Ayak Bileği Subtalar Kompleks Eklem İnstabilitesinin Bir Fare Modeli

Ayak bileği burkulmaları dünya çapında en yaygın spor yaralanmalarından biridir. Amerika Birleşik Devletleri'nde günde 10.000 kişinin yaralandığı tahmin edilmektedir¹ ve bunların %15-45'ini sporla ilgili yaralanmalar ^{oluşturmaktadır2}. Amerika Birleşik Devletleri'nde ayak bileği burkulmalarının tedavisiyle ilgili tıbbi maliyetler yıllık 4,2 milyar dolar^{tutarındadır} 3,4,5. Kronik ayak instabilitesi, ayak bileği burkulmalarını takiben yaygın bir sorundur ve ayak bileği veya subtalar instabilite dahil olmak üzere ayak bileği burkulmalarının yaklaşık %74'ünde^{görülür 6}. Bununla birlikte, benzer klinik semptom ve bulgular nedeniyle, sağlık personelinin kronik ayak bileği instabilitesine klinikte kronik subtalar eklem instabilitesinin de eşlik edip etmediğini ayırt etmesi zordur ve sonuç olarak kronik subtalar instabilite kolayca gözden kaçabilir. Bu nedenle, kronik ayak bileği-subtalar kompleks eklem (ASCJ) instabilitesinin (hem kronik ayak bileği instabilitesini hem de kronik subtalar instabiliteyi içeren spesifik bir kronik ayak instabilitesi türü) gerçek insidansı bildirilenden daha yüksek olabilir ^7,8,9. Tedavi edilmezse, kronik ayak bileği subtalar kompleks eklem instabilitesi, tekrarlayan ayak bileği burkulmalarına neden olarak ayak bileği burkulmaları ve kronik ayak bileği subtalar kompleks instabilitesi kısır döngüsüne yol açabilir. Uzun süreli kronik ayak bileği-subtalar kompleks instabilitesi, ASCJ'nin dejenerasyonuna ve ciddi vakalarda komşu eklemleri etkileyebilecek travma sonrası osteoartrite yol açabilir¹⁰. Bu hastalıklar için mevcut klinik tedavi, bağ onarımı ve bağ rekonstrüksiyonu gibi cerrahi tedavi yöntemlerine ek olarak esas olarak konservatiftir^11,12.

ASCJ, ayağın çekirdek yapısıdır ve hareket sırasında vücudun dengesini korur¹³. Ayak bileği eklemi ve subtalar eklemin yapısı hakkında ayrı ayrı kapsamlı araştırmalar yapılmıştır^14,15,16,17. Bununla birlikte, tüm ayak bileği-subtalar eklem üzerine araştırmalar nadirdir. Ayak bileği yaralanması vakalarının yaklaşık dörtte biri subtalar eklem yaralanması ile ilişkilidir¹⁸. ASCJ instabilitesinin karmaşık yaralanma mekanizması nedeniyle, klinik ortamda tanı ve tedavisi konusunda fikir birliği yoktur. Klinikte ayak bileği yaralanmalarının mevcut durumu göz önüne alındığında, ayak bileği ve subtalar eklemi bir bütün olarak incelemek için daha bilimsel bir yönteme ihtiyaç duyulmakta ve böylece ayak hastalıklarının incelenmesi için yeni bir anlayış sağlanmaktadır.

