Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Monositler ve makrofajlar, kemik iliğindeki progenitörlerden türetilebilen mononükleer fagositlerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda makrofajların yolk kesesi kaynaklı eritromiyeloid progenitörlerden de köken aldığı bildirilmiştir¹. Türevlerinden bağımsız olarak, bu lökositlerin homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör işlevleri vardır ^2,3. Monositler, dokuda makrofajlara daha fazla farklılaşabilen periferik kandan^alınan hücrelerdir ^2,4, makrofajlar ise büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin⁵ lokal maruziyeti ile düzenlenen fenotipler ve işlevler sergileyen heterojen hücrelerdir. Makrofajlar bu tür fonksiyonel çeşitlilik gösterdikleri için birçok hastalık modelinde incelenmiştir. Bu nedenle, makrofajların in vitro kültürü, fizyolojilerini ve farklı hastalıklardaki rollerini anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Kemik iliği, elde edilen makrofaj sayısını katlanarak artıran, izole edilebilen ve çoğaltılabilen makrofaj progenitörleri de dahil olmak üzere önemli bir progenitör hücre kaynağıdır. Ek olarak, kemik iliği kaynaklı makrofajlar, doku mikroçevresi tarafından oluşturulan etkilerden kaçınmak için özellikle önemlidir, çünkü makrofajlar dokulardaki farklı uyaranlara yanıt olarak fenotiplerini değiştirir ^6,7. Kemik iliği progenitörleri, makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara ^dönüşür8. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, dokudaki biyokimyasal belirteçler ile monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt edilemez. Bu hücreler, diğer birçok açıdan peritoneal makrofajlarla^{karşılaştırılabilir} olan, oldukça homojen bir birincil hücre popülasyonunu temsil eder ^6,9.

Heterojen hücresel fonksiyonları nedeniyle, makrofajlar uzun zamandır araştırmacılar tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu hücreler, bu süreçlerde yer aldıkları için bulaşıcı ve enflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere farklı deneysel modellerde kullanılabilir^10,11. Çeşitli mikro-çevresel uyaranlara yanıt olarak makrofaj polarizasyonunu araştırmak için de yararlı olabilirler ^12,13. Bu nedenle, fare kemik iliğinden yüksek sayıda primer makrofaj elde etmek amacıyla burada basit ve güvenilir bir protokol sağlanmaktadır.

Bu protokol, Hayvan Deneylerinin Kontrolü Ulusal Konseyi'ne (Concea) uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile gerçekleştirilmiştir. C57BL/6 fareleri, Brezilya'nın Belo Horizonte kentindeki Minas Gerais Federal Üniversitesi'nin (UFMG) Biotério Central'ından satın alındı. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman (KKD) bu protokolde açıklanan tüm adımlarda kullanılmalıdır.

