E. coli'de Doğal Konjugatif Plazmidlerin Aracılık Ettiği Yatay Gen Transferinin Saptanması

1946'da Lederberg ve Tatum¹, Escherichia coli K-12'de şimdi konjugasyon olarak bilinen cinsel bir süreci tanımladı. Bakteriyel konjugasyon, bir bakteri hücresinin (donör) tek yönlü genetik materyali doğrudan hücreden hücreye temas yoluyla başka bir hücreye (alıcıya) aktardığı süreçtir. Konjugasyon, bakteri 2,3'te geniş bir şekilde dağılmıştır^, ancak konjugasyon makinesini eksprese eden donör hücrelerin fraksiyonu tipik olarak çok küçüktür⁴.

Plazmidler otonom olarak çoğalan ekstrakromozomal DNA elementleridir. Plazmid replikasyonu ve bakımında yer alan genlere ek olarak, plazmidler sıklıkla ağır metaller veya antibiyotiklere maruz kalma gibi çevresel zorluklara adaptasyonda rol oynayan bir gen yükü taşırlar⁵. Konjugatif plazmidler, alıcı hücrelere transferlerine izin veren ve transfer^6'yı takiben kalıcılıklarını destekleyen bir dizi özel gen içeren bir plazmid sınıfıdır. Konjugatif plazmidlerin büyüklüğü 21.8 kb ila 1.35 Mb arasında değişir ve filum Pseudomonadota'daki bakterilerde (Proteobacteria ile eşanlamlıdır), medyan yaklaşık 100 kb ^5,7'dir. Ayrıca, muhtemelen konakçı üzerindeki metabolik yükü düşük tutmak için genellikle düşük bir kopya sayısına sahiptirler ^8,9.

Tipik konjugatif aparat dört bileşenden oluşur: bir transfer kökeni (oriT), bir relaksaz, bir tip IV kuplaj proteini ve bir tip IV sekresyon sistemi (bağışçıların alıcılarla iletişim kurmasını sağlayan pilus adı verilen tüp benzeri bir yapı)⁶. Konjugatif plazmidler taşıyan hücrelerin sadece çok küçük bir kısmı konjugasyon^makinesini 4 ifade eder, ancak plazmidler bir uygunluk avantajı sağlarsa, transkonjuganlar popülasyonda hızla genişleyebilir. Farklı habitatlardan toplanan E. coli izolatlarının% 35 ila% 80'inden fazlası, en az bir antibiyotiğe direnç kazandıran genlere sahip konjugatif plazmidlere sahiptir^10,11; bu nedenle, konjugatif plazmidlerin aracılık ettiği yatay gen transferi, antibiyotik direnci genlerinin küresel yayılımını yönlendiren önemli bir mekanizmadır¹².

Laboratuvar kültüründe yapılan çiftleşme deneyleri, konjugasyon sıklığının, alıcı hücrelerin doğası, büyüme evresi, hücre yoğunluğu, donör-alıcı oranı, konjugasyonun sıvı veya katı ortamda yapılıp yapılmadığı, karbon, oksijen, safra tuzları, metal konsantrasyonları, memeli hücrelerinin varlığı, sıcaklık, pH ve çiftleşme süresi^13,14 gibi birçok faktörden etkilendiğini göstermiştir^{. 15}.

Bu çalışma, belirli bir konakçı suşunda konjugatif plazmidlerin varlığını tespit etmek, katı kültürdeki konjugasyon oranlarını ölçmek ve alıcı hücrelere transferlerini iki kez kontrol etmek için protokolleri açıklamaktadır. Bu protokoller, araştırmaya uygun doğal konjugatif plazmidlerin tanımlanması için ilk adım olarak kullanılabilir. Minimum sayıda basitleştirilmiş adım kullanırlar, çünkü birden fazla kaynaktan (çevresel, kommensal ve patojenik) elde edilen bakterilerde konjugatif plazmidlerin varlığını taramak için tasarlanmıştır (düzinelerce ila yüzlerce donör).

Ek olarak, belirli bir konjugatif plazmidin mobilizasyonunun tespit için kullanılan antibiyotikten bağımsız olup olmadığını (yani, seçim altındaki antibiyotik direnç geninin alaka düzeyi) tespit etmek ve farklı çevresel izolatlarda bulunan iki konjugatif plazmidin konjugasyon oranlarını karşılaştırmak için yapılan testler gösterilmiştir.

İlgili konjugatif plazmidlerin (plazmid replikonu ve antibiyotik direnci gen yapısı) genetik bileşimine dayanarak, protokolün her adımı, konjugasyon oranını etkilemesi muhtemel çeşitli faktörlerin etkisini incelemek için değiştirilebilir.