Farenin arka ayağının kas-iskelet sistemi seviyesindeki anatomik yapısı insan ayağınınkiyle karşılaştırılabilir olduğundan¹⁹, çeşitli çalışmalarda ayak/ayak bileği araştırmaları için fare modelleri zaten uygulanmıştır^10,19. Chang ve ^ark.19, ayak bileği osteoartritinin üç farklı fare modelini başarıyla geliştirdi. Fare modelinde ayak bileği instabilitesinin başarılı bir şekilde kurulmasından esinlenerek, ayak bileği-subtalar kompleks instabilitesi için bir fare modeli oluşturduk ve farenin arka ayağındaki kısmi bağların transeksiyonunun ASCJ'nin mekanik instabilitesine yol açacağını ve bunun da ASCJ'nin travma sonrası osteoartritine (PTOA) yol açacağını varsaydık. ASCJ instabilite hayvan modeli, hem ayak bileği instabilitesinin hem de subtalar instabilitenin tedavisi için kullanılabilir, bu da şu anda kullanılan basit ayak bileği instabilitesi^{modeli 7,8,9,19'dan} daha gerçek klinik durumla daha uyumludur. Bu hipotezi test etmek için, ASCJ'nin bağ transeksiyonuna bağlı instabilitesinin iki fare modeli tasarlandı. Modelin fizibilitesini değerlendirmek için duyusal-motor fonksiyon sonuçları - denge ışını testi, ayak izi analizi ve termal nosisepsiyon değerlendirmesi - kullanıldı ve fare eklem kıkırdağının hasarını ve dejenerasyonunu değerlendirmek için mikro-bilgisayarlı tomografi (BT) ve histolojik boyama kullanıldı. ASCJ instabilitesinin bir fare modelinin başarılı bir şekilde kurulması, sadece ayak hastalıklarının incelenmesi için yeni bir anlayış sağlamakla kalmaz, aynı zamanda yaralanma ile ilgili mekanizmalar üzerine klinik araştırmalar için değerli bir referans sağlar, ayak bileği burkulmaları için daha iyi tedavi seçenekleri sağlar ve hastalıkla ilgili daha ileri çalışmalar için yararlıdır.

Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi ve Soochow Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Cerrahi prosedürler

1. 21, 6 haftalık C57BL / 6 erkek fareyi üç gruba ayırın: transvers servikal ligament ve anterior talofibular ligament grubu, transvers servikal ligament ve deltoid ligament grubu ve sahte cerrahi grubu. Tüm farelerin belirli patojen içermeyen (SPF) standartları karşılayan bir ortamda yetiştirildiğinden emin olun.
2. Deneyden 2 hafta önce fareleri yeni yetiştirme ortamına (12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü ve sırasıyla 18-22 °C ve %40-70 sabit sıcaklık ve nem) alıştırın. Deneyden 1 hafta önce fareleri, denge kirişinin veya U şeklindeki bir borunun bir ucundan diğer ucuna durmadan giderek denge kirişi ve yürüyüş eğitimine tabi tutun.
3. 8 haftalıkken, bir pamuğu 2 mL izofluran ile ıslatarak ve tam buharlaşma için hava geçirmez bir kaba koyarak izofluran inhalasyonu kullanarak fareyi uyuşturun. Farenin aktivitesini izleyin ve farenin aktivitesi önemli ölçüde azalana kadar solumaya devam edin. Reaksiyonlarını gözlemlemek için farelerin ayak parmaklarını sıkıştırarak anestezi derinliğini belirleyin. Sonraki operasyonlar sırasında farelerde anesteziyi korumak için buharlaştırılmış izofluranı (% 2) bir yüz maskesi aracılığıyla soluyun. Gözlerin kurumasını önlemek için anestezi sırasında veteriner göz merhemi kullanın.
4. Anestezi uygulandıktan sonra, farenin sağ arka ayaklarının ayak bileği eklemindeki kılları bir tıraş makinesiyle alın ve açıkta kalan cildi alternatif olarak iyot pamuk topları ve alkollü pamuk topları ile üç kez dezenfekte edin. Deri altı enjeksiyonu ile 5 mg / kg carprofen uygulayın. Steril bir cerrahi ped kullanarak fareyi mikrocerrahi hayvan ameliyathanesine aktarın.
5. Transvers servikal ligament ve anterior talofibular ligament (CL + ATFL) grubu için, sağ ayak bileği ekleminin üzerindeki deride bir neşter ile 7 mm eğik aşağı doğru uzunlamasına bir kesi yapın ve ayak bileği ekleminin önünde mikroskobik düz forseps ile sonlayın.
6. Problamadan sonra ATFL'nin talus gövdesinin ve fibulanın alt sınırında açığa çıkmasını sağlayın ve bir neşter ile nazikçe kesin. Uzun ve kısa fibula tendonlarını ve ekstansör digitorum longus tendonlarını ayırın, CL'yi ortaya çıkarın ve bir neşter ile kesin.
7. Transvers CL + deltoid ligament (DL) grubu için, sağ ayak bileği ekleminin medial derisinde 8 mm'lik dikey bir kesi yapın ve sonunda kesmek için DL'yi medial malleolden künt olarak ayırın. Ardından, CL'yi adım 1.5'te açıklandığı gibi kesin.
8. Sahte grup (sahte cerrahi grubu) için, sağ ayak bileği ekleminde sahte ameliyat yapın, ancak herhangi bir bağı kesmeyin.
9. Kesi steril normal salinle yıkayın ve 5-0 cerrahi naylon iplikle dikin. Son olarak, dikişli kesiği bir iyot pamuk topu ile dezenfekte edin.
10. Fareyi sternal yaslanmaya devam edene kadar gözlem altında tutun ve tamamen bilinçli olana kadar denetleyin. Ayak bileği insizyonunu günde iki kez iyot pamuğu ile dezenfekte edin ve 1 hafta boyunca günde bir kez karprofen (5 mg / kg, deri altı enjeksiyon) uygulayın. Ameliyattan sonra tek başına arkaya dönün ve farenin ameliyat sonrası durumuna çok dikkat edin.
11. Ameliyattan iki hafta sonra ve ayak bileği eklem şişliği azaldığında, fareleri her gün 1 saat boyunca fare döner yorgunluk makinesinde çalıştırmaya başlayın.