1. M-CSF kaynağı olarak fibroblast L-929 soy süpernatantının hazırlanması

1. L-929 fibroblast soy hücrelerinin (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Sertifikalı Hücre Hattı-ATCC CCL1) defrostunu çözün ve canlılığı korumak için kültür işlemine hemen başlayın.
2. Laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde, 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, L-929 fibroblast soy hücrelerini flakondan 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
3. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 50 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) eklemek için serolojik bir pipet kullanın.
4. 300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
5. Pelet, serolojik bir pipet kullanarak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mL penisilin / streptomisin (P / S) (DMEM / F12-10) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta-F12'sinin 20 mL'sinde yeniden süspanse edin.
6. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir T75 hücre kültürü şişesine aktarın.
7. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde tam birleşene kadar inkübe edin.
   NOT: Şişeyi manipüle ederken, bir kontaminasyon kaynağı olabileceğinden, kapağı solüsyonla ıslatmaktan kaçınmaya dikkat edin. Uygun miktarda süpernatan elde etmek için, hücrelerin hücre kültürü şişesinin tüm yüzeyini kapladıktan sonra çoğaltılması gerekir. L-929 hücreleri temas ile inhibe edilir. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi hücre kültürü genişlemesini başlatmak için tripsin/etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, DMEM/F12-10 ve steril PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.
8. Tam birleşmeye ulaşıldığında, süpernatanı laminer akış biyogüvenlik kabininin içindeki hücre kültürü şişesinden atın.
9. Hücre kültürü şişesini serolojik bir pipet kullanarak 20 mL steril PBS ile yıkayın ve çözeltiyi atın.
10. Yapışan hücreleri içeren hücre kültürü şişesine 10 mL tripsin / EDTA (% 0.05 çözelti) ekleyin.
11. Hücre kültürü şişesini laminer akıştan 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatöre aktarın ve 3 dakika inkübe edin.
12. Hücreleri kültür şişesinin yüzeyinden ayırmak için hücre kültürü şişesini sallayın ve tüm hücrelerin ayrıştığından emin olmak için bir mikroskop kullanın.
13. Tripsin / EDTA'yı (% 0.05 çözelti) 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ile etkisiz hale getirin.
14. Çözeltiyi serolojik bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
15. 300 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
16. Peletleri 10 mL DMEM / F12-10 ortamında yeniden süspanse edin.
17. Bir T175 hücre kültürü şişesine (1:10 kültür) 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
18. On adet T175 hücre kültürü şişesi elde etmek için prosedürü tekrarlayın.
19. Her hücre kültürü şişesine 50 mL DMEM / F12-10 ekleyin.
20. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde tam birleşene kadar inkübe edin.
    NOT: Bu adımlar 500 mL L-929 hücre süpernatantını garanti eder. 5. günde, hücreler T175 hücre kültürü şişesi yüzeyini kapladıktan sonra, süpernatant M-CSF için zenginleştirilecek ve toplanmalıdır¹⁴.
21. Temas inhibisyonundan sonraki 5. günde hücre kültürü şişesini inkübatörden çıkarın.
22. Ortamı 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.
23. 3.200 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
24. M-CSF ile zenginleştirilmiş süpernatanı toplayın ve çözeltiyi 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın. Dondurucuda -20 °C'de saklayın.
    NOT: Santrifüjleme, süpernatantlardan hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için son derece önemlidir.
25. L-929 süpernatant, uygun ve ucuz bir makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağıdır ve tipik olarak 5 ila 10 ng / mL M-CSF⁸ içerir. Bu süpernatanlar ayrıca eser miktarda diğer sitokinler ve büyüme faktörleri içerir, ancak makrofaj fizyolojisi üzerinde derin bir etki yapmazlar¹⁵. Bununla birlikte, saflaştırılmış M-CSF satın alınabilir ve 1 ila 2 ng/mL⁸ konsantrasyonlarında L-929 süpernatantlarına alternatif olarak kullanılabilir.

2. Femur ve tibianın çıkarılması

1. Ulusal Hayvan Deneyleri Konseyi'nin (Concea) 18 numaralı normatif kararına uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile karbondioksit boğulmasından sonra servikal çıkık yoluyla 8 haftalık, C57BL-6 vahşi tip erkek fare ötenazisi ile devam edin.
2. Fareyi% 70 etanol çözeltisi ile ıslatın ve karın boyunca 1 cm'lik bir kesi yapmak için steril makas kullanın.
3. Arka bacakların kası tamamen açığa çıkana kadar cildi çıkarın.
4. Femur ve kaval kemiğini kırmamaya dikkat ederek arka bacakları kalça yüksekliğinde çıkarın.
5. Arka bacakları% 70 etanol çözeltisi içeren konik bir santrifüj tüpüne koyun.
   NOT: Daima patojen içermeyen fareler kullanın. Daha fazla sayıda hücre elde etmek için her iki bacağınızı da topladığınızdan emin olun. Adım 2, steril olmayan bir ortamda (tezgah üstü) gerçekleştirilir. Bu nedenle, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için uyluk kemiği ve kaval kemiğinin sağlam kalması için dikkatli bir şekilde çıkarılması önemlidir. Bu prosedürün geri kalan adımları, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Bacakların% 70 etanol çözeltisine maruz kalma süresi 10 dakika ile sınırlandırılmalıdır. Süre uzarsa, kemik iliği progenitörleri etkilenebilir.

3. Tibia ve uyluk kemiğinin lümeninden kemik iliği progenitörleri elde edin

1. Bacakları% 70 etanol çözeltisinden çıkarın ve steril PBS'ye aktarın.
2. Tüm kas ve fasyayı çıkarmak için forseps ve dezenfektan mendil kullanmak. Bu adımdan sonra kemiğin temiz olması gerekir.
3. Kemik iliğini ortaya çıkarmak için her iki uçtaki kemik epifizini kesmek için steril bir cerrahi neşter bıçağı kullanın.
4. 20 mL'lik bir şırıngayı% 2 penisilin / streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş 10 mL steril PBS ile doldurun ve 26 G'lik bir iğne bağlayın.
5. Bir elinizle anatomik diseksiyon forsepsleri kullanarak kemiği tutun ve diğer elinizle iğneyi kemik boşluğuna sokmak için kullanın. Forseps ile kemiği ezmemeye dikkat edin.
6. Kemiğin içini PBS ile yıkayın ve kemik iliğini steril bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Bu adımdan sonra kemik boşluğu beyaz görünmelidir.
7. Toplanan hücreleri 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
8. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL DMEM / F12-10 içinde yeniden süspanse edin.
9. Hücreleri toplam 10 mL'ye çıkarmak için homojenize edin ve 9 mL daha DMEM / F12-10 ortamı ekleyin.