Genel deneysel tasarım:
Bir çiftleşme deneyi kurmak için gereken temel bileşenler, donör hücreleri, bir alıcı suşu ve donörleri (antibiyotik A), alıcıları (antibiyotik B) ve transkonjuganları (antibiyotik A ve B) seçmek için katı ortamlardır. Transkonjuganlar, donörün konjugatif plazmidini istikrarlı bir şekilde koruyan alıcı hücrelerdir.

Donör hücreler bir antibiyotiğe (antibiyotik A) dirençlidir ve alıcı hücreleri (antibiyotik B) seçmek için kullanılan belirteç veya belirteçlere duyarlıdır. Antibiyotik direnci geninin genomik lokalizasyonu (yani, kromozomda mı yoksa donör hücrenin plazmidinde mi bulunduğu) a priori olarak bilinmek zorunda değildir, çünkü antibiyotik direnç belirteçlerinin alıcıya mobilizasyonu (doğrudan bir donör-alıcı temasından sonra), donör tarafından sağlanan belirteçlerin bir plazmidde olduğu anlamına gelir.

Bir alıcı suşu (konjugatif plazmidler aldığı bilinmektedir) donörde bulunmayan stabil bir seçilebilir belirtece sahip olmalıdır; Bu seçilebilir belirteç genellikle kromozomda bulunan bir antibiyotik veya biyosite karşı dirençlidir. Çiftleşme deneylerinde kullanılacak alıcının seçimi kritiktir, çünkü bazı E. coli suşları konjugatif plazmidleri alma yeteneklerinde farklılık gösterir¹⁶.

Bu bileşenler kurulduktan sonra, bir donör-alıcı çifti temasından sonra her iki antibiyotik (A ve B) ile medyada büyüyen herhangi bir koloni, varsayılan bir transkonjuganttır (Şekil 1). Bu, donörlerin antibiyotik A ile medyada büyüyebileceğini, ancak antibiyotik B ile medyada büyüyemediğini ve alıcıların antibiyotik B ile medyada büyüyebildiklerini, ancak antibiyotik A ile büyüyemediklerini varsaymaktadır. transkonjugasyon iki tanı testi kullanılarak doğrulanabilir. İlk test, transkonjugant kolonilerde konjugatif plazmidde bulunan genlerin tespitinden (genlerin polimeraz zincir reaksiyonu [PCR] amplifikasyonu veya diğer yöntemlerle) oluşur. İkinci test, laktoz metabolizmasına dayalı diferansiyel koloni renk belirteçlerinin kullanımını içerir. Diferansiyel koloni rengi, MacConkey agar'ın kullanılmasıyla ortaya çıkar; agar içindeki laktoz, laktoz fermente edici (lak⁺) mikroorganizmalar tarafından fermantasyon kaynağı olarak kullanılabilir. Bu mikroorganizmalar, pH'ı düşüren organik asitler, özellikle laktik asit üretir. Nötr kırmızı, ortama dahil edilen ve pH 6,8^17'nin altına düştüğünde kirli beyazdan parlak kırmızı/pembeye dönüşen bir pH göstergesidir. Böylece, E. coli laktoz-pozitif suşlar MacConkey agar üzerinde daha büyük pembe koloniler üretirken, laktoz-negatif suşlar MacConkey agar üzerinde soluk sarı ve daha küçük koloniler üretir.

Şekil 1: Donör suşlarda konjugatif plazmidlerin varlığını saptamak için kullanılan deneysel tasarım. Bu örnekte, donör, antibiyotik A'ya direnç kazandıran bir antibiyotik direnç geni ile konjugatif bir plazmid taşır, ancak antibiyotik B'ye duyarlıdırlar. tersine, alıcının antibiyotik B'den koruma sağlayan bir kromozomal direnç belirleyicisi vardır, ancak antibiyotiğe duyarlıdır A. Transkonjuganlar her iki antibiyotiğe de dirençlidir (A ve B), çünkü donörün A antibiyotiğine direnç kazandıran konjugatif plazmidine ve alıcının B antibiyotiğinden koruma sağlayan kromozomuna sahiptirler.

Bir donör-alıcı çifti için konjugasyon oranı (belirli deneysel koşullar altında), transkonjugat sayısının donör sayısına veya alıcı sayısına bölünmesiyle hesaplanabilir; ilk oran, konjugasyon makinesinin donör tarafından fonksiyonel ekspresyonunu sergileyen donör hücrelerin fraksiyonunu^{gösterir 16,18}, ikinci oran ise alıcının konjugatif plazmidleri alma yeteneğini gösterir ^19,20. Bu çalışmada, aksi belirtilmedikçe, konjugasyon oranı, transkonjugant haline gelen alıcı hücrelerin fraksiyonunu temsil etmektedir (yani, alıcı başına oran).