2. Denge kirişi testi

1. 1 m uzunluğunda ve 20 mm çapında, bir ucunda 15° eğimli dairesel bir ahşap kirişi bir fotoğraf tripod klipsi ile sıkıştırın ve diğer ucunu kapalı bir kasete bağlı bir çalışma yüzeyine yerleştirin.
2. Farelerin ışının bir ucundan diğerine sorunsuz bir şekilde hareket etmesini sağlamak için ameliyattan 1 hafta önce denge kirişi eğitimi yapın. Bir farenin, ışından 60 saniyede iki kez duraklamadan geçtiğinde testi geçtiğini düşünün.
3. Her fare için art arda iki deneme yapın ve önceki farenin kalan kokusunun bir sonraki fareyi etkilemesini önlemek için her denemeden sonra denge kirişine %75 alkol püskürtün.
4. Denge kirişi testini ameliyat öncesi, ameliyattan 3 gün, 1 hafta, 4 hafta, 8 hafta ve 12 hafta sonra yapın. Her farenin denge kirişini arka arkaya iki kez geçme süresini ve sağ arka ayağın kirişten kayma sayısını bağımlı değişkenler olarak kaydedin.

3. Ayak izi analizi

1. Deney masasına 50 cm uzunluğunda, 10 cm genişliğinde ve 10 cm yüksekliğinde U şeklinde bir plastik kanal yerleştirin ve plastik kanalın bir ucunu kapalı bir kasete bağlayın.
2. Kanala düz bir pigment kağıdı yerleştirin ve ardından fareyi iki elinizle tutun ve ön ve arka ayaklarını toksik olmayan kırmızı ve yeşil pigmentle eşit şekilde boyayın.
3. Boyalı fareyi yavaşça kanalın bir ucuna yerleştirin ve kasetin diğer ucuna geçmesine izin verin. Ayak izleri olan pigmentli kağıdı alın, işaretleyin ve havalandırılan ve gölgeli bir yerde kuruması için bir rafa koyun.
4. Her fare geçtikten sonra, önceki farenin kalan kokusunun bir sonraki fareyi etkilemesini önlemek için U şeklindeki plastik kanala %75 alkol püskürtün.
5. Her kağıtta art arda üç net fare ayak izi seçin ve farenin sağ ayağının ayak izinin adım uzunluğunu ve sol ve sağ ayak izleri arasındaki adım genişliğini ölçmek için bir cetvel kullanın.

4. Termal nosisepsiyon değerlendirmesi

1. Deney sırasında, sırasıyla fare ayağının termal nosisepsiyon reaksiyon süresini ve farenin aktivite ve dinlenme sırasındaki reaksiyon süresini kaydetmek için plantar testi kullanın. Ölçüm verilerini saniyeler içinde kaydedin.
2. Fareyi ölçüm cihazına yerleştirin, cihazı sağ ayağıyla hizalayın ve sıcaklık yavaşça artarak cihazı ısıtmaya başlayın. Farenin tepkisini gözlemleyin. Sıcaklık toleransın üzerine çıktığında, fare hızla geri çekilecek veya sağ ayağını yalayacaktır. Cihazı kullanarak zamanı kaydedin ve zamanı aktivite sırasındaki reaksiyon süresi olarak tanımlayın.
3. Dinlenme sırasındaki tepki süresini ölçmek için, farenin dinlenme masasında ısıtmadan 30 dakika oturmasına izin verin ve ardından adım 4.2'de açıklandığı gibi zaman verilerini alın. Elde edilen bu zamansal verileri sonraki analizler için kullanın.

