Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Geleneksel pulldown, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır¹. Bununla birlikte, saflaştırılmış proteinler genellikle in vitro^2,3 etkili bir şekilde etkileşime girmez ve bazıları^{bağlanma ortakları 4,5} olmadan çözünmez. Bu tür proteinler ko-translasyonel montaj veya moleküler şaperonların varlığı gerektirebilir ^5,6,7,8,9. Konvansiyonel pulldown'un bir başka sınırlaması, ^8,10 ile birlikte translasyonel^olarak bir araya getirilmiş kararlı homo-oligomerler olarak var olabilen alanlar arasındaki olası heteromultimerizasyon aktivitesinin test edilmesidir^, çünkü birçoğu kuluçka süresi boyunca in vitro olarak ayrışamaz ve yeniden ilişkilendirilemez. Bu tür sorunların üstesinden gelmede birlikte ifade etmenin yararlı olduğu bulunmuştur ^3,11. Bakterilerde uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ekspresyon, polikomb baskılayıcı kompleks PRC2 12, RNA polimeraz II mediatör kafa modülü 13, bakteriyofaj T4 taban plakası¹⁴, SAGA kompleksi deubikitinilaz modülü ^15,16 ve ferritin ^17'yi içeren büyük çok alt birimli makromoleküler kompleksleri saflaştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Birlikte ifade için yaygın olarak kullanılan çoğaltma kaynakları ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ ve RSF^20'dir. Ticari olarak temin edilebilen Duet ekspresyon sisteminde, bu kökenler farklı antibiyotik direnç genleri ve polisitronik vektörler üretmek için uygun çoklu klonlama bölgeleri ile birleştirilir ve sekiz proteine kadar ekspresyona izin verir. Bu kökenler farklı kopya numaralarına sahiptir ve hedef proteinlerin dengeli ekspresyon seviyelerini elde etmek için çeşitli kombinasyonlarda kullanılabilir²¹. Protein-protein etkileşimlerini test etmek için çeşitli afinite etiketleri kullanılır; en yaygın olanları 6xHistidin, glutatyon-S-transferaz (GST) ve maltoz bağlayıcı proteindir (MBP), bunların her biri karşılık gelen reçineye spesifik bir afiniteye sahiptir. GST ve MBP ayrıca etiketli proteinlerin çözünürlüğünü ve kararlılığını arttırır²².

Ökaryotik hücrelerde protein ko-ekspresyonunu içeren bir dizi yöntem de geliştirilmiştir, bunlardan en önemlisi maya iki hibrid tahlilidir (Y2H)²³. Y2H testi ucuz, kolaydır ve çoklu etkileşimlerin test edilmesine izin verir; ancak, iş akışının tamamlanması 1 haftadan fazla sürer. Ayrıca, daha az sıklıkla kullanılan birkaç memeli hücre bazlı tahlil vardır, örneğin, floresan iki hibrid tahlil (F2H)²⁴ ve hücre dizisi protein-protein etkileşim testi (CAPPIA)²⁵. F2H testi nispeten hızlıdır ve doğal hücresel ortamlarında protein etkileşimlerini gözlemlemeye izin verir, ancak pahalı görüntüleme ekipmanlarının kullanılmasını içerir. Tüm bu yöntemler, doğal ökaryotik çeviri ve katlama ortamı sağlayan prokaryotik ifadeye göre avantajlıdır; Bununla birlikte, etkileşimi dolaylı olarak, transkripsiyonel aktivasyon veya genellikle eserler üreten floresan enerji transferi yoluyla tespit ederler. Ayrıca, ökaryotik hücreler, daha yüksek ökaryotların proteinleri arasındaki ikili etkileşimlerin test edilmesine müdahale edebilen, ilgilenilen proteinlerin diğer etkileşim ortaklarını içerebilir.

Bu çalışma, diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntemi ve ardından geleneksel pulldown tekniklerini açıklamaktadır. Yöntem, birlikte ekspresyon gerektiren hedef proteinler arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir ve birden fazla hedefin toplu olarak test edilmesine izin verir, bu da çoğu durumda avantajlı olmasını sağlar. Uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ifade, zahmetli bir klonlama adımı gerektirmediğinden polisitronik birlikte ifadeden daha uygundur.