Burada, bir E. coli alıcısı ve iki E. coli donörünü içeren iki bağımsız çiftleşme deneyi bildirilmiştir. Ek olarak, konjugatif plazmidde bulunan antibiyotik direnç genlerinden herhangi biriyle tek bir çoklu ilaca dirençli plazmidin seçilebileceğini doğrulamak için donörlerden biri için transkonjuganları seçmek için farklı antibiyotikler kullanılmıştır.

Bu çalışmada kullanılan donör ve alıcı suşları, bu deneysel sistemin tüm bileşenlerini anlamak için tamamen sıralanmıştır; Bununla birlikte, bu protokoller bilinmeyen sekanstaki konakçılarda konjugatif plazmidlerin varlığını taramak için tasarlanmıştır ve bu deneysel bağlamda da kullanılabilir; ancak bu durumda önce ilgili genler dizilenir.

Protokolde kullanılan donör ve alıcı suşları şunlardır:

Donör 1. E. coli SW4955, Baton Rouge'daki (LA, ABD) bir gölde toplandı. IncFIC(FII) ve IncFIB (AP001918) replikonları ile 134.797 bp konjugatif plazmidine (p134797) sahiptir. Bu konjugatif plazmid, üçüncü nesil sefalosporinlere (bla_CTX-M-55), aminoglikozitlere (aac (3)-IIa ve aadA1), fenikollere (catA2), tetrasiklinlere (tet (A)), trimetoprim (dfrA14) ve sülfonamidlere (sülfonamidler) direnç kazandıran genlere sahiptir. p134797'nin tam haritası için lütfen Şekil 2A'ya bakın. E. coli SW4955, laktoz pozitiftir ve MacConkey agarında pembe koloniler üretir.

Donör 2. E. coli SW7037, Erie Gölü'nde (Ottawa County, OH, ABD) toplandı. Bir IncI1-I (Alfa) replikon ile 101.718 bp konjugatif plazmid (p101718) taşır. Bu konjugatif plazmid, beta-laktamlara direnç kazandıran bir gene sahiptir (bla_CMY-2). P101718'in tam haritası için lütfen Şekil 2B'ye bakın. E. coli SW7037 ayrıca laktoz pozitiftir ve MacConkey agarında pembe koloniler üretir.

Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan konjugatif plazmidlerin genetik haritası. (A) Plazmid p134797, E. coli suşu SW4955'te bulunan konjugatif plazmid. (B) Plazmid p101718, E. coli suşu SW7037'de bulunan konjugatif plazmid. Antibiyotik direnci genleri mavi renkte, konjugatif aparata ait genler ise kırmızı renkle vurgulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Alıcı. E. coli LMB100 alıcı olarak kullanılır. Bu, rifampine (100 mg / L) ve streptomisin'e (100 mg / L) dirençli plazmidsiz bir suştur. İki antibiyotiğe direnç göstermek, donörde ortaya çıkan ve sonuçların yorumlanmasına müdahale edecek direnç mutasyonları olasılığını azaltır. Ek olarak, E. coli LMB100 laktoz negatiftir ve MacConkey agarında soluk sarı ve küçük koloniler (daha büyük, pembe kolonilerin aksine) ürettiği için iki donör suşundan ayırt edilebilir.

Donör laktoz negatif olduğunda, laktoz pozitif bir alıcı kullanmanızı öneririz (örneğin, E. coli J53). LMB100 ve J53 suşları diğer laboratuvarlarda da kullanılabilir. Lütfen Dr. Gerardo Cortés-Cortés'e adres ve FedEx numarası ile birlikte bir talep gönderin.

Bağışçıları, alıcıları ve transkonjuganları seçmek ve saymak için gereken katı ortam, 100 mm çapındaki Petri kaplarındaki MacConkey agar'dır. Aşağıdaki antibiyotiklerin eklenmesi gerekir: (i) Medya A: donörleri saymak ve alıcıların bu antibiyotikle büyüyememesini sağlamak için karbenisilin (100 mg / L). (ii) Medya B: Alıcıları saymak ve donörlerin bu iki antibiyotikte büyüyememesini sağlamak için rifampin (100 mg / L) + streptomisin (100 mg / L). (iii) Medya AB: transkonjuganları elde etmek ve saymak için karbenisilin (100 mg / L) + rifampin (100 mg / L) + streptomisin (100 mg / L). (iv) Medya C: İncelenen tüm izolatları çizecek antibiyotik yok.