5. Mikro-CT taraması

1. Ameliyat sonrası 12 haftalık farelere karbondioksit ile ötenazi yapın, sağ ayak bileklerinin derisini soyun ve ardından tam ayak bileği örnekleri elde etmek için orta tibia ve fibulalarını cerrahi makasla kesin. Numuneleri 48 saat boyunca %10 nötr formalin içeren işaretli 15 mL santrifüj tüplerine yerleştirin.
2. Fiksasyondan sonra, numuneleri gruplar halinde (parti başına dört numune) mikro-CT taraması için özel bir sünger tankına yerleştirin. Makine parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: voltaj = 50 kV, akım = 200 mA, filtre = 0,5 mmAl ve çözünürlük = 9 μm. Mikro-CT tarayıcıyı çalıştırın.
3. Taramadan sonra, görüntünün aralığını tanımlamak için yeniden yapılandırma yazılımını kullanın ve Liu ve ^ark.10'da açıklandığı gibi, ticari veri analiz yazılımını kullanarak çizilen görüntünün XYZ eksenini ayarladıktan sonra belirli bir açı konumu seçin.
4. XYZ eksenleri tarafından ayarlanan yeniden yapılandırılmış görüntülerde sürekli 10 katmanlı ilgi alanlarını seçmek için mikro-BT analiz yazılımını kullanın ve Liu ve ^ark.10'da açıklandığı gibi kemik hacmi fraksiyonunu (BV / TV) belirlemek için gerekli eklemleri kantitatif olarak analiz edin.
5. Son olarak, Liu ve ^ark.10'da açıklandığı gibi, fare ayak bileği eklemlerinin üç boyutlu BT görüntü işlemesini gerçekleştirmek için üç boyutlu tıbbi görüntü işleme yazılımı kullanın. Rekonstrüksiyondan sonra, ASCJ'deki osteofitlerin aşınmasını ve oluşumunu gözlemleyin.

6. Eklem kıkırdağının kesit boyaması

NOT: Tüm boyama adımları çeker ocakta gerçekleştirilir ve işlem sırasında maske takılır.

1. Ayak bileği örneklerinin etrafındaki fazla yumuşak dokuyu çıkarmak için mikroskobik cımbız ve makas kullanın ve ardından örnekleri 44 g NaOH, iki paket PBS ve 400 g EDTA-2Na ile hazırlanan% 10 EDTA dekalsifikasyon çözeltisi içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin, pH hidroklorik asit ile 7.35-7.45'e ayarlandı ve farklı grupları işaretleyin.
2. Ardından, kireç çözme için santrifüj tüpünü bir sallama masasına (hız 20 rpm'ye ayarlanmış) yerleştirin ve kireç çözme solüsyonunu günde bir kez değiştirin. Numunelerin kireç çözmesini belirleyin.
3. 1 aylık dekalsifikasyondan sonra, numuneleri gradyan alkolle kurutun ve ardından temizleme amacıyla 8 saat boyunca n-butanol kullanın. Son olarak, temizlenmiş numuneleri gömmek için koronal pozisyonda parafine daldırın.
4. Parafin örneklerini daha sonra kullanmak üzere 4 °C'lik bir buzdolabına koyun. Kesitlere ayırmadan önce, numuneleri 4 °C buzdolabından alın ve tüm düzlemin kesilmesini kolaylaştırmak için yaklaşık 10 dakika boyunca −20 °C'lik bir dondurucuya koyun.
5. Numuneleri mikrotom üzerine sabitleyin ve 6 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Aynı zamanda, numunelerin beklenen seviyede kesilip kesilmediğini gözlemlemek için bir mikroskop kullanın - bir şırınga iğnesinin kemik dokusuna kolay nüfuz etmesi.
6. Tablet makinesinin su sıcaklığını önceden 40 °C'ye ayarlayın. Ardından, arka arkaya iki ila üç tam parafin bölümünü kesin ve tam genişleme için bunları tablet makinesine aktarın. Daha sonra parafin bölümlerini cam sürgü ile çıkarın ve suyunu boşaltın. Son olarak, slaytları gruplar ve sayılarla işaretleyin.

7. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

1. Kesitleri 60 °C'lik bir inkübatöre, sağlam ASCJ eklem yapısı mikroskop altında görülebilecek şekilde yerleştirin ve bölümleri 40-50 dakika pişirin. Ardından, kolay tanımlama için I, II ve III olarak numaralandırılmış ksilen 3x ile bölümleri sırasıyla 15 dakika, 15 dakika ve 10 dakika mumdan arındırın.
2. Mumdan arındırılmış bölümleri, kolay tanımlama için I ve II olarak numaralandırılmış %100 etanol 2x, sırasıyla 90 dakika, 3 dakika, 5 dakika ve %80 etanol içine yerleştirin. Ardından, bölümleri 5 dakika boyunca çift damıtılmış suyla (ddH₂O) yıkayın.
3. Hematoksilen ile 1 dakika beklettikten sonra, bölümleri renksiz hale gelene kadar ddH₂O ile yıkayın. Bölümleri %1 asit etanol farklılaştırma solüsyonunda 30 saniye bekletin ve ddH₂O ile 3 kez 1 dakika yıkayın. Bundan sonra, bölümleri 1 dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisi ile boyayın ve ardından her biri 1 dakika boyunca 3x ddH₂O ile yıkayın.
4. Daha sonra, numuneleri 1 dakika boyunca eozin boyama solüsyonu ile boyayın ve ardından art arda 1 dakika boyunca% 95 etanol ve% 100 etanol içine koyun. Son olarak, bölümleri 1 dakika boyunca ksilen IV ile işlemden geçirin.
5. Bölümleri havayla kurutun, slaytlardaki numunelerin üzerine bir damla nötr reçine yapıştırın ve üzerlerini bir kapak fişi ile örtün. Ardından, 5x ve 20x'te parlak alanda dik bir floresan mikroskobu ile görüntü alın.

8. Safranin O-hızlı yeşil boyama

1. Seçilen bölümleri 60 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve bölümleri 40-50 dakika pişirin. Ardından, bölümleri sırasıyla 15 dakika, 15 dakika ve 10 dakika ksilen I, II ve III ile mumdan arındırın.
2. Mumdan arındırılmış bölümleri sırasıyla 3 dakika, 3 dakika, 5 dakika ve 5 dakika boyunca %100 etanol I, II, %90 etanol ve %80 etanol içine yerleştirin. Daha sonra, bölümleri ddH₂O ile 5 dakika yıkayın.
3. Hematoksilen ile 1 dakika beklettikten sonra, bölümleri renksiz hale gelene kadar ddH₂O ile yıkayın. Bölümleri %1 asit etanol farklılaştırma solüsyonunda 30 saniye bekletin ve ddH₂O ile 3 kez 1 dakika yıkayın. Ardından, bölümleri 1 dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisi ile boyayın ve her biri ddH₂O ile 1 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
4. Bölümleri 2 dakika boyunca %0,05 hızlı yeşile batırın, ardından bölümleri %1 asetik asit çözeltisinde 30 saniye ve %0,1 safranin içinde 5 dakika bekletin. Lekeli numuneleri birbiri ardına 1 dakika boyunca %95 etanol ve %100 etanol içine yerleştirin.
5. Son olarak, bölümleri 1 dakika boyunca ksilen IV ile işlemden geçirin. Bölümleri havayla kurutun, slaytlardaki numunelerin üzerine bir damla nötr reçine yapıştırın ve üzerlerini bir kapak fişi ile örtün. Ardından, 5x ve 20x'te parlak alanda dik bir floresan mikroskobu ile görüntü alın.

