.
  3. Hücreleri geçirin.
    1. Gerekli miktarda BMM plakasını, geçmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Gerekli miktarda PSC ortamını (adım 1.3) 37 °C'de önceden ısıtın.
    2. Çekilmiş bir cam pipet kullanarak, farklılaşmış hücreleri veya kolonileri temizleyin.
    3. Harcanan ortamı bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 35 mm çanak başına 1 mL PSC ayrışma ortamı ekleyin. 1-3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: PSC ortamı eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.
    4. PSC pasaj solüsyonunu aspire edin ve önceden ısıtılmış PSC ortamı ekleyin.
    5. Steril bir 200 μL pipet ucu kullanarak, çizik çizgilerini bir yönde birbirine paralel hale getirin, plakayı 90° döndürün ve öncekilere dik ikinci bir çizik çizgileri seti yapın (plaka boyunca çapraz taranmış bir desen oluşturur).
    6. BMM çözeltisini ayarlanmış plakalardan aspire edin. Serolojik bir pipet kullanarak kolonileri toplayın ve yeni BMM plakalarına dağıtın.
    7. 37 °C'de inkübe edin,% 5 CO2. Ortamı günlük olarak değiştirin.
  4. Hücreleri dondurun.
    1. İçeriği etiketleyerek kriyovyalleri hazırlayın ve 30 dakika boyunca davlumbazda ultraviyole ( UV) ışık altında sterilize edin (bkz.
    2. PSC ortamını %10 (v/v) DMSO ile destekleyerek PSC dondurma ortamını hazırlayın. 2.3.2-2.3.5 arasındaki adımları izleyin.
    3. Hücreleri 5 mL'lik serolojik pipetle 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
    4. Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini PSC dondurma ortamında yeniden askıya alın.
    5. Kriyovallere dağıtın. Şişeleri dondurucu bir kaba koyun ve kabı -80 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
    6. Ertesi gün, kriyovyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.

3. Serebellar farklılaşma

NOT: Farklılaştırmaya başlamadan önce, iPSC'ler altı adet 35 mm'lik kalıba geçirilir ve %70 akıcılıkta olduklarında farklılaşmaya hazırdır. Her 35 mm'lik plaka, 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna aktarılacaktır.

  1. 0. günde, EB oluşumu için sağlıklı iPSC kolonilerini kaldırın.
    1. 6 kuyulu ultra düşük ataşman (ULA) plakasının her bir kuyucuğuna 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş 1 mL CDM (adım 1.7) ekleyin ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin.
    2. Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin. Ortamı aspire edin ve her 35 mm'lik çanak için 1 mL PSC pasaj çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe edin, aspire edin ve 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ile desteklenmiş 2 mL CDM ekleyin.
      NOT: CDM eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.
    3. İletilen ışıklı ters çevrilmiş mikroskop altında, 4x büyütme kullanarak çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri yavaşça kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak hepsini 6 delikli ULA plakasının bir kuyucuğuna yavaşça aktarın. Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
      NOT: Koloniler çok büyükse veya birleştirilmişse, daha küçük EB'ler oluşturmak için çekilmiş cam pipetin ucuyla dilimlenebilirler.
  2. 2. günde, her bir kuyucuğa FGF2'yi 50 ng / mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
    NOT: Serebellar farklılaşma için kullanılan FGF2 ısıya dayanıklı değildir. Bu protokol ısıya dayanıklı FGF2 ile test edilmemiştir.
  3. 7. günde, 1/3 orta bir değişim yapın. Bir kuyucuktaki toplam 3 mL ortam için, 1.000 μL'lik bir pipetleyici ile, 1 mL harcanmış ortamı nazikçe aspire edin ve 1 mL taze CDM ile değiştirin. EB'leri 7 gün boyunca inkübe edin.
  4. 14. günde, 1.000 μL'lik bir pipetör kullanarak harcanan ortamın neredeyse tamamını nazikçe aspire edin. EB'lere minimum hasar verilmesini sağlamak için, plakanın ortasındaki tüm EB'leri toplamak için plakayı döndürün ve ardından plakayı eğin ve kenardan yavaşça aspire edin.
    1. Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yerleştirin ve aspirasyona devam edin. EB'lerin kurumasını önlemek için yeterli ortam bırakın. Daha sonra, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL taze CDM ekleyin. EB'leri 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak PLO/laminin kaplı bir kaba aktarın (adım 1.2).
      NOT: Çıkış yönündeki uygulamaya bağlı olarak, EB'ler 6 delikli bir PLO/laminin plakasına veya tek EB'ler PLO/laminin kaplı 24 delikli plaka veya kapak kaymasının tek bir kuyucuğuna aktarılabilir.
  5. 15. günde, ortamı aspire edin ve taze CDM ile değiştirin.
    NOT: Beslemeler arasında yeterli ortamı sağlamak için kuyucuklara yeterli ortam eklemek önemlidir, çünkü zamanla buharlaşma olacaktır (örneğin, 6 delikli bir plakadaki bir kuyu için 3 mL ortam ekleyin). Ortam asitleşmeye başladıysa (berrak ve sarıya dönerse), protokolün sonuna kadar besleme programında olmasa bile ortamı yenileyin.
  6. 21. günde, harcanan ortamı aspire edin ve CMM ile değiştirin. 28. günde, ortamı taze CMM ile değiştirin. 35. günde, daha fazla uygulama için hücreleri toplayın.