4. Makrofaj kültürü

1. 100 mm x 20 mm'lik yuvarlak plastik Petri kaplarının her birine (toplam 10 tabak) 1 mL hücre progenitörleri ekleyin ve homojen bir dağılım elde etmek için hücreleri bir pipetle plakalara yayın. Doku kültürü uygulanmış tabakları kullanmayın.
2. Her yemeğe %20 L-929 hücre süpernatanı ile takviye edilmiş 9 mL DMEM / F12-10 ekleyin.
3. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
4. 3^{. günde} , her yemeğe L-929 hücrelerinin süpernatanının% 20'si ile takviye edilmiş 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ekleyin. Bu şekilde, kültür kapları artık olgunlaşmalarının sonuna kadar hücrelerin büyümesi için yeterli olan toplam 20 mL kültür ortamına sahiptir.
   NOTLAR: Doku kültürü ile muamele edilmiş kaplar kullanılmamalıdır, çünkü yüzeylerle güçlü etkileşimlerle işaretlenmiş doğal yapışkan hücreler olan makrofajlar daha sonra tabaktan kolayca ayrılmayacaktır. Genellikle, bir fareden (iki uyluk kemiği) alınan hücre progenitörleri 10 kültür kabına tohumlanabilir. Hücre progenitörleri, kuluçka günü 7'den 10'a kadar kullanılabilen makrofajlara dönüşecektir. Olgunlaşma onayı, makrofajların morfolojisindeki değişikliklerle tanımlanır. Olgun makrofajlar yapışıktır ve farklı yönlerde psödopodia emisyonu ile açıklanan heterojen morfoloji gösterir. Bu olgun hücrelerin örnekleri temsili sonuçlarda gösterilmiştir.

5. Makrofajların toplanması

1. Süpernatanları tüm kültür kaplarından atın.
2. Her kültür kabını 10 mL ılık (37 °C) steril Mg²⁺ ve Ca²⁺ serbest PBS ile yıkayın.
3. Çözeltiyi her tabaktan atın.
4. Enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonunu 37 °C'ye ısıtın ve her yemeğe 3 mL ekleyin. 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde 10 dakika inkübe edin. Makrofajların kültür kaplarından ayrılıp ayrılmadığını görselleştirmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
   NOT: Doku kültürü ile muamele edilmemiş plastik plakaların kullanılması, hücrelerin kolayca ayrışmasına izin vermeli ve hücrelerin plakadan kazınması ihtiyacını ortadan kaldırmalıdır.
5. Bulaşıkları serolojik bir pipet kullanarak enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonu ile tekrar tekrar yıkayın ve tüm makrofajların tabaktan ayrıldığını doğrulamak için dairesel hareketler gerçekleştirin.
6. Tüm kültür kaplarının çözeltisini konik 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
7. Boş kültür kaplarına 10 mL steril önceden ısıtılmış PBS ekleyin ve adım 5.4'teki gibi ilerleyin. Bu prosedür adım 5.4'ün bir tekrarıdır ve tüm makrofajların toplanmasını garanti etmeyi amaçlar.
8. 300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
9. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL DMEM / F12-10 ile yeniden süspanse edin. Hücrelere zarar vermemek için pipeti kullanarak yavaş ve dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı homojenize edin.
10. Hemositometreyi kullanarak hücreleri saymak için 10 μL Tripan Mavisi ile seyreltilmiş 10 μL makrofaj çözeltisinden oluşan bir alikot hazırlayın.
    NOT: 7. günde, her çanak yaklaşık 2 x 10⁶ makrofaj üretecektir. Bu, bir farenin on plakada hasat edildiğinde yaklaşık 2 x 10⁷ birincil makrofaj üretebileceği anlamına gelir. M-CSF sadece makrofajların olgunlaşmasını sağladığından, prosedür esasen sadece makrofajlardan oluşan ve diğer kirletici lökositlerden arınmış bir hücre popülasyonunu garanti eder¹⁶.

