Yöntem makalesi

Sivrisinek Biyolojisi Çalışmasında Yeni Metodolojik Perspektifler

2.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64602

⸱

11 Ağustos 2022

 , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, 2Department of Entomology & Nematology, Florida Medical Entomology Laboratory, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

Bui, M., Li, M., Raban, R.R., Liu, N., Akbari, O.S. Culex quinquefasciatus'ta verimli bölgeye özgü mutajenez için embriyo mikroenjeksiyon teknikleri. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (159), e61375 (2020).

Carballar-Lejarazú, R., Pham, T.B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A.A. Genetiği değiştirilmiş anofelin sivrisineklerinin Küçük Kafes laboratuvar denemeleri. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), e62588 (2021a).

Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T.B., James, A.A. Anopheles gambiae embriyoları için mikroenjeksiyon yöntemi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (173), e62591(2021b).

Chen, T.Y. ve diğerleri. Yeni nesil dizileme için manyetik boncuk bazlı bir sivrisinek DNA ekstraksiyon protokolü. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (170), e62354 (2021).

Grigsby, A., Kelly, B.J., Sanscrainte, N.D., Becnel, J.J., Short, S.M. Aedes aegypti sivrisineklerinde mikrosporidian parazit Edhazardia aedis'in yayılması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (162), e61574 (2020).

Jensen, B.M. ve diğerleri. Sivrisinekler ve meyve sinekleri için insektisit toksisitesini ölçmek için topikal uygulama biyo-tahlili. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (179), e63391 (2022).

Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T.M., Duvall, L.B. Aedes aegypti sivrisineklerinde hayvan kaynaklı kan ve yapay yemeklerin beslenmesi ve miktarının belirlenmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (164), e61835 (2020).

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J.P.V. Yetişkin sivrisinekte nöropeptitlerin ve boşaltım sisteminin diğer düzenleyicilerinin aktivitesinin incelenmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (174), e61849 (2021).

Liu, X. ve diğerleri. Antibiyotikle tedavi edilen sivrisineklerle yapılan bakteriyel oral beslenme testi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (163), e61341 (2020).

Meuti, M.E., Harrell, R. CRISPR/Cas9 kullanarak boş mutasyonlar oluşturmak için Culex sivrisineklerinin embriyolarının hazırlanması ve enjekte edilmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (163), e61651 (2020).

Tripathi, A.K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametosit kültürü ve yapay membran beslemesi yoluyla sivrisinek enfeksiyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (161), e61426 (2020).

Tsujimoto, H., Adelman, Z.N. 24 kuyucuklu doku kültürü plakası (EAgaL plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için geliştirilmiş doğurganlık ve doğurganlık testi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), e61232 (2021).

Wang, X. ve diğerleri. Xenopus Oositlerinde Aedes aegypti koku reseptörlerinin insan kokularına heterolog ekspresyonu ve fonksiyonel analizi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), e61813 (2021).

Editöryal

Sivrisineklerle bulaşan patojenler her yıl milyonlarca insan enfeksiyonundan sorumludur. Sıtma ve dang humması 1,2,3 gibi bu patojenlerin neden olduğu hastalıklarla savaşmak için araştırmacılar sivrisinek biyolojisi anlayışını güçlendiriyor ve yeni sivrisinek kontrol araçları geliştiriyorlar 4,5,6. Bu koleksiyon, sivrisinek biyolojisi, sivrisinek kontrolü, patojen enfeksiyonu ve sivrisinek transgenezini içeren metodolojik ilerlemeler yoluyla bu alanlarda yeni araştırmaları kolaylaştırır.

Jensen ve ark.7 sivrisineklerde ve meyve sineklerinde insektisitlerin doğrudan topikal uygulamasını ve böcek kütlesine dayalı bir dozaj belirleme prosedürünü içeren bir insektisit aktivite testini tanımlamaktadır. Makale, çalışma alanının ve kimyasal solüsyonların hazırlanmasını, böcek ilacı uygulamasını ve böceklerin maruz kaldıktan sonra hayatta kalmasının test edilmesini kapsar. Topikal uygulama metodolojisi, tanımlanmış insektisit dozlarına tutarlı bir şekilde maruz kalmayı kolaylaştırır, türler arası ve tahliller arası değişkenliği azaltır, bu da haşere böcek kontrolü veya sivrisinek popülasyonlarında insektisit direncini araştıranlar için büyük ilgi görecektir.

Chen ve ark.8 , manyetik DNA bağlayıcı boncuklar kullanılarak tüm genom dizilimi için sivrisinek örneklerinin basit, izlenebilir, yüksek verimli bir DNA ekstraksiyon protokolünü vurgulamaktadır. Protokol, numune homojenizasyonunu ve komple ekstraksiyon sürecini içerir. Bu yaklaşım, kaynakları sınırlı laboratuvarlar için uygun olan yüksek verimli, ancak yüksek oranda tekrarlanabilir bir DNA ekstraksiyon yöntemini teşvik eder. Sivrisinek genomik uygulamalarıyla, özellikle saha sivrisinek DNA preparatlarıyla çalışanların ilgisini çekecektir.