9. İmmünohistokimya

1. 1. Gün: Seçilen bölümleri 60 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin, bölümleri 40-50 dakika pişirin ve ardından sırasıyla 15 dakika, 15 dakika ve 10 dakika ksilen I, II ve III ile mumdan arındırın. Mumdan arındırılmış bölümleri sırasıyla 3 dakika, 3 dakika, 5 dakika ve 5 dakika boyunca %100 etanol I, II, %90 etanol ve %80 etanol içine yerleştirin. Ardından, bölümleri ddH₂O ile 5 dakika yıkayın, numunenin alanını daire içine almak için histokimyasal bir kalem kullanın ve bunları karanlık bir kutuya yerleştirin.
2. Antijen alımı: Daire içine alınmış numune alanına 20-50 μL% 0.25 tripsin damlatın, 37 ° C'lik bir inkübatörde 60 dakika inkübe edin ve ardından numuneleri her biri 2 dakika boyunca 3x PBS ile yıkayın. % 3_H2O2ekleyerek endojen peroksidazı bloke edin, örnekleri karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ardından her biri PBS ile 2 dakika boyunca 3 kez yıkayın. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 10 keçi serumu ekleyerek serum blokajı gerçekleştirin ve ardından gece boyunca 4 ° C'de birincil antikor (fare anti-fare tip II kolajen, 1.000 kez seyreltilmiş) ile inkübe edin.
3. 2. Gün: Bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika tekrar ısıtın. Birincil antikoru geri kazanın ve bölümleri 3x boyunca her biri 2 dakika boyunca PBS ile yıkayın. İkincil antikor ile 37 ° C'de bir inkübatörde 40 dakika inkübe edin ve ardından bölümleri 3x her biri 2 dakika boyunca PBS ile yıkayın.
4. DAB renk gelişimi: DAB reaktifini hazırlamak için 5 mL ddH2O, iki damla tampon, dört damla DAB ve iki damla_H2O2ekleyin. Bölümlere 20-50 μL reaktif ekleyin, numuneleri 5 dakika boyunca ışıktan koruyun ve ardından bölümleri 2 dakika boyunca ddH₂O ile yıkayın.
5. Hematoksilen ile 1 dakika beklettikten sonra, bölümleri renksiz hale gelene kadar ddH₂O ile yıkayın. Bölümleri %1 asit etanol farklılaştırma solüsyonunda 30 saniye bekletin ve her biri ddH₂O ile 1 dakika boyunca 3x yıkayın Bölümleri 1 dakika boyunca% 1 amonyak çözeltisi ile boyayın ve ardından her birini 3 kez 1 dakika boyunca ddH₂O ile yıkayın.
6. Ardından, bölümleri her biri 1 dakika boyunca sırasıyla %95 etanol ve %100 etanol içine yerleştirin. Son olarak, bölümleri ksilen IV ile 1 dakika inkübe edin. Bölümleri havayla kurutun, slaytlardaki numunelerin üzerine bir damla nötr reçine yapıştırın ve üzerlerini bir kapak fişi ile örtün. Ardından, 5x ve 20x'te parlak alanda dik bir floresan mikroskobu ile görüntü alın.

Korelasyon verilerinin istatistiksel analizi, çevrimiçi istatistiksel analiz araçları kullanılarak yapılmıştır. Normal dağılım ve varyans homojenliği olmak üzere iki testi karşılayan veriler, tek yönlü varyans analizi ile daha ileri istatistiksel analizler için kullanılmıştır. Veriler iki testi karşılamıyorsa, istatistiksel analiz için Kruskal-Wallis testi kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi ve p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Denge kirişi testi
Her farenin her aşamada denge kirişinden iki kez geçmesi için gereken ortalama sürenin istatistiksel analizi, her fare grubunun ameliyattan önce denge kirişini geçmesi için gereken sürede istatistiksel bir fark olmadığını gösterdi (p = 0.73). Ameliyattan üç gün sonra, CL + ATFL ve CL + DL gruplarındaki fareler, sahte gruptaki farelere kıyasla denge kirişinden geçmek için daha uzun bir süreye ihtiyaç duydu ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.05). Ameliyattan dört hafta sonra, CL + ATFL ve CL + DL gruplarındaki farelerin denge kirişini geçmek için harcadıkları sürede, sahte gruptaki farelere kıyasla anlamlı bir fark gözlenmedi (p > 0.05). Ayrıca, ameliyattan 8 hafta ve 12 hafta sonra, CL + ATFL ve CL + DL gruplarındaki fareler, sahte gruptaki farelere kıyasla denge kirişini geçmek için daha fazla zamana ihtiyaç duydu ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.01). CL + ATFL grubundaki farelerin, her test periyodu boyunca CL + DL grubundaki farelere kıyasla denge kirişini geçmek için geçen sürede istatistiksel olarak anlamlı bir fark gözlenmedi (p > 0.05; Şekil 1A).

