Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

2.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64564

⸱

16 Aralık 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Felsenstein Medical Research Center, 2Davidoff Center, Rabin Medical Center, 3BioInsight Ltd., 4Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Özet

Tümör biyolojisini anlamadaki kayda değer ilerlemelere rağmen, klinik çalışmalara giren onkoloji ilaç adaylarının büyük çoğunluğu, genellikle klinik etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olmaktadır. Bu yüksek başarısızlık oranı, mevcut preklinik modellerin, esas olarak tümör heterojenliğini ve tümör mikroçevresini yansıtmadaki yetersizlikleri nedeniyle klinik etkinliği tahmin edememelerini aydınlatmaktadır. Bu sınırlamalar, bireysel hastalardan elde edilen insan tümör örneklerinden oluşturulan 3 boyutlu (3D) kültür modelleri (sferoidler) ile ele alınabilir. Bu 3D kültürler, gerçek dünya biyolojisini, tümör heterojenliğini yansıtmayan yerleşik hücre çizgilerinden daha iyi temsil eder. Ayrıca, 3B kültürler 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar) daha iyidir, çünkü hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltırlar ve doğal hücre şeklini ve büyümesini korurlar. Bu çalışmada, 3D olan ve çok hücreli sferoidlerde büyüyen bireysel hastalardan kanser hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması için bir yöntem geliştirilmiştir. Hücreler doğrudan hasta tümörlerinden veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden türetilebilir. Yöntem, katı tümörlere (örneğin, kolon, meme ve akciğer) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda özel ekipmanlara güvenmeden tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Burada, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) oluşturmak ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmek için bir protokol sunulmuştur: bir hücre canlılık testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Bu çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

İn vitro ve in vivo çalışmalar, kanser tedavilerinin geliştirilmesinde tamamlayıcı yaklaşımları temsil etmektedir. İn vitro modeller çoğu deneysel değişkenin kontrolüne izin verir ve nicel analizleri kolaylaştırır. Genellikle düşük maliyetli tarama platformları olarak hizmet ederler ve mekanik çalışmalar için de kullanılabilirler1. Bununla birlikte, biyolojik alaka düzeyleri doğal olarak sınırlıdır, çünkü bu tür modeller tümör mikroçevresini sadece kısmen yansıtır1. Buna karşılık, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo modeller, tümör mikroçevresinin karmaşıklığını yakalar ve translasyonel çalışmalar ve hastalarda bireyselleştirici tedavi için daha uygundur (yani, bireysel bir hastadan türetilen bir modelde ilaçlara verilen yanıtı araştırmak)1. Bununla birlikte, in vivo modeller, deneysel parametreler in vitro modeller kadar sıkı bir şekilde kontrol edilemediğinden ve gelişimleri zaman alıcı, emek yoğun ve maliyetli olduğundan ilaç taraması için yüksek verimli yaklaşımlara elverişli değildir 1,2.

İn vitro modeller 100 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve hücre hatları 70 yılı aşkın bir süredir mevcuttur3. Bununla birlikte, son birkaç on yılda, solid tümörlerin mevcut in vitro modellerinin karmaşıklığı çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu karmaşıklık, tümör kaynaklı yerleşik hücre hatları veya birincil hücre hatları olan 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar), 3 boyutlu (3B) modelleri içeren daha yeni yaklaşımlara kadar uzanır1. 2B modellerde, kurulan ve birincil hücre çizgileri4 arasında önemli bir ayrım vardır. Kurulan hücre hatları ölümsüzleştirilir; Bu nedenle, aynı hücre hattı, tarihsel bir perspektiften bakıldığında, işbirliğini, veri birikimini ve birçok tedavi stratejisinin geliştirilmesini kolaylaştıran uzun yıllar boyunca küresel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarındaki genetik anormallikler her geçişte birikir ve böylece biyolojik alaka düzeylerini tehlikeye atar. Ayrıca, mevcut hücre hatlarının sınırlı sayısı, 4,5 hastalarında tümörlerin heterojenliğini yansıtmamaktadır. Primer kanser hücre hatları doğrudan biyopsiler, plevral efüzyonlar veya rezeksiyonlar yoluyla elde edilen rezeke tümör örneklerinden elde edilir. Bu nedenle, birincil kanser hücre hatları, tümör mikroçevresinin unsurlarını ve hücreler arası davranışlar (örneğin, sağlıklı ve kanserli hücreler arasındaki çapraz konuşma) ve kanser hücrelerinin kök benzeri fenotipleri gibi tümör özelliklerini korudukları için biyolojik olarak daha önemlidir. Bununla birlikte, birincil hücre hatlarının replikatif kapasitesi sınırlıdır, bu da dar bir kültür süresine yol açar ve analizler için kullanılabilecek tümör hücrelerinin sayısını sınırlar 4,5.

