Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde
Bu makalede
Özet
Özet
Pulldown, kolay ve yaygın olarak kullanılan bir protein-protein etkileşim testidir. Bununla birlikte, in vitro olarak etkili bir şekilde bir araya gelmeyen protein komplekslerini incelemede sınırlamaları vardır. Bu tür kompleksler, ko-translasyonel montaj ve moleküler şaperonların varlığını gerektirebilir; ya in vitro olarak ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı oligomerler oluştururlar ya da bağlayıcı bir partner olmadan kararsızdırlar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel pulldown tekniklerinin izlediği bir dizi uyumlu vektör kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonuna dayanan bir yöntem kullanmak mümkündür. İş akışı, geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir, çünkü etkileşime giren proteinlerin ayrı ayrı saflaştırılması ve sonraki inkübasyonlarının zaman alıcı adımlarından yoksundur. Diğer bir avantaj, önemli ölçüde daha az sayıda adım ve in vitro ortamda bulunan proteinlerin proteoliz ve oksidasyona maruz kaldığı daha kısa bir süre nedeniyle daha yüksek bir tekrarlanabilirliktir. Yöntem, diğer in vitro tekniklerin uygun olmadığı tespit edildiğinde bir dizi protein-protein etkileşimini incelemek için başarıyla uygulandı. Yöntem, protein-protein etkileşimlerini toplu olarak test etmek için kullanılabilir. BTB alanı ile içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki etkileşimlerin ve çinko-parmak ile ilişkili alanların heterodimerlerinin çalışmaları için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Giriş
Geleneksel pulldown, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, saflaştırılmış proteinler genellikle in vitro2,3 etkili bir şekilde etkileşime girmez ve bazılarıbağlanma ortakları 4,5 olmadan çözünmez. Bu tür proteinler ko-translasyonel montaj veya moleküler şaperonların varlığı gerektirebilir 5,6,7,8,9. Konvan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Yöntem iş akışının şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. E. coli'nin birlikte dönüşümü
- Standart klonlama yöntemlerini kullanarak hedef proteinler için ekspresyon vektörleri hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, iyi bir başlangıç noktası, GST / MBP etiketli proteinlerin ekspresyonu için bir ampisilin direnç geni ve ColE1 orijinli geleneksel pGEX / pMAL vektörleri ve 6xHis etiketli proteinleri eksprese etmek için p15A veya RSF kökenli ve kanamisin direnci ile uyumlu bir vektör kullanmaktır. Genellikle, denemeden önce birkaç etiket kombinasyonunun test edilmesi gerekir. Aç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Açıklanan yöntem birçok farklı hedefle rutin olarak kullanılmıştır. Burada, geleneksel pulldown teknikleri kullanılarak elde edilemeyen bazı temsili sonuçlar sunulmaktadır. Birincisi, spesifik ZAD (Çinko-parmak ile ilişkili alan) dimerizasyonunun incelenmesidir11. ZAD'ler stabil ve spesifik dimerler oluşturur, heterodimerler sadece paralog gruplar içindeki yakından ilişkili alanlar arasında mümkündür. Bu alanlar tarafından oluşturulan dimerler kararlıdır ve en az birkaç gün boyunca ayrışmazlar; Bu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tarif edilen yöntem, in vitro olarak verimli bir şekilde monte edilemeyen ve birlikte ekspresyon gerektiren protein-protein etkileşimlerinin test edilmesine izin verir. Bu yöntem, homodimerizasyon yeteneğine sahip heterodimerize edici proteinleri incelemek için birkaç uygun yaklaşımdan biridir, çünkü ayrı ayrı saflaştırıldığında, bu tür proteinler deney sırasında çoğu zaman ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı homodimerler oluşturur 3,11.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı'nın 19-74-30026 (yöntem geliştirme ve doğrulama) ve 19-74-10099 (protein-protein etkileşim tahlilleri) projeleri tarafından desteklenmiştir; ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1661 (temsili protein-protein etkileşimlerinin analizi) hibesi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 8 ELEMANLI prob | Sonics | 630-0586 | Yüksek verimli 8 elemanlı sonikatör probları |
| Agar | AppliChem | A0949 | |
| Amiloz reçinesi | New England Biolabs | E8021 | MBP etiketli proteinlerin saflaştırılması için reçine |
| Antibiyotikler | AppliChem | A4789 (kanamisin); A0839 (ampisilin) | |
| Beta-merkaptoetanol | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutatyon | AppliChem | A9782 | |
| Glutatyon agaroz | Pierce | 16100 | GST etiketli proteinlerin saflaştırılması için reçine |
| Gliserol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | 6xHis etiketli proteinlerin saflaştırılması için reçine |
| İmidazol | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltoz | Uygulaması | A3891 | |
| MOPS | Uygulaması | A2947 | |
| NaCl | Uygulaması | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | p15A replikasyon orijinli proteinlerin birlikte ekspresyonu için vektör |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Proteinlerin CloDF13 replikasyon orijinli PMSF ile birlikte ekspresyonu için vektör |
| AppliChem | A0999 | ||
| Proteaz İnhibitör Kokteyli VII | Calbiochem | 539138 | Proteaz İnhibitörü Kokteyli |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | RSF replikasyon orijinli proteinlerin birlikte ekspresyonu için vektör |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 sonikatör | Sonics | CV334 | Ultrasonik sıvı işlemci |
| ZnCl2< / sub> | AppliChem | A6285 |
Kaynaklar
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
