Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Karaciğer, büyük doku kaybından sonra bile kendini yenileyebilir. Bu eşsiz rejeneratif kapasite, ilk olarak 1931'de Higgins ve Anderson tarafından sıçanlarda tanımlanan kısmi (% 70) hepatektominin deneysel modeli ile açıkça gösterilmiştir¹. Bu modelde, karaciğerin% 70'i daha büyük karaciğer loblarını keserek hayvanlardan cerrahi olarak çıkarılır. Kalan loblar daha sonra orijinal karaciğer mimarisinin restorasyonu olmadan da olsa, ameliyattan yaklaşık 1 hafta sonra orijinal karaciğer kütlesini geri yüklemek için telafi edici hipertrofi yoluyla büyür ^2,3. Karaciğer kalıntısının iyileşmek için çok küçük olduğu% 86 genişletilmiş hepatektomi gibi, değişen miktarlarda doku çıkarılmasına sahip ek hepatektomiler geliştirilmiştir, sonuçta posthepatektomi karaciğer yetmezliğine (PHLF) ve ardından hayvanların% 30-50'sinde ölüme yol açmıştır ^4,5,6. Bu modeller, rezeke edilen doku miktarına bağlı olarak normal ve başarısız karaciğer rejenerasyonunun incelenmesini sağlar (Şekil 1).

Hepatektomilerin fare modelleri uzun yıllardır başarıyla kullanılmasına rağmen, son zamanlarda tek hücre düzeyinde daha derin bir içgörü sağlayan daha gelişmiş analitik yöntemlere sahiptir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu için, bireysel hepatositlerin varlığı temel bir önkoşuldur. Primer hepatositlerin izolasyonu için çoğu protokol, iki aşamalı bir kollajenaz perfüzyon tekniğine ve ardından canlı hepatositleri enkaz ve parankimal olmayan hücrelerden ayırmak için yoğunluk gradyanı saflaştırılmasına ve ayrıca ölü hücrelere^{dayanmaktadır 7,8,9}. Bu yöntem ilk olarak 1969 yılında Berry and Friend tarafından tanımlanmış¹⁰ ve Seglen ve meslektaşları tarafından 1972 yılında uyarlanmıştır^11,12. Bununla birlikte, gradyan santrifüjleme hücrelerin yoğunluğuna ve boyutuna dayandığından, lipit yüklü hepatositler genellikle standart saflaştırma sırasında kaybolur. Bu tür bir kayıp birçok araştırma sorusu için ihmal edilebilir olsa da, erken karaciğer yenilenmesi için çok önemli bir husustur. İlk 2 gün boyunca, yenilenen fare karaciğeri içindeki hepatositler lipitleri biriktirir, böylece boyut olarak büyür ve yoğunluğa dalar. Bu geçici rejenerasyonla ilişkili steatoz (TRAS) rejeneratif yakıt sağlamaya hizmet eder ve geçicidir, ancak kısmen majör proliferatif faz ile örtüşür ve karaciğer lobülleri içinde eşit olmayan bir şekilde dağılır - karaciğerin fonksiyonel birimleri^13,14. Bununla birlikte,% 86'lık uzatılmış hepatektomiden sonra, TRAS da ortaya çıkar, ancak devam eder, çünkü rejenerasyon durur ve lipitler oksitlenmez¹⁴. Bu nedenle,% 70 veya% 86 hepatektomiyi takiben hepatositlerin gradyan saflaştırılması, çoğu lipit yüklü hepatositin düşük yoğunluklu¹⁵ nedeniyle kaybolması nedeniyle temsili olmayan fraksiyonlar verecektir.

Bu modifiye izolasyon protokolünde, C57BL/6 farelerden alınan hepatositler, klasik iki aşamalı kollajenaz perfüzyon yaklaşımı ile hepatektomiden 24-48 saat sonra izole edilir. Genellikle, hücre izolasyonu için kalıntının kanülasyonu ve perfüzyonu portal ven yoluyla yapılır. Ancak majör rezeksiyon sonrası kalan küçük rezentlerde portovasküler direnç¹⁶ yüksekliğindedir ve bu nedenle perfüzyon hassastır. Vena kava hepatektomilerden etkilenmediği için, perfüzyon vena kavanın kanülasyonu yoluyla retrograd yönde kolayca yapılabilir. Standart bir peristaltik pompa, portal venden çıkışla retrograd perfüzyon kullanarak, kateterize inferior vena kava yoluyla ısıtılmış çözeltileri karaciğer kalıntısına yönlendirir (Ek Şekil S1). Hepatositler kollajenazlar tarafından ayrışır ve Glisson kapsülünden salınır. Düşük hızlı bir santrifüjleme yaklaşımı kullanılarak kademeli izolasyon ile canlı hepatositlerin yıkanması ve dikkatli bir şekilde işlenmesinden sonra, hepatositler herhangi bir aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Tüm hayvan deneyleri İsviçre Federal Hayvan Yönetmeliklerine uygundur ve Zürih Veterinerlik Ofisi (n° 007/2017, 156/2019) tarafından onaylanmıştır. 10-12 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri, yiyecek ve suya serbest erişimi olan 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsünde tutuldu. Her deney grubu altı ila sekiz hayvandan oluşuyordu. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Farelerde parsiyel hepatektomi