E. coli SW4955 ve E. coli SW7037'den E. coli LMB100'e konjugatif plazmidlerin konjugasyon oranları karşılaştırılmıştır. Ek olarak, p134797 konjugatif plazmid (SW4955 suşu) durumunda, antibiyotik karbenisilin (100 mg / L), gentamisin (2 mg / L), kloramfenikol (25 mg / L), tetrasiklin (10 mg / L), trimetoprim (20 mg / L) veya sülfametoksazol (100 mg / L) ile değiştirilir.

1. Yöntem 1: Konjugasyon

1. 1. Gün: Bağışçıları ve alıcıyı çizgilendirin. C medyasındaki gliserol stoklarından ayrı olarak (antibiyotiksiz MacConkey agar) seriler ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Bu adım, deneyin saf izolatlarla yapılmasını sağlamak ve laktoz fenotipini kolonilerin rengine göre doğrulamak için gereklidir.
2. 2. Gün: Her donör ve alıcı için 14.0 mL'lik bir kültür tüpü etiketleyin. Her donör ve alıcının tek bir kolonisini seçin ve bunları 37 ° C'de 2 mL Mueller Hinton suyu içeren ve 200 rpm'de sallanan ayrı 14.0 mL kültür tüplerinde gece boyunca (18 saat) büyütün.
   NOT: Kullanılan suşlarda, durağan faza 18 saatlik gece kültüründen sonra ulaşılır.
3. 3. Gün: 900 μL tuzlu su çözeltisinin 1:10 seyreltilmesi ve gece kültürünün 100 μL'sini kullanarak her bir donörün ve alıcının gecelik kültürünün 600 nm'sinde (OD600) optik yoğunluğunu (vorteks yok) ölçün.
4. Her bir donörün ve alıcının optik yoğunluğunu, sterilize edilmiş tuzlu su çözeltisi (suda% 0.85 NaCl) ile 2.0'a (OD₆₀₀ = 2.0) ayarlayın.
   NOT: OD_{600 = 2.0} ile bir gecelik E. coli kültürü 1.6 x 10⁹ CFU / mL'ye sahiptir.
5. Donör ve alıcı suşlarını gösteren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü "çiftleşme tüpü" olarak etiketleyin. Her donörün ve alıcının ayarlanmış (OD 600 = 2.0) süspansiyonunun₅₀₀ μL'sini aktarın ve bunları çiftleşme tüpüne yerleştirin (bu çiftleşme tüpünde her donör ve alıcının 0.8 x 10⁹ CFU / mL'si olacaktır). Çiftleşme tüpünü ters çevirerek yavaşça karıştırın.
6. Çiftleşme tüpünü oda sıcaklığında 500 x g'da 10 dakika santrifüj yapın.
7. Pelet rahatsız etmeden, konjugasyon tüpünün 800 μL'sini pipetleyin. Konjugasyon tüpünde 200 μL kalmalıdır.
   NOT: Süspansiyondaki bakterileri etkisiz hale getirmek için süpernatantı %10'luk bir ağartıcı kabına atın.
8. Çiftleşme tüpünü bir inkübatörde 37 ° C'de 18 saat (geceleme) boyunca inkübe edin. Çiftleşme, kuluçka süresi boyunca gerçekleşir.
   NOT: Konjugatif pili kırmamak için bu adım titremeden yapılmalıdır.
9. Negatif bir kontrol olarak, B medyasındaki bağışçıların ve A medyasındaki alıcıların gece kültürünü çizin. plakaları bir gecede 37 ° C'de inkübe edin
10. 4. Gün: Çiftleşme tüpüne ve vortekse 800 μL tuzlu su çözeltisi ekleyerek yeniden askıya alın (bu, çiftleşme karışımını 1 mL'ye yeniden oluşturur).
    NOT: Vorteks, çiftleşen bakterileri parçalara ayırır ve CFU / mL'yi ölçmek için kültürü homojenleştirir.
11. Çiftleşme karışımının 1:10 seyreltisini (1 x^{10 0} ila 1 x ^10-7 arası) hazırlayın. Plaka 100 μL seyreltmeler 10-5 ila ^10-7 A ve ortam B üzerinde ve tüm seyreltmeler AB medyasında.
    NOT: Dlution 10⁰, düzgün tüpü ifade eder.
12. Plakaları inkübatöre baş aşağı yerleştirmeden önce kurumasını bekleyin. Plakaları 37 ° C'de 18 saat (geceleme) boyunca inkübe edin.
