İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

Deniz A. Madencioglu; Karina A. Kruth; Thomas H. Wassink; Vincent A. Magnotta; John A. Wemmie; Aislinn J. Williams

doi:10.3791/64462

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64462

⸱

16 Eylül 2022

Deniz A. Madencioglu¹^,³^,⁴^,⁵ , Karina A. Kruth¹^,³^,⁴^,⁵ , Thomas H. Wassink¹^,³ , Vincent A. Magnotta¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , John A. Wemmie¹^,³^,⁴^,⁵ , Aislinn J. Williams¹^,³^,⁴^,⁵

¹Department of Psychiatry, University of Iowa, ²Department of Radiology, University of Iowa, ³Carver College of Medicine, University of Iowa, ⁴Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, ⁵Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

Özet

Beyinciğin hassas ve zamanında gelişimi sadece doğru motor koordinasyon ve denge için değil, aynı zamanda biliş için de çok önemlidir. Ek olarak, serebellar gelişimdeki bozulma, otizm, dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve şizofreni dahil olmak üzere birçok nörogelişimsel bozuklukta rol oynamıştır. İnsanlarda serebellar gelişimin araştırılması daha önce sadece ölüm sonrası çalışmalar veya nörogörüntüleme yoluyla mümkün olmuştur, ancak bu yöntemler, birçok nörogelişimsel bozukluğun ortaya çıktığı erken gelişim sırasında in vivo olarak meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri anlamak için yeterli değildir. Somatik hücrelerden insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) üretme tekniklerinin ortaya çıkması ve iPSC'leri nöronlara daha fazla yeniden ayırt etme yeteneği, erken beyin gelişiminin in vitro modellemesinin yolunu açmıştır. Bu çalışma, 2 boyutlu (2B) tek katmanlı bir yapı gerektiren uygulamalar için serebellar hücreler üretmeye yönelik basitleştirilmiş adımlar sunmaktadır. Erken gelişim aşamalarını temsil eden serebellar hücreler, aşağıdaki adımlarla insan iPSC'lerinden türetilir: ilk olarak, embriyoid cisimler 3 boyutlu (3D) kültürde yapılır, daha sonra serebellar kader spesifikasyonunu teşvik etmek için FGF2 ve insülin ile muamele edilir ve son olarak, poli-l-ornitin (PLO) / laminin kaplı substratlar üzerinde tek katmanlı olarak terminal olarak farklılaştırılırlar. 35 günlük farklılaşmada, iPSC kaynaklı serebellar hücre kültürleri, ATOH1, PTF1α, PAX6 ve KIRREL2 dahil olmak üzere serebellar belirteçleri eksprese eder, bu da bu protokolün glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncüllerin yanı sıra Purkinje hücre progenitörleri ürettiğini düşündürür. Ayrıca, farklılaşmış hücreler farklı nöronal morfoloji gösterir ve TUBB3 gibi nöronal kimliğin immünofloresan belirteçleri için pozitiftir. Bu hücreler, semaforin-4C, pleksin-B2 ve nöropilin-1 dahil olmak üzere aksonal rehberlik moleküllerini eksprese eder ve nörit büyümesinin ve sinaptik bağlantının moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model olarak hizmet edebilir. Bu yöntem, 2D tek katmanlı formatlar gerektiren gen ekspresyonu, fizyolojik ve morfolojik çalışmalar dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yararlı insan serebellar nöronları üretir.

Giriş

İnsan serebellar gelişimini ve bu sürecin kritik zaman pencerelerini anlamak, sadece nörogelişimsel bozuklukların olası nedenlerini çözmek için değil, aynı zamanda terapötik müdahale için yeni hedeflerin belirlenmesi için de önemlidir. İnsan serebellar gelişiminin in vitro olarak modellenmesi zor olmuştur, ancak zamanla, insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) veya iPSC'leri serebellar soy kaderleriyle farklılaştıran birçok protokol ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8 ^....