Koleksiyondaki birkaç makale, sivrisinek biyolojisi çalışmasıyla bağlantılı metodolojik gelişmeleri kapsamaktadır. Jové ve ark.9, yapay diyetle beslenen sivrisinekler için yemek hacimlerinin yüksek verimli, floresan bazlı nicelleştirilmesini tanımlamaktadır. Yemek hazırlamayı, floresein boyasının eklenmesini, yemeğin düşük maliyetli bir besleme sisteminde dağıtılmasını ve ardından beslenen sivrisinek örneklerinde yemek hacminin ölçülmesini kapsar. Açıklanan metodoloji, yapay diyetler, kan, şeker veya nektar içeren beslenme tahlilleri ile ilgili olarak sivrisinek beslemesinin etkili bir şekilde değerlendirilmesine izin verir. Böcek besleme davranışını inceleyenler için değerli olacaktır. Tsujimoto ve Adelman10, agaroz dolgulu 24 oyuklu hücre kültürü plakaları kullanarak sivrisinek doğurganlığını ve doğurganlığını test etmek için yeni bir tekniğin ana hatlarını çiziyor. Protokol, plaka hazırlama, sivrisinek besleme, yumurtlama, plaka görüntüleme ve veri toplamayı detaylandırır. Geleneksel metodolojiye kıyasla zamanı, alanı ve emeği azaltır ve sivrisinek uygunluğunu veya sivrisinek üremesinin moleküler temelini değerlendiren araştırmacıların ilgisini çekecektir. Lajevardi ve ark.11 sivrisinek boşaltım dokularında iyon taşınmasını ve sıvı sekresyonunu incelemek için Ramsay testini kullanmaktadır. Protokol, Ramsay testini az miktarda böcek dokusu ile kullanım için uyarlar ve ayrıca elektrotların hazırlanması ve kalibre edilmesini, sivrisinek dokularının test için hazırlanmasını ve malpighian tübüllerinden ve sindirim dokularından okumaların kaydedilmesini tartışır. Bu protokol, sindirim veya boşaltım sistemleri ve böcek dokularının nöropeptit/endokrin regülasyonu ile çalışanların ilgisini çekecektir. Wang ve ark.12, insan kokularına tepkilerini değerlendirmek için Xenopus oositlerindeki Ae. aegypti koku reseptörlerinin heterolog ekspresyonunu tanımlamaktadır. Koku reseptör genlerinin klonlanmasını, cRNA sentezini, Xenopus oositlerinin diseksiyonunu ve izolasyonunu, genlerin heterolog ekspresyonunu ve ardından reseptör aktivitesini ölçmek için tek sensillum kaydını kapsar. Bu protokol, sivrisinek davranışı araştırmalarıyla bağlantılı potansiyel uygulamalarla sivrisinek koku alma eyleminin genetik ve işlevsel temelini değerlendirmek için benzersiz bir sistem sağlar.

Koleksiyondaki dört makale, genetiği değiştirilmiş sivrisinekleri ve transgenez sürecini tartışıyor. Carballar-Lejarazú ve ark.13, embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla transgenik Anopheles gambiae sivrisinekleri üretmek için ayrıntılı prosedürleri özetlerken, Bui ve ark.14, CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme için Culex quinquefasciatus embriyolarının mikroenjeksiyonunu göstermektedir. İlki, insan sıtma parazitlerinin önemli bir vektörüdür, ikincisi ise Batı Nil virüsü de dahil olmak üzere arbovirüslerin önemli bir vektörüdür ve transgenez bağlamında yeterince çalışılmamıştır. Bu protokoller, iğnelerin çekilmesini ve yüklenmesini, yumurta hazırlamayı ve hizalamayı, ardından enjeksiyonu ve embriyo geri kazanımını ve transgen fenotiplerinin taranmasını kapsar. An. gambiae protokolü, yumurtlama ve yumurta toplama prosedürlerini detaylandırır ve başarılı enjeksiyonları görsel olarak gösterir. Cx. Quinquefasciatus protokolü, iğne çekme için belirli parametreleri ve mutajenez oranlarını artırmak için ipuçlarını ana hatlarıyla belirtir. Meuti ve Harrell15'in makalesi, Culex pipiens'teki transgeneze, özellikle de enjeksiyon işlemine derinlemesine bir odaklanma sağlar. Video, tüm enjeksiyon sürecini derinlemesine göstermektedir; İğnenin doldurulması ve takılması, yumurtaların ve enjektörün konumlandırılması ve ayrıca başarılı bir şekilde nasıl enjekte edileceğine ilişkin ayrıntıların ana hatlarını çizer. Enjeksiyon süreci hakkında titiz teknik talimatlar ve sorun giderme sağlar ve yumurtadan çıkma oranını ve larva uygunluğunu en üst düzeye çıkarmak için ipuçları sunar. Bu üç makale, yeni vektör kontrol stratejileri geliştirmek isteyenlerin yanı sıra Anofel ve Culex genetiği ve konakçı-patojen etkileşimlerini inceleyenlerin ilgisini çekecektir. Carballar-Lejarazú ve ark.16, gen tahrik sistemlerinin farklı koşullar altında belirli genleri saf sivrisinek popülasyonlarına yayıp yayamayacağını değerlendirmek için küçük kafesli denemeler yürütme sürecini tanımlamaktadır. Protokol, su baskınlarına maruz kalmayan tahriksiz salınım denemelerinin ve örtüşen veya örtüşmeyen sivrisinek nesilleri ile gen tahrikli denemelerin mekaniğini inceliyor. Vahşi tip-transgenik ekleme oranları, tarama süreçleri ve deneysel parametrelerin uygunluk testlerini içerecek şekilde uyarlanması veya gen tahrikli alel yayılımının modellenmesi hakkında kesin ayrıntılar sağlar. Bu protokol, vektör kontrol alanında yeni gen sürücü sistemleri geliştiren ve gen sürücü etkinliğini inceleyen araştırmacılara fayda sağlayacaktır.