3D kültürleri kullanan modeller, in vivo koşullar korunduğundan 2D kültür modellerinden biyolojik olarak daha önemlidir. Böylece, 3D kültür modelleri doğal hücre şeklini ve büyümesini korur ve hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltır. Kanser araştırmalarında en yaygın kullanılan 3D modeller arasında çok hücreli sferoidler, iskele tabanlı yapılar ve matrise gömülü kültürlerbulunur 4,6,7.

Mevcut protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) üretmekte ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmektedir: hücre canlılığı testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Burada sunulan temsili sonuçlar meme ve kolon kanserinden; Bununla birlikte, bu protokol diğer katı tümör tiplerine (örneğin, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında özel ekipmana dayanmadan tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.

Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: (1) ilaç etkinliğini test etmek için bir model olarak kullanılmalarına hazırlık olarak sferoidlerin oluşturulması, toplanması ve sayılması; (2) Sferoidler üzerindeki ilaç etkinliğini değerlendirmek için MTT testi; ve (3) ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde başka bir yaklaşım olarak sferoidlerin ilaçlarla tedavisini takiben morfolojik değişikliklerin mikroskobik olarak değerlendirilmesi (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Primer tümör hücre kültürleri için kullanılan insan tümör örneklerinin toplanması, Rabin Tıp Merkezi'nde kurumsal inceleme kurulu (IRB) onaylı protokollere göre, hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılmaya uygun hastalar arasında metastatik olmayan meme, kolon, karaciğer, akciğer, nöroendokrin, yumurtalık veya pankreas kanseri, herhangi bir pediatrik kanser veya herhangi bir metastatik kanseri olan erkek ve kadın yetişkin ve pediatrik kanser hastaları vardı. Tek dışlama kriteri, bilgilendirilmiş onam sağlama kapasitesinin olmamasıydı.

1. Sferoidlerin üretimi ve toplanması

NOT: Primer tümör hücrelerinin izolasyonu Kodak ve ark.8 tarafından tarif edildiği gibi gerçekleştirilebilir. Önemli olarak, sferoidleri üretmek için kullanılan primer tümör hücreleri, doğrudan biyopsi, rezeksiyon vb. ile elde edilen hasta örneklerinden veya Moskovits ve ark.9 tarafından tanımlandığı gibi, hasta kaynaklı ksenograft (PDX) modellerinden tümör örnekleri kullanılarak dolaylı olarak türetilebilir.