Yöntem iş akışının şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. E. coli'nin birlikte dönüşümü

1. Standart klonlama yöntemlerini kullanarak hedef proteinler için ekspresyon vektörleri hazırlayın.
   NOT: Tipik olarak, iyi bir başlangıç noktası, GST / MBP etiketli proteinlerin ekspresyonu için bir ampisilin direnç geni ve ColE1 orijinli geleneksel pGEX / pMAL vektörleri ve 6xHis etiketli proteinleri eksprese etmek için p15A veya RSF kökenli ve kanamisin direnci ile uyumlu bir vektör kullanmaktır. Genellikle, denemeden önce birkaç etiket kombinasyonunun test edilmesi gerekir. Açıklanan yöntemin kendisi, hedef proteinlerin ekspresyon koşullarını toplu olarak test etmek için uygundur. Çoğu Rosetta suşunun zaten nadir kodon için tRNA'ları eksprese etmek için p15A kökenli plazmid içerdiğine dikkat etmek önemlidir; Bu nedenle, bu tür suşların kullanılması olası bir seçenekse, p15A plazmidlerinden kaçınılmalıdır. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
   1. Luria-Bertani (LB) ortamında 37 ° C'de 0.1-0.2'lik bir optik yoğunluğa (OD) uygun bir suştaki bakterileri büyütün. Bu çalışmada örnek olarak BL21(DE3) suşu kullanılmıştır.
      NOT: İki vektörle verimli bir şekilde birlikte dönüşüm elde etmek için taze hazırlanmış yetkin hücrelerin kullanılması önerilir. İkiden fazla vektörün birlikte dönüştürülmesi gerekiyorsa, iyi bir dönüşüm verimliliği elde etmek için bunları sırayla dönüştürmek daha iyidir. Elektroporasyon iyi bir alternatiftir.
   2. 4 °C'de 9.000 x g'de 1 dakika boyunca bakteriyel süspansiyonun 1.0 mL'sini santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
   3. 0,5 mL buz gibi soğuk tampon dönüşüm tamponu (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 ve 15 mM CaCl₂) ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. 4 °C'de 8.000 x g'de 30 sn'lik santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
   5. 100 μL TB tampon ekleyin, her vektörden 100 ng ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Birlikte ifade olmadan protein davranışını incelemek için tek vektörleri ayrı ayrı dönüştürün. Ek olarak, ifade vektörlerini, spesifik olmayan bağlama denetimleri için boş birlikte ifade vektörleriyle çiftler halinde birlikte dönüştürün.
      NOT: Bu çalışmada verilen örneklerde, GST/MBP cDNA'lara kaynaşmış karşılık gelen cDNA'lara sahip pGEX/pMAL vektörleri, Thioredoxin cDNA'ya kaynaşmış cDNA kodlama ortağı protein alanlarını taşıyan uyumlu pASIC türevi vektörlerle birlikte kullanılmıştır.
   6. 42 °C'de 150 s ısıtın, ardından buz üzerinde 1 dakika soğutun.
   7. Antibiyotiksiz 1 mL sıvı LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. % 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren LB-agar plakaları üzerindeki plaka (yaygın konsantrasyonlar: 50 mg / L ampisilin; 20 mg / L kanamisin; 50 mg / L streptomisin; 35 mg / L kloramfenikol). Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