1. Standart hepatektomi için (p), sol lateral lobu, medyan lobun sağ kısmını ve median lobun sol kısmını ligate ve rezeke edin (Şekil 1B

1. 
   
6. 
   
7. 
   
8. 
   <

RAS, hepatektomi sonrası 16 saatte zirve yapar ve standart hepatektomiden 32-48 saat sonra yavaş yavaş kaybolur, ancak genişletilmiş hepatektomiden sonra 48 saatin üzerinde devam eder. Makroskopik olarak, TRAS karaciğer kalıntısının soluk bir teni olarak kolayca görülebilir (Şekil 1F) ve ameliyattan sonra 16 saat ile 48 saat arasında hepatetomize farelerde görülebilir.

Tahmini nihai verim, farelerde p hepatektomi sonrası 10-15 × 10 6 hepatosit ve %86 uzatılmış hepatektomi sonrası 4-9 × 106'dır ve ortalama nihai canlılık sırasıyla x ve e'tir. Bu, bütün bir fare karaciğerinden 50-70 × 106 toplam verime kıyasla beklenen yüzdeye karşılık gelir (Şekil 6A, C). Parsiyel hepatektomilerden sonra, hepatositler normal karaciğerlere kıyasla artmış bir hücre boyutu gösterir ve bu da artmış lipit içeriğine karşılık gelir (Şekil 6B). Geçit stratejisi Ek Şekil S4'te gösterilmiştir.

Şekil 6: Hepatosit verimi, hücre büyüklüğü ve canlılığı . (A) Bir bütün fare karaciğerinin ve kalıntıların hücre sayısı% 70 ve% 86 hepatektomi sonrası 24 saat. (B) İzole hepatositlerin hesaplanmış hücre hacmi. Hepatektomi sonrası 24 saat hücre boyutundaki belirgin artışa dikkat edin, hem % 70 hem de% 86 için. (C) Saflaştırma işleminin her adımından sonra izole hepatositlerin hücre canlılığı. Canlılık, Alexa Fluor 488 Zombi yeşil canlılık boyası kullanılarak akış sitometrisi ile ölçüldü. Yüzdeler tüm hepatosit singletlarından alınır. Geçit stratejisi için Ek Şekil S6 ve Ek Şekil S4'e bakınız. Hata çubukları, n = 6-8/grup ile standart sapmaları ifade eder. Kısaltmalar: sHx = standart hepatektomi; eHx = genişletilmiş hepatektomi; rezeksiyon olmadan = sahte cerrahi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Parsiyel hepatektomiden 24 saat sonra murin hepatositlerde artmış lipid içeriği, granülerlikte bir artış (Şekil 7; geçit stratejisi için bakınız Ek Şekil S5) veya genişlemiş hepatositlerin içinde lipid veziküllerinin varlığı ile doğrudan gözlenebilir (Şekil 8 ve Ek Dosya 1).

Şekil 7: Akım sitometrisi ile ölçülen artmış granülerlik ve hücre boyutu . (A) Lipid veziküllerinin varlığı için dolaylı bir belirteç olarak hepatektomi sonrası 24 saat izole hepatositler arasında artmış granülerlik. (B) SSC'yi gösteren histogram. (C) Yüzdeler, SSC sinyali ile ölçülen yüksek sitoplazmik granüler yoğunluğa sahip hücrelerin fraksiyonunu temsil eder. Hata çubukları, n = 6-8/grup ile standart sapmaları ifade eder. Kısaltmalar: sHx = standart hepatektomi; eHx = genişletilmiş hepatektomi; rezeksiyon olmadan = sahte cerrahi; FSC = ileri saçılma sinyali; SSC = yan dağılım. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: İzole edilmiş taze hepatositlerin yağ içeriğinin bir belirteci olarak Sudan IV boyaması. (A) Önceden ameliyat edilmeden taze bir bütün fare karaciğerinden hepatositler. Hepatektomi sonrası 24 saat (B) ve (C

Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.