  1. Tek hücreli yapışkan primer hücre kültürüne sahip küçük bir şişe (T25) alarak, hücre kültürü ortamını çıkararak, PBS ile yıkayarak ve daha sonra 37 ° C'de 3 dakika boyunca 1 mL 1x Accutase (bir hücre ayırma çözeltisi) ekleyerek ( Malzeme Tablosuna bakınız) %75-%100 birleşimli yapışkan primer tümör hücre kültürlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlayın.
  2. 5 mL hücre kültürü ortamı ekleyerek Accutase çözeltisini nötralize edin (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı; Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. Hücreleri 10 mL'lik bir serolojik pipetle aspire edin ve 15 mL'lik bir konik tüpte biriktirin. Tüpü 800 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj edin.
  4. Hücre kültürü ortamını çıkarın, hücre peletinin üzerine 5 mL taze hücre kültürü ortamı ekleyin ve yavaşça karıştırın.
  5. Canlı hücreleri bir hemositometre10 ile sayın. Bunu yapmak için, hücre süspansiyonunun 50 μL'lik bir alikotunu alın ve 50 μL tripan mavisi ile karıştırın. Canlı hücreleri (mavi renk için negatif olan hücreler) sayın ve süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.
  6. Bir "3D kültür ortamı" hazırlayın (% 5 bazal membran matrisi ile desteklenmiş bir hücre kültürü ortamı; Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: "3D kültür ortamı" oda sıcaklığında sıvı gibidir. 37 ° C'de, tutarlılık daha jel benzeri hale gelir (böylece hücreler birlikte kalır), ancak yine de pipetlenebilir (sadece% 5 bazal membran matrisi içerdiğinden).
  7. Tahlil için gereken hücre sayısını ve gereken toplam hacmi hesaplayın; her bir kuyucuk 200 μL ortamda 2.000-8.000 hücre içermelidir.
  8. "3B kültür ortamının" 200 μL'sinde istenen sayıda hücreye (örneğin, 4.000 hücre) sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve homojen bir dağılım sağlamak için pipetle hafifçe karıştırın.
  9. Süspansiyonu bir pipetleme haznesine aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ultra düşük 96 delikli bir bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin (bkz. Hücrelerin her toplanmasından önce, süspansiyonu iyice karıştırın.
  10. Hücrelerin kümelenmesini zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, böylece hücre agregasyonunu iyileştirin ve plakayı% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
  11. Her 2-3 günde bir, "3D kültür ortamını" yenileyin. Plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin, ortamın %50'sini (100 μL) nazikçe çıkarın ve atın ve mevcut çözeltiyi değiştirmek için 100 μL taze "3D kültür ortamı" ekleyin. 1.11. adımı tekrarlayın ve plakayı 37 ° C, % 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin.
    NOT: Ortamın çıkarılması, plaka 45°'de tutulduğunda yapılmalı ve hücrelerin toplanmasını önlemek için ortam sadece üst kısımdan toplanmalıdır. Vakum emme sistemi kullanılmamalıdır. Taze ortam, oluşmaya başlamış olan sferoidleri bozmamak için yavaş ve nazikçe eklenmelidir.
  12. Sferoid oluşumu izlemek için hücreleri her 1-2 günde bir mikroskop altında inceleyin. Görüntüleme yazılımındaki "ölçek" aracı kullanılarak oluşturulan kürelerin çapını ölçün ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Mikroskobik inceleme öncelikle zaman ilerledikçe küresel bir şekil alan düzensiz yuvarlak-oval cisimleri ortaya çıkarmalıdır11,12.
    1. Küresel çap 100-200 μm'ye ulaştığında, ilaç etkinlik deneylerini gerçekleştirin.
      NOT: İlaç etkinliği deneyleri, sferoidler bu çapa ulaştığında gerçekleştirilir, çünkü o sırada hücrelerin çoğunluğu çoğalır, bu da tedaviye yanıtı değerlendirmeye elverişlidir. Daha büyük çaplı sferoidler nekrotik bir çekirdek ve sessiz bir tabaka11,12 içerir, bu da tedaviye yanıt veren çoğalan hücrelerin daha küçük bir oranı ile sonuçlanır.
  13. Sferoid toplama için, her bir kuyucuktan küreleri toplamak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın ve bunları 15 mL'lik bir konik tüpe koyun.
    NOT: Sferoidler doğası gereği kırılgandır ve nazik kullanım gerektirir. Ortamı sferoidlerle birlikte konik tüpe aktarırken, tüpü 45 ° C'de tutun ve tüpün duvarında yavaşça pipet yapın. Sferoidler gözle görülebilir.
  14. Konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.
  15. Hücre kültürü ortamının 0.5 mL'sini ekleyin ve peleti iyi ama nazikçe yeniden askıya alın. Kabarcık yapmaktan kaçının.
  16. Aşağıdaki adımları izleyerek küresel sayım gerçekleştirin.
    1. 96 delikli bir plaka kullanın ve kuyuyu kadranlara bölmek için kuyunun alt tarafına bir artı işareti çizin (sayımı izlemeye yardımcı olmak için).
    2. Kuyuya 50 μL süspansiyon ekleyin ve sferoidleri mikroskop altında manuel olarak sayın (10x objektif lens kullanarak).
    3. Her kadrandaki sferoidleri sayın, iki kez saymamaya dikkat edin ve kuyudaki toplam sferoid sayısını hesaplayın.
      NOT: Sayımın doğruluğu için, bir kuyuda en az 50 sferoid sayın. 50'den az sferoid varsa, homojen dağılımı sağlamak için süspansiyonu yavaşça karıştırın ve yeni bir kuyucuğa eklenen süspansiyonun daha büyük bir hacmini kullanarak tekrar sayın. Alternatif olarak, bir kuyuda 50'den az sferoid varsa, sferoidler santrifüj edilebilir ve <0,5 mL'lik bir hacimde yavaşça yeniden askıya alınabilir. 100'den fazla sferoid varsa, sferoid süspansiyona hücre kültürü ortamı ekleyin, yavaşça karıştırın ve anlatın.
    4. Küresel konsantrasyonu hesaplayın (küresel sayım/sayma hacmi [μL]) ve ardından süspansiyondaki toplam sferoid sayısını hesaplayın (küresel konsantrasyon × toplam hacim).