2. İfade

1. Hücreleri plakadan 2 mL sıvı LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mL LB ortamına yıkayın (yaygın konsantrasyonlar: 50mg / L ampisilin; 20 mg / L kanamisin; 50 mg / L streptomisin; 35 mg / L kloramfenikol). Metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin (bu çalışmada verilen örneklerde, medyaya 0.2 mM ZnCl₂ eklenmiştir). Deneyin daha sonraki bir tekrarı için -70 ° C'de% 20 gliserol içeren bir aliquot saklayın.
   NOT: İki plazmid arasındaki ara sıra rekombinasyon olayları nedeniyle tek bir izole klonda kötü ekspresyon olasılığını dışlamak için birkaç koloninin doğrudan plakadan temizlenmesi önerilir.
2. Hücreleri 37 ° C'de 220 rpm'lik sabit bir dönüşle 0.5-0.7'lik bir OD'ye büyütün, oda sıcaklığına (RT) soğutun ve izopropil β-D-1-tiyogalaktopironosid (IPTG) 1 mM'ye ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 μL'lik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.
3. Hücreleri gece boyunca 18 ° C'de 220 rpm'lik sabit bir dönüşle inkübe edin.
   NOT: Optimum inkübasyon süresi ve sıcaklığı değişebilir; Gece boyunca 18 ° C çoğu protein için en iyi şekilde çalışır ve varsayılan olarak denenmesi önerilir. Spesifik olmayan güçlü bir bağlanma gözlenirse kuluçka süresini 2-3 saate düşürün.
4. Bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün (veya ikiden fazla farklı etiket kullanılıyorsa daha fazla) ve protein ekspresyonunu doğrulamak için hücre süspansiyonunun 20 μL'lik bir alikotunu saklayın. 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj.
   NOT: Duraklama noktası: Bakteriyel peletler -70 °C'de en az 6 ay saklanabilir.

3. Pulldown testi

NOT: 6xHis veya MBP/GST ile etiketlenmiş proteinler için ayrıntılı prosedürler açıklanmıştır. Tüm prosedürler 4 ° C'de gerçekleştirilir.

1. Bakteriyel peletleri, deneyden hemen önce eklenen proteaz inhibitörleri ve indirgeyici ajanlar (aşağıya bakınız) ile 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın. Metal yonlarını sıyırdığı için metal şelatlama reçineleri kullanırken ditiotreitolden (DTT) kaçının. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Çoğu protein için uygun bulunan lizis tamponlarının yaygın tarifleri şunlardır:
   1. 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, %0.1 NP40, %10 [w/w] gliserol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) ve proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesini karıştırın (bkz.
   2. GST veya MBP pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, %0,1 NP40, %10 [w/w] gliserol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesini karıştırın (bkz.
2. Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun. Elektroforez için 20 μl'lik bir aliquot saklayın.
   NOT: Tipik olarak, numune başına 20 W çıkış gücüne sahip 15 s aralıklarla 5 sn'lik 20-25 darbe gerekir. Aşırı ısınmayı önlemek ve toplam hücre bozulmasını sağlamak için her cihaz için uygun sonikasyon gücü ayarlanmalıdır. Daha iyi performans elde etmek için, yüksek verimli çok uçlu sonikatör problarının kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
3. 30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj. Sonraki SDS-PAGE analizi için 20 μL berraklaştırılmış lizat toplayın.
4. Reçineyi (her numune için 50 μL) 10 dakika boyunca 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
5. Reçineye hücre lizatları (toplam protein konsantrasyonu: 20-50 mg / mL) ekleyin, 15 rpm'lik sabit bir rotasyonda 10 dakika boyunca inkübe edin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Sonraki SDS-PAGE analizi için ilişkisiz fraksiyonun 20 μL'sini toplayın.
6. 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yatırın. 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Yıkama tamponları için yaygın tarifler şunlardır:
   1. 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, %0.1 NP40, %10 [w/w] gliserol ve 5 mM beta-merkaptoetanol karıştırın.
   2. GST veya MBP pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl₂, %0,1 NP40, %10 [w/w] gliserol ve 5 mM DTT karıştırın.
7. İki uzun yıkama gerçekleştirin: 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin, 15 rpm'lik sabit bir dönüşle 10-30 dakika inkübe edin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
8. 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin, 1 dakika kuluçkaya yatırın, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
9. Bağlı proteinleri, 50 μL elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca 1.200 rpm'de bir çalkalayıcıda süzün. Elüsyon tamponlarının yaygın tarifleri şunlardır:
   1. 6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol ve 5 mM beta-merkaptoetanol karıştırın.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7.5), 150 mM NaCl, 50 mM Glutatyon (bazik Tris ile pH 7.5'e ayarlanır) ve 5 mM DTT.
   3. MBP-pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 150 mM NaCl, 40 mM maltoz ve 5 mM DTT'yi karıştırın.
10. Salınan proteinleri SDS-PAGE ile analiz edin.
    NOT: Akrilamid yüzdesi, proteinlerin boyutuna göre ayarlanmalıdır. Bu çalışmada verilen örneklerde, tris-glisin-SDS tamponunda (2 mM Tris, 250 mM Glisin,% 0.1 SDS) 180 V'luk sabit voltajda çalışan% 12 akrilamid jelleri kullanılmıştır. jeller% 0.2 Coomassie mavi R250,% 10 asetik asit ve% 30 izopropanol içinde kaynatılarak boyanmış ve% 10 asetik asit içinde kaynatılarak boyanmıştır. Yüklü protein miktarı eşit olmamalıdır, çünkü farklı deneylerde çeşitli miktarlarda etkileşime giren proteinler aşağı çekilebilir.

