Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Makrofajlar homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör fonksiyonlara sahiptir. Bu hücreler vücuttaki her dokuda bulunur ve mikro çevrede bulunan uyaranlara göre profillerini değiştirme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir. Sitokinler, makrofaj fizyolojisini, özellikle IFN-γ ve interlökin 4'ü derinden etkileyerek sırasıyla M1 ve M2 tiplerini oluşturabilir. Bu hücrelerin çok yönlülüğü nedeniyle, kemik iliği türevli makrofaj popülasyonunun üretimi, hücre biyolojisinin birçok deneysel modelinde temel bir adım olabilir. Bu protokolün amacı, kemik iliği progenitörlerinden türetilen makrofajların izolasyonu ve kültüründe araştırmacılara yardımcı olmaktır. Patojen içermeyen C57BL / 6 farelerinden elde edilen kemik iliği progenitörleri, bu protokolde murin fibroblast soyunun L-929'un süpernatantından elde edilen makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara dönüştürülür. İnkübasyondan sonra, olgun makrofajlar 7. günden 10. güne kadar kullanılabilir. Tek bir hayvan yaklaşık 2 x 107 makrofajın kaynağı olabilir. Bu nedenle, temel hücre kültürü yöntemlerini kullanarak büyük miktarlarda primer makrofaj elde etmek için ideal bir protokoldür.
Giriş
Monositler ve makrofajlar, kemik iliğindeki progenitörlerden türetilebilen mononükleer fagositlerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda makrofajların yolk kesesi kaynaklı eritromiyeloid progenitörlerden de köken aldığı bildirilmiştir1. Türevlerinden bağımsız olarak, bu lökositlerin homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör işlevleri vardır 2,3. Monositler, dokuda makrofajlara daha fazla farklılaşabilen periferik kandanalınan hücrelerdir 2,4, makrofajlar ise büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin5 lokal maru....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, Hayvan Deneylerinin Kontrolü Ulusal Konseyi'ne (Concea) uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile gerçekleştirilmiştir. C57BL/6 fareleri, Brezilya'nın Belo Horizonte kentindeki Minas Gerais Federal Üniversitesi'nin (UFMG) Biotério Central'ından satın alındı. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman (KKD) bu protokolde açıklanan tüm adımlarda kullanılmalıdır.
1. M-CSF kaynağı olarak fibroblast L-929 soy süpernatantının hazırlanması
- L-929 fibroblast soy hücrelerinin (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Sertifikalı Hücre Hattı-ATCC CCL....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Makrofajlar, özel fizyolojik özelliklere sahip büyük ve yapışık hücrelerdir. Cam ve plastiğe yapışma kabiliyeti nedeniyle kültürde çeşitli morfolojik sunumlar gösterirler ve tipik yayılma morfolojileri sitoplazmik uzantıların emisyonu ile ilgilidir (Şekil 1). Kemik iliği progenitörleri, L-929 hücre süpernatantından M-CSF'ye maruz kaldıklarında ve olgun makrofajlara dönüşümü başlattıklarında, Petri plakasına yapışırlar.
Şekil 2 , kemik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kemik iliğinden türetilmiş bir makrofaj popülasyonu üretmek, özellikle homojen bir birincil hücre popülasyonu elde etmenin önemli olduğu durumlarda, birçok hücre biyolojisi deneysel modelinde temel bir adımdır. Belirtildiği gibi, hücre progenitörleri sadece M-CSF varlığında makrofajlara dönüşebilir. L-929 hücre süpernatantları, M-CSF'nin ana kaynağı olarak kullanılabilir. Maliyet dışında, rekombinant M-CSF'nin kendisinin kullanılmasında herhangi bir sorun yoktur 8,17
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) ve Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16) ve Brezilya Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 20 cc'lik şırınga | DESCARPACK | SI100S4G | Steril şırınga |
| 26 G iğneler | BD | 497AQDKT7 | Steril iğneler |
| 50 ml konik santrifüj tüpü | SARSTEDT | 62547254 | Santrifüjlemeye uygun plastik konik tüpler |
| %70 etanol çözeltisi | EMFAL | 490 | Esterilizasyon için etanol çözeltisi |
| Anatomik diseksiyon forseps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | %70 etanol çözeltisi içeren steril beherde muhafaza |