13. 5. Gün: Bağışçıların saf gece kültürlerinin çizgilerinin B medyasında büyümediğinden ve alıcıların saf gece kültürünün A medyasında büyümediğinden emin olmak için negatif kontrolleri inceleyin.
14. Sayılabilecek koloni ve seyreltme sayısını kaydedin:
    1. A medyasındaki kolonileri sayın; bunlar bağışçılar. Koloniler pembe olmalıdır (Şekil 3A,B).
    2. B medyasındaki kolonileri sayın; bunlar alıcılar ve transkonjuganlardır. Koloniler soluk sarı renkte olmalıdır (Şekil 3C).
    3. AB medyasındaki kolonileri sayın; bunlar transkonjuganlardır. Koloniler soluk sarı olmalıdır.
       NOT: Sayılabilir bir plaka seçin. Sayılabilir bir plakanın 30 ila 300 kolonisi vardır (300'den fazla koloninin sayılması zor olacaktır ve 30'dan az koloni, orijinal numunenin doğru bir temsilini sunmak için çok küçük bir örneklem büyüklüğü olarak kabul edilir).
15. Donör başına veya alıcı başına konjugasyon sıklığını hesaplayın
    Donör başına konjugasyon sıklığı = (Transkonjugant CFU/mL [media AB])/ (Donörlerin CFU/mL'si [media A]) x 100
    Alıcı başına konjugasyon sıklığı = (Transkonjugant [media AB]'nin CFU/mL'si)/ (Alıcıların ve transkonjuganların CFU/mL'si [media B]) x 100
    NOT: Bu protokol için konjugasyon frekansı, transkonjuganların alıcı sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması şeklinde hesaplanmıştır. Literatüre göre, ortaya çıkan konjugasyon miktarı, ekskonjugant frekansı, gen transfer frekansı, konjugasyon frekansı, rekombinant verimi, plazmid transfer etkinliği, toplam bakteri sayısına dayalı konjugasyon frekansı, transkonjuganların oranı, alıcı popülasyondaki transkonjuganların fraksiyonu, transkonjugant frekansı, konjugasyon frekansı, konjugasyon hızının logaritması, transfer hızı sabiti, çiftleşme çifti başına konjugasyon hızı, konjugasyon katsayısı veya konjugasyon etkinliği²⁰. Bu protokol, konjugasyon verimliliği terimini ifade eder.
16. Transkonjuganları gliserol stoklarında -80 ° C'de saklayın. Gliserol stoklarını hazırlamak için alt adımları izleyin.
    1. Tek bir transkonjugant kolonisi seçin ve bunları 37 ° C'de karbenikilin (100 mg / L) ile desteklenmiş 2 mL Mueller Hinton suyu içeren 5.0 mL kültür tüplerinde gece boyunca (18 saat) büyütün ve 200 rpm'de sallayın.
    2. Transkonjugan'ın adını gösteren kriyojenik şişeleri aşağıdaki gibi etiketleyin: Tc + donörün adı + A medyasında seçilim antibiyotiği (transkonjuganlar oldukları için, arka planlarının streptomisin ve rifampine zaten dirençli olan ancak ayrıca bir beta-laktam direnç geni taşıyan plazmidi barındıran alıcı suşu olduğu bilinmektedir); örneğin, TcU1Carb. Aynı donörden birden fazla transkonjugantın depolanması gerektiğinde sürekli sayılar ekleyin (örneğin, TcU1Carb1, TcU1Carb2, vb.).
    3. Gece kültürünün 1 mL'sini 1 mL% 50 gliserol (v / v; nihai gliserol konsantrasyonu% 25 olmalıdır) aktarın ve inversiyon ile hafifçe karıştırın. Kriyojenik şişeleri 15 dakika boyunca kuru buz üzerine koyun ve gelecekteki deneyler için kriyovalleri -80 ° C'de saklayın.
17. DNA ekstraksiyonu için, karbenikilin (100 mg / L) ile desteklenmiş Mueller Hinton agar üzerindeki gliserol stoklarından trasnkonjuganları çizin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin; ardından adım 2.1'deki önerileri izleyin.