Farenin sağ arka ayağının denge kirişinden kayma sayısı, ameliyattan önce üç fare grubu arasında istatistiksel olarak farklı değildi (p = 0.68). Ayrıca, CL + ATFL ve CL + DL gruplarındaki fareler için sağ arka ayak bölümlerinin sayısında, ameliyattan 3 gün sonra sahte gruptaki farelere kıyasla anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Diğer postoperatif zaman noktaları ile ilgili olarak, ligament transeksiyon grubundaki kesit sayısı, sahte gruptaki farelere göre daha yüksekti ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.05). Ameliyattan 8 hafta ve 12 hafta sonra, CL + ATFL grubundaki sağ arka ayağın denge kirişinden kayma sayısı, CL + DL grubundaki farelerinkinden daha yüksekti ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.05; Şekil 1B).

Ayak izi analizi
Her gruptaki farelerin adım uzunluğu yaşla birlikte arttı, ancak bağ kopması adım uzunluğunu kısaltabilir. Ameliyattan önce üç grup fare arasında sağ arka ayağın adım uzunluğunda anlamlı bir fark gözlenmedi (p > 0.05). Ameliyattan 12 hafta sonra yapılan yürüme testinde, bağ kesilen grupta sağ arka ayağın adım uzunluğu, aynı dönemdeki sham grubuna göre daha kısaydı ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.01). Bununla birlikte, CL + ATFL grubundaki fareler için sağ arka ayağın adım uzunluğu, CL + DL grubundaki fareler için önemli ölçüde farklı değildi (p > 0.05; Şekil 2A,B).

Termal nosisepsiyon değerlendirmesi
Aktivite sırasında farelerin ayaklarının termal nosisepsiyon tepki süresinin istatistiksel analizi, ameliyattan önce üç fare grubunun reaksiyon sürelerinde istatistiksel bir fark olmadığını gösterdi (p > 0.5). Cerrahi sonrası termal nosisepsiyon değerlendirmesinde, ligament kesim grubundaki farelerin termal nosisepsiyon yanıt süreleri, aynı dönemde sham grubundaki farelere göre daha uzundu ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.01; Şekil 3).

Mikro-CT taraması
Ameliyattan on iki hafta sonra, her gruptaki fareler için sağ arka ayağın ASCJ'sini kantitatif olarak analiz etmek için mikro-BT kullanıldı. BT görüntülerinin üç boyutlu rekonstrüksiyonu, bağları kopmuş iki grupta sağ arka ayağın ASCJ'sinin sham grubundakinden daha pürüzlü olduğunu gösterdi. Eklem yüzeyi içbükey, dışbükey ve, belirgin aşınma izleri vardı, eklemlerin etrafında osteofitler oluştu ve eklemler dejeneratif değişiklikler gösterdi. Ek olarak, CL + DL grubundaki farelerin yaklaşık% 28.6'sında talus çıkığı gelişmiştir (Şekil 4A, B)10. CL + ATFL ve CL + DL gruplarında sağ arka ayağın ASCJ'sinin kemik hacmi fraksiyonu, sham grubuna göre anlamlı olarak daha yüksekti ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.01; Şekil 4C,D)10.

Eklem kıkırdağının kesit boyaması
H&E ve Safranin O-fast yeşil boyama, sahte gruptaki farelerin ASCJ yapısının tamamlandığını, kıkırdak morfolojisinin sağlam olduğunu ve kondrositlerin eşit olarak dağıldığını gösterdi. Bağ kesikleri olan iki grup farenin ASCJ'sinin kıkırdak tabakası belirgin süreksizlik gösterdi ve kondrosit sayısı azaldı (Şekil 5A, B)10. Modifiye Mankin ve Osteoartrit Araştırma Derneği Uluslararası (OARSI) puanlama sistemi, her gruptaki fareler için ASCJ'nin H&E ve Safranin O-fast yeşil boyamasını puanlamak içinkullanıldı 20,21,22. Modifiye Mankin skoru kıkırdak yapısal özellikleri ve kondrositlerin sayısı ve boyanması ile, OARSI skoru ise kıkırdağın histopatolojik derecesi ve evresi ile belirlendi. Ligament amputasyonu olan iki fare grubunun skorları, sham grubundaki farelerinkinden daha yüksekti ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı (p < 0.05; Şekil 5C-F)10.