4. RNA izolasyonu için numune hazırlama

  1. Ortamı aspire edin ve 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Birkaç saniye bekletin ve aspire edin.
  2. Plakayı, kapağı açıkken, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri ayırmak için plakanın kenarlarına dokunun.
  3. 1 mL CMM ekleyin (adım 1.8) ve hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe toplayın.
  4. RT'de (maksimum hız 2000 x g) 30 sn için tezgah üstü bir mini santrifüj (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücreleri santrifüjleme yoluyla peletleyin, ortamı atın ve hücre peletini yıkamak için 1 mL 1x PBS pH 7.4 ekleyin.
  5. RT'de 30 sn'lik masaüstü mini santrifüj kullanarak hücreleri tekrar pelet edin ve PBS ile bir kez daha yıkayın.
  6. Hücreleri toplayın ve PBS'yi atın. Reaktif içeren fenol ve guanidin izotiyosiyanat içindeki hücreleri lize edin (bakınız Malzeme Tablosu).
    NOT: Fenol ve guanidin izotiyosiyanat içeren reaktifte lize edilen hücreler -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Hücreler, RNA izolasyon yöntemine ve kullanılan reaktiflere bağlı olarak doğrudan çanak içinde lize edilebilir. Bir çanaktaki düşük hücre sayısı nedeniyle, RNA'yı silika spin sütunları kullanarak izole etmek ( bakınız Malzeme Tablosu) daha yüksek RNA verimine neden olacaktır.

5. İmmünofloresan boyama için hücrelerin hazırlanması

NOT: 24 delikli bir plaka için, kuyu başına bir EB yeterlidir.