2. Yöntem 2: E. coli transkonjuganlarında antibiyotik direnç genlerini ve plazmid replikonlarını arttırmak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

NOT: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 1983 yılında Dr. Kary Mullis tarafından geliştirilmiştir. PCR, denatüre edilmiş, çift sarmallı bir DNA şablonunun zıt iplikçiklerine tavlanan ve termostabil bir DNA polimeraz yoluyla uzatılan spesifik primerlere (replikasyonun ilerleyebileceği bir nokta olarak işlev gören belirli bir DNA dizisini tamamlayan kısa bir DNA parçası, genellikle 20-40 nükleotid uzunluğunda ve ideal olarak% 40-60'lık bir guanin-sitozin içeriğine sahip) bağlıdır. böylece bir sonraki reaksiyon döngüsü için ek bir şablon oluşturarak orijinal şablon^21'in üstel amplifikasyonuna yol açar. Bu protokolde, konjugatif plazmidlerde bulunan replikonlar ve direnç genleri, transkonjugant alıcı hücrelerdeki transferi doğrulamak için güçlendirildi.

1. DNA ekstraksiyonu
   1. Konjugatif plazmidler tarafından taşınan direnç genlerinin transferini tespit etmek için, transkonjugant DNA'yı şablon olarak kullanın. Bakteriyel hücre duvarlarını lize etmek için basit kaynatma hazırlığı ekstraksiyonu kullanın.
      NOT: Basit kaynatma hazırlığı ekstraksiyonu, bakteri hücre duvarlarını lize etmek için basit bir yaklaşımdır. Bu ekstraksiyon, genomik DNA ile karıştırılmış plazmid DNA'sı içerir, ancak primerler ilgilenilen spesifik DNA dizilerine göre tasarlandığından, bu şablon PCR için de yararlıdır. Plazmidler ayrıca özel olarak saflaştırılabilir, ancak verimler artan plazmid boyutu²² ile düşme eğilimindedir. Bu uygun bir durma noktasıdır. DNA -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.
2. PCR (Bilgisayar)
   1. Deneyin negatif ve pozitif bir kontrole sahip olduğu göz önüne alındığında, 1.5 mL'lik bir tüpteki tüm reaksiyonlar için bir havuz oluşturmak faydalıdır. 1.5 mL'lik bir tüpü "havuz" olarak ve gerekli PCR tüplerini gen ve numunenin adıyla (örneğin, OXA-U1) etiketleyin.
   2. PCR reaktiflerini aşağıdaki sırayla 1,5 mL'lik bir tüpe pipetleyin: steril su, 2x Master Mix, primerler ve polimeraz (şablon DNA hariç) (bkz. Tablo 1). En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek yavaşça karıştırın. Tüm zaman boyunca buzda tutun.
      NOT: Reaksiyon karışımını veya reaktifleri kirletmekten kaçınmak için eldiven giyin. Reaktif kontaminasyonunu önlemek için reaktiflerin açılıp karıştırılmasından ve numunelerin aynı alanda işlenmesinden kaçının. Nükleaz aktivitesini ve spesifik olmayan astarlamayı bastırmak için reaktifleri buz kovasına yerleştirin. Bir reaksiyon oluşturmadan önce tamamen çözülmelerine izin verin. Reaktifleri deney boyunca buz üzerinde tutun. Taq Polimeraz sonunda eklenir çünkü pH değişikliklerine duyarlıdır; bozulmayı veya yanlış katlanmayı önlemek için tamponlanması gerekir. Primerlerin dizisi Tablo 2-antibiyotik direnç genleri-ve Tablo 3-replikonlar 23,24,25,26,27,28'de listelenmiştir.
   3. Şablon DNA'yı karşılık gelen tüpe ekleyin. PCR tüplerine kabarcıklar ve güvenli kapaklar sokmaktan kaçının.
   4. PCR tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin.
   5. Programı başlatın. Tablo 2 (direnç genleri) ve Tablo 3'te (replikonlar) her gen için listelenen program ayarlarına bakın.
      NOT: PCR programlarını, çalıştırmadan sonra örnekleri 4 °C'de tutacak şekilde ayarlayın.
      1. Replikonlar için PCR koşulları: 5 dakika boyunca 94 ° C'de bir denatürasyon döngüsü, ardından 1 dakika boyunca 94 ° C'de 30 döngü denatürasyon, 30 s için 60 ° C'de tavlama, 1 dakika boyunca 72 ° C'de uzama ve 5 dakika boyunca 72 ° C'de bir döngünün son uzatılması.
         NOT: Bunlar Carattoli ve ^ark.29 tarafından standartlaştırılmış koşullardır.
   6. Program bittiğinde, PCR tüplerini 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu uygun bir durma noktasıdır. PCR ürünleri -20 °C'de birkaç ay saklanabilir
   7. 250 mL'lik bir şişede 0.6 g agaroz tartarak ve 60 mL 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponu ekleyerek% 1'lik bir agaroz jeli hazırlayın (farklı bir jel boyutuna ihtiyaç duyulursa reaktifleri ayarlayın). Agarozun şişenin üzerine dökülmesini önlemek için agarozu dikkatlice ve yavaşça bir mikrodalgada eritin ve yaklaşık 55 ° C'ye (10-15 dakika) soğumaya bırakın.
      1. Tüm reaktifleri ultra saf deiyonize su ve analitik sınıf reaktifler kullanarak hazırlayın:
      2. TAE 50x Tampon (Tris baz, asetik asit ve EDTA) (1 L): 121.1 g Tris baz + 372.24 g EDTA karıştırın ve 500 mL damıtılmış su ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı ile çözün. 57.1 mL asetik asit ekleyin ve toplam 1.000 mL hacme damıtılmış su ekleyin.
      3. 15 psi, 121 °C'de 15 dakika otoklav yapın ve 6 aya kadar hazır olana kadar oda sıcaklığında tutun.
      4. TAE 1x Tampon (1 L): 20 mL TAE 50x tamponu 980 mL damıtılmış su ile birleştirin ve karıştırın.
   8. Bir duman başlığının altında, erimiş agaroza 6 μL SYBR Green ekleyin, karıştırın ve dökülmeyi önlemek için daha önce yapışkan bantla kapatılmış tepsiye (ve tarak) dökün. Jeli bulanıklık görünene kadar 15-25 dakika bekletin.
      NOT: Diğer alternatif boyalar da^{mevcuttur 30,31,32,33}.
   9. Yapışkan bandı çıkarın ve jeli elektroforez odasına yerleştirin, jeli örtmek için yeterli 1x TAE tamponu ekleyin.
   10. 5 μL 6x DNA jel yükleme boyasını her reaksiyonun 25 μL'si ile karıştırın. En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek yavaşça karıştırın.
       NOT: Beklenen ürünü görselleştirmek için tüm PCR ürünlerinin jele yüklenmesi gerekmez (boya miktarını karşılık geldiği şekilde ayarlayın). Kalan PCR örneği birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir ve saklanabilir.
   11. Karışımı kuyucuklara yerleştirin (kabarcıklar sokmaktan kaçının) ve oda kapağını aşağı indirin.
       NOT: İlk numuneyi negatif kontrolden başlayarak ikinci kuyucuğa yükleyin (birincisini merdivene ayırın).
   12. İlk kuyuya 4 μL 1 kb DNA merdiveni yükleyin.
   13. Elektroforezi 120 V, 400 mA ve 60 dakikada çalıştırın.
   14. Jeli UV ışığı altında görselleştirin (UV aydınlatıcısı ile) ve görüntüyü kaydedin.
       NOT: Bir PCR ürünü varsa, lekelenmiş DNA bantları standart bir UV transilluminator, görünür ışık transilluminator veya lazer tabanlı bir tarayıcı kullanılarak tespit edilebilir.