Tipik tip II kollajen immünohistokimyasal boyama görüntüleri, sham grubundaki sağ arka ayağın ASCJ eklem kıkırdak tabakasındaki tip II kollajen içeriğinin, bağları kopmuş iki fare grubundan daha homojen olduğunu ve tip II kollajende belirgin bir kayıp olmadığını gösterdi (Şekil 6A). Kantitatif analizin sonuçları, sham grubundaki farelerin ASCJ'sinde kollajen tip II ekspresyonunun, bağları kopmuş iki fare grubundan daha yüksek olduğunu ve farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğunu gösterdi (p < 0.05; Şekil 6B,C).

Şekil 1: Denge kirişi testi kullanılarak farelerin davranış analizi . (A) Farelerin denge kirişini geçmesi için gereken süre. (B) Denge kirişini geçerken sağ ayağın kayma sayısı. Veriler, ortalama ± standart sapmayı, grup başına n = 7 örneği temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ayak izi analizi kullanılarak farelerin davranışsal analizi . (A) Ameliyattan önce her gruptaki fareler için sağ ayak adımının uzunluğunun karşılaştırılması. (B) Ameliyattan 12 hafta sonra her gruptaki fareler için sağ ayak adımının uzunluğunun karşılaştırılması. Belirtilen gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar, p < 0.01 olan ** ve p < 0.001 olan *** ile gösterilir. Veriler, ortalama ± standart sapmayı, grup başına n = 7 örneği temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Termal nosisepsiyon değerlendirmesi kullanılarak farelerin davranışsal analizi. Farelerde aktivite sırasında termal nosisepsiyon tepki süreleri. Veriler, ortalama ± standart sapmayı, grup başına n = 7 örneği temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir farenin sağ ayağının mikro-BT analizi. (A) Ayak bileği-subtalar eklem kompleksinde çıkık olmadan fare talusunun üç boyutlu rekonstrüksiyonu (lateral görünüm, medial görünüm, ön görünüm). (B) Ayak bileği-subtalar eklem kompleksinde çıkık fare talusunun üç boyutlu rekonstrüksiyonu (lateral görünüm, medial görünüm, ön görünüm). (C) Fare ayak bileği eklemlerinin kemik hacmi fraksiyonunun (BV / TV) kantitatif analizi. (D) Fare subtalar eklemlerinin kemik hacmi fraksiyonunun (BV / TV) kantitatif analizi. Siyah oklar osteofit oluşumunu veya talus çıkığını gösterir. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar *** ile gösterilir, burada p < belirtilen gruplar arasında 0.001'dir. Bu rakam Liu ve ark.10'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Ayak bileği eklemlerinin H&E ve Safranin O-fast yeşil boyaması ve analizi . (A) Fare ayak bileği-subtalar eklemlerinin H&E boyaması. (B) Fare ayak bileği subtalar eklemlerinin Safranin O-hızlı boyanması. (C) Fare ayak bileği eklemleri için değiştirilmiş Mankin skorları. (D) Fare subtalar eklemleri için modifiye Mankin skorları. (E) Fare ayak bileği eklemleri için Uluslararası Osteoartrit Araştırma Derneği (OARSI) puanları. (F) Fare subtalar eklemleri için OARSI puanları. Semboller: a = ayak bileği eklemi; s = subtalar eklem. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar *** ile gösterilir, burada p < belirtilen gruplar arasında 0.001'dir. Ölçek çubuğu = 100 μm, n = grup başına 7 örnek. Bu rakam Liu ve ark.10'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Ayak bileği eklemlerinin immünohistokimya boyaması ve analizi . (A) Fare ayak bileği ve subtalar eklemlerin Tip II kollajen immünohistokimyasal boyanması. (B) Fare ayak bileği eklemleri için Kollajen II (+) alan oranı yüzdesi. (C) Fare subtalar eklemleri için Kollajen II (+) alan oranı yüzdesi. Semboller: a = ayak bileği eklemi; s = subtalar eklem. İstatistiksel olarak anlamlı farklılıklar *** ile gösterilir, burada p < belirtilen gruplar arasında 0.001'dir. Ölçek çubuğu = 100 μm, n = grup başına 7 örnek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların hiçbirinin çatışan çıkarları yoktur.