2. İlaç etkinliği testi (MTT testi)

NOT: Ayrıntılar için lütfen van Meerloo et al.13'e bakınız. Ayrıca, MTT testi için, "3D kültür ortamı" değil, yalnızca hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır (bazal membran matrisinin eklenmesi gerekli değildir ve MTT testine potansiyel olarak müdahale edebilir).

  1. Yeni bir tüpte, 200 μL hücre kültürü ortamı başına 200 sferoid konsantrasyonunda bir sferoid süspansiyonu hazırlayın (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı).
    1. Her ilaç tedavisi için, 15 mL'lik bir tüpte bir sferoid stoğu hazırlayın. Her ilaç için gereken miktarı, tekrarlar için gereken kuyucuk sayısına göre hesaplayın: (5-8) × 200 μL. İlacı, tüpe gereken son konsantrasyona ekleyin.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan ilaçlar ve dozajları ile ilgili temsili sonuçlar bölümüne bakınız. Ayrıca, ilaçların ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
  2. Küresel süspansiyonun 200 μL'sini ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın ve plakayı% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Tahlil için 96 delikli plakanın dış sıralarını ve sütunlarını kullanmayın, çünkü bu kuyucuklar, tekrarlanan deneyler arasında artan değişkenliğe yol açabilecek artan buharlaşma ile karakterize edilir; bunun yerine, bu kuyulara PBS ekleyin.
    NOT: Sferoidlerin kültürünün, kültür 96 delikli plakaya aktarılmadan önce homojen olması önemlidir. Ayrıca, her deneye bir kontrol koşulu (yani, işlenmemiş sferoidler) dahil edilmelidir.
  3. Sferoidleri 24-72 saat boyunca çalışma ilacı ile inkübe ettikten sonra, plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hücre kültürü ortamının 170 μL'sini yavaşça çıkarın, kuyunun dibinde 30 μL (sferoidleri içerir) bırakın.
    NOT: 170 μL hücre kültürü ortamının çıkarılması, sferoidlerin çıkarılmaması için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Plakayı 45°'de tutun ve bir elinizi (kontrast için koyu renkli bir eldiven giyerek) kuyucukların altına yerleştirin, böylece sferoidler görünür hale gelir (beyaz noktalar).
  4. MTT çözeltisini hazırlayın (fenol içermeyen RPMI'da 0.714 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Her bir kuyucuğa, kuyu başına 100 μL'lik son bir hacme 70 μL MTT çözeltisi ekleyin (kuyudaki son MTT konsantrasyonu, 100 μL başına 0.05 mg olacaktır). Ek olarak, hücresiz MTT çözeltisi ile "Boş" kuyular hazırlayın.
    NOT: MTT ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, davlumbazdaki ışık kapatılmalı ve MTT çözeltisini içeren tüp alüminyum folyo ile kaplanmalıdır.
  6. Kuyucuklardaki çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenene kadar plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 3-4 saat boyunca inkübe edin (mor renk canlı hücreleri temsil eder).
  7. Bir değişiklik gözlendiğinde, her bir kuyucuğa 100 μL durdurma çözeltisi (izopropanolde 0.1N HCl) ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan kuyucukların içeriğini hafifçe karıştırın.