Tablo 1: PCR reaktifleri ve üç reaksiyon için havuz (bir örnek). 

Tablo 2: Tanısal direnç genlerini yükseltmek için kullanılan primerler ve PCR programları. 

Tablo 3: Plazmidler p134797 ve p101718'in PCR tabanlı replikon tiplemesi ile sınıflandırılmasında kullanılan primer ve PCR programı²⁹. 

SW4955 ve SW7037 donörlerinin dizilendiği göz önüne alındığında, bu iki donör suşunun genomik dizilimlerinde tanımlanan direnç gen profiline karşılık gelen direnç fenotiplerine sahip olması beklenmektedir. Plazmid p134797 (SW4955'ten), üçüncü nesil sefalosporinlere (blaCTX-M-55) direnç ve aminoglikozitlere (aac (3) -IIa ve aadA1), fenikollere (catA2), tetrasiklinlere (tet (A)), trimetoprim (dfrA14) ve sülfonamidlere (sülfin) direnç kazandıran genlere sahiptir; SW4955 kromozomunda antibiyotik direnç genleri bulunamadı. Plazmid p101718 (SW7037'den) sadece bir antibiyotik direnç geni (bla CMY-2) taşır ve üçüncü nesil sefalosporinlere (blaCTX-M-55) direnç kazandırması beklenir. Yine SW7037 kromozomunda antibiyotik direnci genleri bulunamadı.

Çiftleşmeyi takiben, yukarıda belirtilen tüm direnç genlerini taşıyan iki konjugatif plazmidin transferinin tespiti bekleniyordu. Pozitif konjugasyon tespiti, transkonjuganlar olarak tanımlanan alıcıların konjugatif plazmidleri edinmiş olmaları gerektiği anlamına gelir. Transkonjuganlardaki konjugatif plazmidler için tanısal direnç genlerinin varlığı da (PCR ile tespit edildiği gibi) bekleniyordu.

Burada açıklanan yöntemleri göstermek için, iki E. coli çevresel izolatının konjugasyon yoluyla plazmid DNA'sını transfer etme kabiliyeti test edilmiştir. Deney ortamının şematik bir temsili Şekil 1'de gösterilmiştir. İki donör (E. coli SW4955 ve SW7037) ve bir alıcı (E. coli LMB100) bağımsız olarak çiftleştirildi. E. coli SW4955 (p134797) ve SW7037'de (p101718) bulunan konjugatif plazmidlerin gen haritası Şekil 2'de gösterilmiştir.