Makrofajlar, özel fizyolojik özelliklere sahip büyük ve yapışık hücrelerdir. Cam ve plastiğe yapışma kabiliyeti nedeniyle kültürde çeşitli morfolojik sunumlar gösterirler ve tipik yayılma morfolojileri sitoplazmik uzantıların emisyonu ile ilgilidir (Şekil 1). Kemik iliği progenitörleri, L-929 hücre süpernatantından M-CSF'ye maruz kaldıklarında ve olgun makrofajlara dönüşümü başlattıklarında, Petri plakasına yapışırlar.

Şekil 2 , kemik iliği progenitörlerinin olgun makrofajlara dönüşümünün kinetiğini göstermektedir. 3. günde, çoğu az sayıda zar çıkıntısı ile tipik bir yuvarlak şekilli morfoloji gösteren birkaç olgunlaşmamış makrofaj ortaya çıkar (Şekil 3). Tüm süreç boyunca dönüşmelerine rağmen, mevcut protokolün maksimum verimliliğini garanti etmek için yeterli sayı ve olgunluğa ulaşmak için genellikle 7 gün gereklidir.

Ek olarak, makrofajlar, büyük miktarlarda antijenik veya antijenik olmayan partikülleri fagositize edebilen fagositlerdir (makro = büyük; fagos = yemek). Fenotipik olarak, yüzey molekülleri F4/80 ve CD11b'nin ekspresyonu ile karakterize edilirler. Akış sitometrisi ile yapılan analiz, mevcut protokol yoluyla elde edilen makrofajların boyut ve taneciklik açısından homojen bir popülasyonu temsil ettiğini göstermektedir (Şekil 4). Ayrıca, popülasyonun 0'ü F4/80 ve CD11b'yi eksprese ederek tek, iyi tanımlanmış bir hücre popülasyonu oluşturdu. Ayrıca, Leishmania majör parazitlerinin fagositoz analizi, fagositoz için muazzam bir kapasite gösterdi ve bunların olgun ve iyi diferansiye makrofajlar olduğunu kanıtladı (Şekil 5).

Bu çalışmada gösterilen mikroskobik veriler, Görüntü Elde Etme ve İşleme Merkezi'nde (CAPI-ICB/UFMG) floresan ve faz kontrast mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir.

Şekil 1: Kemik iliği progenitörlerinden türetilen, plakaya yapışırken farklı morfolojiler gösteren makrofajların kültürü, 5. günde. Makrofajlar, hareket etmelerine ve fagositleşmelerine izin veren uzun sitoplazmik uzantılar yayarlar. Parlaklık ve kontrast, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) 20x filtresi kullanılarak görüntüler alındıktan sonra ayarlandı. Çubuk = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 1., 3., 5. ve 7. günlerde kemik iliği progenitörlerinden olgun makrofajlara dönüşüm kinetiği. Parlaklık ve kontrast, bir DIC 20x filtresi kullanılarak görüntüler alındıktan sonra ayarlandı. Çubuk = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 3. günde, az sayıda membran çıkıntısı olan tipik yuvarlak şekilli bir morfolojiye sahip, hafif yapışık olgunlaşmamış makrofajların varlığı. Parlaklık ve kontrast, bir DIC 20x filtresi kullanılarak görüntüler alındıktan sonra ayarlandı. Çubuk = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kemik iliği kaynaklı makrofajların akış sitometrisi analizi. Makrofajlar çanak plakalardan (hücre sıyırıcı) ayrıldı ve anti-F4/80 FITC ve anti-CD11b PE-Cy7 ile boyandı. (A) Hücrelerin boyut ve tanecikliğe dayalı yönü (FSC x SSC). (B) F4/80 ve CD11b hücre belirteçlerinin ifadesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Leishmania majör parazitlerinin fagositozu sonrası floresan mikroskobu analizi. Makrofajlar plakalardan ayrıldı ve Leishmania majör parazitlerinin eklendiği yuvarlak cam lameller üzerine ekildi. Şekil, makrofajların içindeki fagosite uğramış parazitleri göstermektedir. Leishmania majör parazitleri FITC anti-Leishmania antikorları ile boyandı ve hücre çekirdekleri (makrofajlar ve Leishmania majör) propidyum iyodür ile karşı boyandı. (A) 20 kat; (B) 40x. Çubuk = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.