Açıklanan yöntem birçok farklı hedefle rutin olarak kullanılmıştır. Burada, geleneksel pulldown teknikleri kullanılarak elde edilemeyen bazı temsili sonuçlar sunulmaktadır. Birincisi, spesifik ZAD (Çinko-parmak ile ilişkili alan) dimerizasyonunun incelenmesidir11. ZAD'ler stabil ve spesifik dimerler oluşturur, heterodimerler sadece paralog gruplar içindeki yakından ilişkili alanlar arasında mümkündür. Bu alanlar tarafından oluşturulan dimerler kararlıdır ve en az birkaç gün boyunca ayrışmazlar; Bu nedenle, saflaştırılmış ZAD'lerin karıştırılması tespit edilebilir herhangi bir bağlanma üretmez. Aynı zamanda, MBP ve Thioredoxin-6xHis-kaynaşmış ZAD'lerin birlikte ekspresyonu, MBP-pulldown testinin SDS-PAGE sonuçlarında ek bir bant olarak görünen, iyi ve tekrarlanabilir homo-dimerizasyon aktivitesi göstermektedir (Şekil 2A). Heterodimerlerin küçük bir kısmı, başka bir alanla birlikte eksprese edilen M1BP ile görülebilir; Bu etkileşim Y2A ile doğrulanmamıştır ve büyük olasılıkla yüksek protein konsantrasyonu nedeniyle spesifik olmayan bir ilişkinin sonucudur, çünkü bu alanlar sistein bakımından zengin ve aşırı derecede agregasyona eğilimlidir. Özellikle, bu durumda, ZAD'ler metal şelatlama reçinesine spesifik olarak bağlanmayan metal koordinasyon alanları olduğu için 6xHis-pulldown uygun değildir. Bu tür bir aktivite paralel bir deneyde dikkatlice incelenmelidir.

Başka bir örnek, ENY2 proteini ve bağlayıcı ortakları Sgf11 (1-83aa) ve CTCF proteini26'nın çinko-parmak alanı (460-631 aa) arasındaki rekabet testidir. Tek başına ifade edildiğinde, ENY2 proteini, doğal bağlanma ortaklarıyla etkileşime girmesini engelleyen dimerler oluşturur. Muhtemelen, hem Sgf11 hem de CTCF proteinleri, ENY2'nin aynı moleküler yüzeyine bağlanır ve etkileşimlerini karşılıklı olarak münhasır kılar. Ortak ifade testinde, 6xHis-etiketli ENY2 hem GST etiketli Sgf11 hem de MBP-CTCF ile etkileşime girdi, ancak MBP pulldown'larında GST-Sgf11 yoktu ve bunun tersi de geçerliydi (Şekil 2B). Bu sonuçlar, üçlü kompleksin oluşamayacağını ve etkileşimlerin birbirini dışladığını göstermektedir. Bu veriler diğer tahlillerle bağımsız olarak doğrulandı ve ENY2'nin bu komplekslerdeki farklı fonksiyonel rollerini destekledi. Büyük afinite etiketlerinin kendi başlarına sterik engeller getirebileceğine ve karmaşık oluşumu önleyebileceğine dikkat edilmelidir; bu nedenle, sonuç yalnızca birlikte ifade verilerine dayanmamalıdır.