Konjugatif plazmidler karbenisilin ile seçildi ve direnç belirleyicileri alıcının kromozomunda bulunan rifampin ve streptomisin kullanılarak karşı seçildi. MacConkey agar, laktoz pozitif donörleri (büyük, pembe koloniler üreten) alıcıdan ve transkonjuganlardan (laktoz negatif olan ve daha küçük, soluk sarı koloniler üreten) ayırt etmek için kullanıldı (Şekil 3).

Şekil 3: MacConkey agar'daki donör ve alıcı kolonileri için diferansiyel renk belirteçlerinin gösterimi. Bağışçılara karşılık gelen koloniler laktoz pozitif oldukları için MacConkey agar'da pembedir. Bu, donörü soluk sarı ve daha küçük (laktoz negatif) olan alıcı kolonilerden ayırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Konjugatif plazmid p134797'nin mobilizasyonu, plazmidde bulunan beş farklı direnç geni sınıfına karşılık gelen beş antibiyotiğin her biri ile tespit edildi.

SW4955 suşu için konjugasyon verimliliğinin (CE) nasıl hesaplanacağına dair bir örnek sunulmuştur. SW4955 suşu ile yapılan tahlilden, seyreltme 10-2'den plakada 172 CFU transkonjuganlar sayıldı; karşılık gelen seyreltmeden (10-2) alıcının sayısı 10.300.000 CFU / mL idi (Tablo 4).

CE aşağıdaki gibi hesaplanır:

CE = (174 CFU/mL)/(10.300.000 CFU/mL)

CE= 1.67 x 10-5 transkonjugan/alıcı

Tablo 4: SW4955 suşu için konjugasyon verimliliğinin (CE) nasıl hesaplanacağına dair bir örnek.

Sonuçlar, alıcı başına konjugasyon verimliliği olarak ifade edilen Tablo 5'te gösterilmiştir. Donör olarak SW4955 suşu kullanılarak elde edilen beş konjugasyon etkinliğinin hepsi aynı büyüklük sırasına sahipti. Bu sonuçlar, konjugatif plazmidin mobilizasyonunun, transkonjugant tanımlaması için kullanılan seçimden bağımsız olarak tespit edilebileceğini göstermektedir.

SW7037 suşunu donör olarak kullanarak, elde edilen konjugasyon verimliliği üç büyüklük sırasına göre daha düşüktü; Bu sonuçlar, farklı donörlerin ve plazmid tiplerinin konjugasyon verimliliklerinin aynı alıcılarla karşılaştırılmasına izin verir.

Tablo 5: E. coli donör suşlarının SW4955 ve SW7037 konjugasyon etkinlikleri, seçilimde kullanılan antibiyotiğe bağlı olarak.

Transkonjuganlarda, test edilen iki konjugatif plazmidde kodlanan replikonların ve tüm direnç genlerinin varlığı ve bunlara karşılık gelen replikonlar PCR ile kontrol edildi. Bu tanısal PCR reaksiyonları için kullanılan durumlar Tablo 3'te gösterilmiştir.

Teşhis jelleri Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu jeller, transkonjuganlarda beklenen replikonların varlığını doğrular (p1347975'te IncFIC ve IncFIB ve p101718'de IncI1). Ayrıca, beklenen antibiyotik direnci genlerinin, yani bla CTX-M-55 grubu (beta-laktam), aac (3) -II ve aadA (aminoglikozit), catA2 (fenikol), tet (A) (tetrasiklin), dfrA14 (trimetoprim) ve p1347975 için sülfoamid ve p101718 için blaCMY-2 (Şekil 4) varlığını doğrulamaktadırlar.

Şekil 4: Tanısal elektroforez jelleri. Donör hücrelerde (sırasıyla SW4955 ve SW7037 suşları) ve karşılık gelen LMB100 transkonjuganlarında konjugatif plazmidler p134797 ve p101718'de bulunan antibiyotik direnç genlerinin ve plazmid replikonlarının PCR ürünlerinin jel elektroforezi. Plazmid seçiminde karbenisilin kullanıldı. Kısaltma. -: negatif kontrol (LMB100 suşunun DNA'sı negatif kontrol olarak kullanılmıştır); D: donör; T: transkonjugan. Beklenen amplikon boyutları: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 bp; aadA1: 283 bp; catA2 : 225 bp; tet(A): 957 bp; dfrA14: 302 bp; sul3: 799 bp; IncFIC(FII): 262 bp; IncFIB: 683 bp; blaCMY-2: 1.855 bp; IncI1-I: 139 bp. Jel% 1 agaroz vardır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.