  8. Plakanın bir Florometre-ELISA okuyucusunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) 570 nm dalga boyunda ve 630-690 nM arka plan dalga boyunda emilimini okuyun.
    NOT: Mevcut Florometre-ELISA okuyucu ultra düşük bağlantı 96 delikli plakayı okuyamıyorsa, her bir kuyucuğun içeriğini karşılık gelen düz tabanlı 96 delikli plakaya aktarın.
  9. Aşağıdaki adımları izleyerek hücre canlılığını hesaplayın.
    1. Her kuyucuk için "spesifik sinyali" hesaplayın ("spesifik sinyal" = 570 nm'deki sinyal - 630-690 nm'deki sinyal). Ardından, "Boş" kuyuların ortalama değerini hesaplayın ve bu değeri her kuyudan çıkarın.
    2. Çalışma ilacı ("AV-SS-unt") ile tedavi edilmeyen hücreleri içeren kontrol kuyucuğundaki "spesifik sinyallerin" ortalamasını hesaplayın.
    3. Her bir kuyucuktaki hücrelerin canlılığını (yüzdesini) tedavi edilmemiş hücrelere sahip kuyucuklara göre hesaplayın.
      NOT: Canlılık = (her kuyucukta spesifik sinyal/"AV-SS-unt") × 100

3. Sferoidlerdeki morfolojik değişikliklerin izlenmesi ve analiz edilmesi

NOT: MTT testine gelince, bu değerlendirmede "3D kültür ortamı" değil, sadece hücre kültürü ortamı kullanılmalıdır (bazal membran matrisinin eklenmesi gerekli değildir ve analize potansiyel olarak müdahale edebilir).

  1. Sferoidleri saydıktan sonra, hücre kültürü ortamındaki süspansiyonu (% 10 FBS, 1:100 penisilin-streptomisin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş RPMI-1640 kültür ortamı) 20 μL başına yaklaşık 1-2 sferoide seyreltin.
  2. Ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına 80 μL hücre kültürü ortamı koyun ve ardından kuyucuklara 20 μL küresel süspansiyon ekleyin.
    NOT: Bu nedenle, kuyular 100 μL'lik bir hacimde 1-2 sferoid içerecektir.
  3. Mikroskop altındaki kuyucukları dikkatlice kontrol edin ve bu analiz için kullanılacakları için bir küre içeren kuyucukları işaretleyin.
  4. Çalışma ilacını, ilgi konsantrasyonunun iki katı olan bir konsantrasyonda hazırlayın. İlgili kuyucuklara 100 μL ilaç çözeltisi ekleyin (kuyudaki toplam konsantrasyon daha sonra 1x olacaktır).
  5. 0. Günde (çalışma ilacını eklemeden önce) her bir kuyucuğun görüntüsünü yakalayın ve sferoidlerin çaplarını belirlemek için görüntüleme yazılımındaki "ölçek" aracını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  6. Plakayı% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve morfolojiyi inceleyin ve ilaç etkisinin ne zaman gözlemlendiğine bağlı olarak 3-7 gün boyunca günlük olarak sferoidlerin çapını ("ölçek" aracını kullanarak) ölçün (örneğin, hücre yayılımı, istilacı baklalar, yapı yıkımı, vb.).
  7. Deneyin sonunda, zaman içinde küresel çaplardaki (0. Güne göre) değişiklikleri çizin.
    NOT: Değişim (yüzde) = (belirli bir gündeki küresel çap / 0. Gündeki kürenin çapı) × 100