  1. 35. günde, harcanan ortamı aspire edin ve kuyu başına 1 mL DPBS +/+ ekleyerek hücreleri yıkayın (24 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için).
  2. DPBS +/+ aspire edin ve kuyucuk başına DPBS +/+ içinde hazırlanan 500 μL soğuk% 4 paraformaldehit (PFA, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. RT'de 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. % 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri adım 5.1'de olduğu gibi DPBS +/++ ile iki kez yıkayın. 1 mL DPBS +/+ ekleyin ve boyama yapılana kadar hücreleri 4 ° C'de saklayın.
    NOT: Hücre dekolmanı ve antijen kaybını önlemek için immünofloresan boyamanın fiksasyondan sonraki 1 hafta içinde yapılması önerilir. Bununla birlikte, antikora ve hedefin hücresel konumuna bağlı olarak, boyama fiksasyondan 4 hafta sonrasına kadar daha sonraki zamanlarda yapılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3B'den 2B'ye serebellar farklılaşmaya genel bakış
Serebellar hücreler iPSC'lerden başlayarak üretilir. Şekil 1A , genel iş akışını ve farklılaştırma için ana bileşenlerin eklenmesini göstermektedir. 0. günde, EB'ler, SB431542 ve Y-27632 içeren CDM'de çekilmiş bir cam pipet kullanılarak iPSC kolonilerinin yavaşça kaldırılmasıyla yapılır (Şekil 1B) ve ultra düşük ataşmanlı plakalara yerleştirilir. FGF2, 2. günde eklenir. 7. günde, ortamın üçte ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan serebellar gelişimini in vitro olarak modelleme yeteneği, hastalık modellemesi için ve normal beyin gelişiminin anlaşılmasını ilerletmek için önemlidir. Daha az karmaşık ve uygun maliyetli protokoller, çoğaltılabilir veri üretimi ve birden fazla bilimsel laboratuvarda geniş uygulama için daha fazla fırsat yaratır. Burada, Muguruma ve ark. tarafından bildirilen büyüme faktörleri kullanılarak, enzimler veya ayrışma ajanları gerektirmeyen EB'ler üretmek için modifiye edilmiş bir yöntem kullanılarak bir serebe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jenny Gringer Richards'a, kontrol iPSC'lerini oluşturduğumuz kontrol konularımızı doğrulamadaki kapsamlı çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH T32 MH019113 (D.A.M. ve K.A.K.'ya), Nellie Ball Trust (T.H.W. ve A.J.W.'ye), nih R01 MH111578 (V.A.M. ve J.A.W.'ye), nih KL2 TR002536 (A.J.W.'ye) ve Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. ve A.J.W.) tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender.com ile yaratıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 mL Serolojik pipetFisher Scientific13-678-26D
1-tiyo-gliserolSigmaM6145
2 mL Serolojik pipetFisher Scientific13-678-26B
250 mL Filtre Ünitesi, 0.2 & m aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Kolay Kavramalı Doku Kaplama KabıFalcon353001
4D Nükleofektör çekirdek ünitesiLonza276885Nükleofektör
5 mL Serolojik pipetFisher Scientific13-678-25D
60 mm Kolay Kavramalı Doku Kültürü KabıFalcon353004
6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakalarıCorning3471
9" Tek Kullanımlık Pastör PipetleriFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrinSigmaT1147
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA9418
Hücre kültürü sınıfı suCytivaSH30529.02
Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresiGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Sınıf II, Tip A2, Biyolojik Güvenlik KabiniNuAire, Inc.NU-540-600Başlık, UV ışığı
Costar 24 oyuklu plaka, TC ile muameleCorning3526
Costar 6 oyuklu plaka, TC ile muameleedilmiş Corning3516
DAPI çözeltisiThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimetik sülfoksit)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 epizomal iPSC yeniden programlama kitiYaşam TeknolojileriA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501ısıya dayanıklı FGF2
EVOS XL Çekirdek Görüntüleme sisteminePSC ortamı Yaşam TeknolojileriAMEX1000
Fetal sığır serumu - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX takviyesiGibco35050061L-alanin-L-glutamin takviyesi
Jambonun F12 Besin KarışımıGibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 inkübatörüThermo Scientific50144906
İnsan Anti-EN2, fareSanta Cruz Biyoteknolojisc-293311
İnsan anti-Ki67/MKI67, tavşanR& D SistemleriMAB7617
İnsan anti-PTF1a, tavşanNovus BiologicalsNBP2-98726
İnsan anti-TUBB3, fareBiolegend801213
IMDMGibco12440053
İnsülinGibco12585
Laminin Fare ProteiniGibco23017015
Matrigel MatrisiCorning354234Temel membran matrisi
MEM-NEAAGibco11140050
Mini SantrifüjLabnet InternationalC1310Tezgah üstü mini santrifüj
Monarch RNA Temizleme Kiti (50 ve mikro; g)New England BioLabsT2040Silika döndürme sütunları
Monarch Toplam RNA Miniprep KitiNew England BioLabsT2010Silika döndürme sütunları
N-2 takviyesiGibco17502-048
Nörobazal ortamGibco21103049
PBS, pH 7.4Gibco10010023
PFA %16Elektron Mikroskobu Bilimleri15710
Poliamin takviyesiSigmaP8483
Poli-L-Ornitin (PLO)Sigma3655
Potasyum klorürSigma746436
SB431542Sigma54317
Kendinden yapışkanlı poşetlere bakınSterikingSS-T2 (90x250)Otoklav poşetler
Sodyum sitrat dihidrat Fisher ScientificS279-500
Şırınga filtreleri, steril, PES 0.22 ve mikro; m, 30 mm DiaAraştırma Ürünleri Uluslararası256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol Reaktifiİnvitrojen15596018Fenol ve guanidin izotiyosiyanat
TrypLE Express Enzim (1x)Gibco12604039Hücre ayrışma reaktifi 
Buhar basıncı ozmometresiWescor, Inc.Model 5520Ozmometre
Y-27632Biyogemler1293823
edilmiş sahip

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959(2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012(2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232(2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Human iPSCs2D Monolayer CultureEmbryoid BodiesCerebellar DifferentiationNeuronal ProgenitorsPurkinje Cell ProgenitorsImmunofluorescence MarkersAxonal Guidance MoleculesNeurodevelopmental Disorders

İlgili makaleler