| edin C57Bl/6 vahşi tip fare | Bioté'den satın alındı; Minas Gerais Federal Üniversitesi'ndeki rio Central | Uygulanamaz | Fareler, 6 ila 10 haftalık yaşları arasında, spesifik patojen içermemelidir. Farelerin taşıma stresinden kurtulmak için en az bir hafta önce yerleştirilmesi gerekir |
| Hücre kültürü şişesi T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 şişesi, eğimli boyun, yüzey alanı 75 cm2, filtre kapaklı, DNaz içermez, RNaz içermez |
| Hücre kültürü şişesi T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 şişesi, eğimli boyun, yüzey alanı 75 cm2, filtre kapaklı, DNaz içermez, RNase içermeyen |
| Dezenfeksiyon mu yoksa bebek Mendili mi? | CLOROX | Uygulanamaz | Kemiğin temizlenmesine yardımcı olur |
| Damıtılmış Su | GIBCO | 15230 | Steril damıtılmış su |
| DMEM/F12-10 | Uygulanamaz Uygulanamaz | DMEM/F12'ye (q.s.p. 100 mL)DMEM/F12-10 + L-929 hücrelerinin süpernatanına 10 mL Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 1 mL Penisilin/Streptomisin (P/S) ekleyin | |
| Uygulanamaz | DMEM / F-12-10 Dulbecco &prime üzerine L929 hücre kültürünün süpernatanının% 20'sini ekleyin | ||
| ; s Modifiye Eagle & Prime; s Orta - F12 (DMEM / F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium, 2.5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodyum piruvat ve 1200 mg / L sodyum bikarbonat içerir. Tozu 1 litre < br / > damıtılmış suya yeniden süspanse edin ve 3,7 g sodyum bikarbonat ekleyin. PH'ı 7,2'ye ayarlayın ve 0,22 > M ile filtreleyin. 2 - 8 ° C'de saklayın; C dondurucu |
| Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı inaktive edilmiş, Amerika Birleşik Devletleri (FBS) | GIBCO | 10082147 | DMEM-F12 Hemositometre için Zenginleştirme |
| SIGMA-ALDRICH | Z359629 | hücrelerinde makrofajları saymak için kullanılır | |
| SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) | |
| kaynağı olarak kullanılan bir fare fibroblast hücreleri soyudurNikon TI tutulması | NIKON | Uygulanamaz | Nikon TI Eclipse bir floresan ve faz kontrast mikroskobudur |
| Enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi, makrofajları plakadan zarar vermeden çıkarın |
| İşlem görmemiş yuvarlak kültür kapları 100 & kez; 20 – mm | CORNING | CLS430591 | Doku kültürü ile tedavi edilmiş petri kapları veya herhangi bir doku kültürü uygulanmış plaka kullanmayın |
| P3199 Penisilin G Potasyum Tuzu | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiyotikler |
| Penisilin ve streptomisin (P/S) solüsyonu | 0,26 gram penisilin ve 0,40 gram streptomisin kullanın. 40 mL steril PBS ile karıştırın. Yatay bir laminer akış kabini içinde 0,22 & mikro; M: 1.0 mL'lik alikotları filtreleyin ve dondurucuda 1.5 ml mikrofüj tüplerinde saklayın (-20° C) | ||
| Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Steril |
| S7975 Streptomisin Sülfat, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiyotikler |
| 10 mL veya 25 mL'lik serolojik pipetler | SARSTEDT | 861254001 | Serolojik pipetler 1 mL'den daha yüksek hacimlerde kullanılır |
| Sodyum Bikarbonat | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | DMEM-F12 Yazılımı için pH düzeltmesi |
| Nis Elements Viewer | NIKON | Uygulanamaz | NIS-Elements Viewer, görüntü dosyalarını ve veri kümelerini görüntülemek için ücretsiz bir bağımsız programdır |
| Steril PBS ve %2 P/S çözeltisi | LABORCRIN | 590338 | 40 mL steril PBS'ye 1 mL P/S ekleyin |
| Düz iris makası | KATENA | Uygulanamaz | %70 etanol çözeltisi içeren steril beherde muhafaza edin |
| L-929 hücrelerinin süpernatantı | Uygulanamaz | Uygulanamaz | L-929, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak kullanılan fare fibroblast hücrelerinin bir soyudur. L-929 süpernatanı protokolden elde edildi |
| Cerrahi Neşter Bıçağı No.24 Paslanmaz Çelik | SWANN-MORTON | 311 | Kemiklerden epifizi açığa çıkarmak için kullanılır Tripan |
| Mavisi Çözeltisi, %0.4 | GIBCO | 15250061 | Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4, boya dışlama testi kullanılarak hücre canlılığını değerlendirmek için rutin olarak bir hücre boyası olarak kullanılır |
| Tripsin/EDTA çözeltisi %0,05GIBCO | 25300-062 | Hücreleri kültür şişesinden ayırmak için kullanılır | |
| Hücre Kültürü için Enjeksiyon Suyu (WFI) | GIBCO | A12873 | Steril ve endotoksin içermeyen su |
Kaynaklar
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