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, primer tümör hücrelerinden homojen bir sferoid kültürü oluşturmak, sferoid kültür (MTT testi) üzerindeki ilaç etkinliğini kantitatif olarak değerlendirmek ve çalışma ilaçlarının sferoid morfoloji üzerindeki etkisini belirlemek için prosedürler sunmaktadır. Kolon ve meme kanseri hücre kültürlerinden üretilen sferoidlerdeki temsili deneylerden elde edilen veriler sunulmuştur. Benzer deneyler, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri dahil olmak üzere diğer tümör tipleri kullanılarak gerçekleştir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, insan tümör örneklerinden türetilen 3D birincil hücre kültürleri (sferoidler) üretmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Bu sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını ve ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak da dahil olmak üzere çeşitli analizler için kullanılabilir. Protokol, doğrudan hasta örneklerinden türetilen primer tümör hücrelerini veya hasta örnekleri kullanılarak kurulabilen PDX modell...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5 FluorourasilTEVA İsraillot 16c22NAFluorouracil, Adrucil
AccutaseGibcoA1110501StemPro Accutase Hücre Dissosiyasyonu
SisplatinTEVA İsrail20B06LAAbiplatin, 
Kültrex Trevigen3632-010-02Bodrum membran matrisi, tip 3
DMSO (dimetil sülfoksit)Sigma AldrichD2650-100ML
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific2391595
Flurometre  ELISA okuyucuBiotekSynergy H1Gen5 3.11
Hidroklorik asit (HCl) Sigma Aldrichdurdurmaçözümü için
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD&nbsp; Sürüm 1.52aAçık kaynaklı yazılım ImageJ
IsopropanolGadotP180008215durdurma çözeltisi
için L-glutaminGibco1843977
MTT Sigma AldrichM5655-1G3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür
Esansiyel olmayan amino asitler ve nbsp;Gibco11140050
Palbociclib   Med Chem ExpressCAS # 571190-30-2
PBSGibco14190094Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)*Kalsiyum ve Magnezyum Penisilin İçermez
– streptomisin Invitrogen2119399
Fenol içermeyen RPMI 1640Biyolojik endüstriler, İsrail01-103-1A
Pippeting rezervuarıAlexredRED LTT012025
RPMI-1640 kültür ortamı Gibco11530586
SunitinibMed Chem ExpressCAS # 341031-54-7
TrastuzumabF. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland10172154 ILHerceptin
Tripan mavisi% 0.5 çözeltiBiyolojik endüstriler, İsrail03-102-1B
Ultra düşük bağlantı 96 kuyulu plakaGreiner Bio-one650970
VinorelbineEbewe11733027-03Göbek
320331

Kaynaklar

  1. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
  2. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).
  3. Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  4. Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).
  5. Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
  6. Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284(2022).
  7. Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
  8. Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
  9. Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665(2022).
  10. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).
  11. Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
  12. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).
  13. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
  14. Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B T m r Sferoidlerila Duyarl l k Deneyiok H creli SferoidlerPrimer Kanser H creleriT m r Mikro evresiMTT DeneyiUltra D k Tutunmal PlakaSferoid Olu umuH cre Canl l
Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.