Geleneksel ve birleştirilmiş birlikte ifade pulldown'larının iş akışlarının adım adım karşılaştırılması Şekil 3A'da gösterilmiştir. Birlikte ifade birleştirilmiş açılır menü, az sayıda numuneyle bile en az iki kat daha fazla zaman tasarrufu sağlar ve iyi ölçeklenebilirlik sağlar. CP190 proteininin BTB alanı (1-126aa) ile Drosophila CTCF proteininin (dCTCF) GST etiketli C-terminal alanı (610-818aa) arasındaki aynı etkileşimi incelemek için her iki tekniğin de kullanılmasının sonuçları Şekil 3B'de gösterilmiştir. Her iki yöntem de iyi verimlilik ve tekrarlanabilirlik gösterir (testler üç kopyada gerçekleştirilmiştir); Bu durumda, ko-ekspresyon kuplajlı pulldown, yalnızca GST proteini içeren kontrol örneklerinde görülebileceği gibi, daha düşük spesifik olmayan bağlanma göstermiştir.

Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Şematik, bu çalışmada kullanılan yöntem iş akışını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Temsili sonuçlar . (A) MBP ve 6xHis-pulldown testlerinde Çinko-parmak ilişkili etki alanı (ZAD) homodimerizasyonunun incelenmesi. MBP (40 kDa) veya 6xHis-Thioredoxin (20 kDa) ile kaynaşmış ZAD'ler, bakteri hücrelerinde birlikte eksprese edildi ve amiloz reçinesi (MBP etiketli proteinleri bağlar) veya Ni-NTA reçinesi (6xHis-etiketli proteinleri bağlar) ile saflaştırılan afinite. Birlikte saflaştırılmış proteinler SDS-PAGE ile görselleştirildi ve ardından Coomassie boyama yapıldı. MBP-pulldown sonuçları üst panellerde gösterilir, 6xHis-pulldown sonuçları alt panellerdedir (birçok ZAD spesifik olmayan bir şekilde Ni-NTA'ya bağlandığından sadece protein ekspresyon kontrolü olarak kullanılır). (B) ENY2 ve Sgf11/CTCF proteinleri arasındaki birbirini dışlayan etkileşimlerin incelenmesi. GST etiketli Sgf11 (1-81aa), MBP etiketli CTCF çinko-parmak alanı (460-631aa) ve 6xHis-etiketli ENY2 proteinleri, amiloz reçinesi, glutatyon reçinesi (GST etiketli proteinleri bağlar) veya Ni-NTA reçinesi ile saflaştırılan çeşitli kombinasyonlarda ve afinitede birlikte eksprese edildi. Birlikte saflaştırılmış proteinler SDS-PAGE ile görselleştirildi ve ardından Coomassie boyama yapıldı. A ve B panellerindeki şekil Bonchuk ve ark.11 ve Bonchuk ve ark.26'nın izniyle değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Geleneksel ve birleştirilmiş ortak ifade pulldown tahlillerinin iş akışlarının karşılaştırılması. (A) Geleneksel pulldown testinin iş akışında gerekli zaman aralıklarının, birlikte ifadeye bağlı pulldown'a kıyasla adım adım karşılaştırılması. (B) GST-pulldown tahlillerinde dCTCF C-terminal alanı (610-818aa) ile CP190 proteininin BTB alanı (1-126aa) arasındaki etkileşimi incelemede iki farklı pulldown tekniğinin karşılaştırılması. GST (25kDa) veya GST ile tek başına kaynaştırılan dCTCF (610-818aa) ya bakteri hücrelerinde birlikte eksprese edildi ya da Thioredoxin-6xHis-etiketli CP190 BTB ile in vitro olarak inkübe edildi ve glutatyon reçinesi ile saflaştırıldı. Her tahlilin üç bağımsız kopyası gösterilmiştir. Birlikte saflaştırılmış proteinler SDS-PAGE ile görselleştirildi ve ardından Coomassie boyama yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.