Koleksiyondaki son üç makale, patojen kültürü ve maruziyetini tartışıyor. Liu ve ark.17, mikrobiyotanın oynadığı biyolojik rollerin anlaşılmasına yardımcı olmak için antibiyotik tedavisinden sonra bakterilerin yetişkin sivrisineklere yeniden verilmesine yönelik protokolü göstermektedir. Bakterilerin kültürlenmesi ve izolasyonu, antibiyotik tedavisi ve bakteriyel beslenme tahlillerini kapsar. Protokol, karmaşık, çok yönlü bir prosedürün iyi bir sentezini sağlar. Sivrisinek mikrobiyotası çalışmaları veya yetişkin gnotobiyotik sivrisinekler geliştirmekle ilgilenenler için faydalı olacaktır. Grigsby ve ark.18, Edhazardia aedis mikrosporidian parazitinin kültürlenmesinin standart Aedes aegypti yetiştiriciliğine entegrasyonu için protokolü vurgulamaktadır. Sivrisineklerin yeniden enfeksiyonundan ve enfekte sivrisinek yumurtalarının bakımından önce bulaşıcı sporların izolasyonunu, tanımlanmasını ve sayımını detaylandırır. Sporları tespit etme ve sivrisinek kuluçkalarını spor hazırlığı ile koordine etme konusunda sorun giderme önerileri verir. Bu protokol, deneysel amaçlar için mikrosporidian parazitleri kültürlemek isteyenlerin ve parazit enfeksiyonunun sivrisinek bağışıklığı veya vektörel kapasite üzerindeki etkisini inceleyenlerin ilgisini çekecektir. Tripathi ve ark.19, Plasmodium falciparum gametositlerinin kültürlenmesi, membran-cam besleyici sistemi aracılığıyla Anofel sivrisineklerinin enfeksiyonlarının gerçekleştirilmesi ve ookist ve sporozoitlerin sayılması için protokolü detaylandırmaktadır. P. falciparum kültürü için elde edilmesi zor olabilen temel bir protokoldür. Protokol, sivrisineklerde Plasmodium enfeksiyonunu ve bulaşmasını araştıranlar, bulaşma engelleme araçları da dahil olmak üzere sıtmaya karşı stratejiler geliştirmek isteyenler ve transgenik hatlar ve gen tahrik stratejileri de dahil olmak üzere An. gambiae popülasyonlarının vektör yeterliliğini inceleyenler için oldukça değerli olacaktır.

Makale koleksiyonu, sivrisinek ve sivrisinek kaynaklı patojen kontrolünün geleceği için önemli olan birçok araştırma konusunu ele almaktadır. Sivrisineklerin pestisitlere karşı direncini anlamak, mevcut kontrol programlarının başarısını yansıttığı için kritik öneme sahiptir; Ayrıca, direncin tespit edilmesi, kontrol stratejilerinde değişiklik yapılması gerektiğinin bir işareti olabilir. Sivrisinek transgenezi, genom düzenleme ve gen sürücüsü dahil olmak üzere genetik mühendisliği teknolojileri, yüksek izlenebilirlikleri ve uyarlanabilirlikleri nedeniyle önümüzdeki on yıl ve sonrasında sivrisinek kontrolünde muhtemelen önemli bir rol oynayacaktır. Özellikle popülasyon genomiği, konakçı-patojen etkileşimleri, sivrisinek davranışı ve temel biyolojik özelliklerin moleküler temeli konularında sivrisinek biyolojisine ilişkin gelişmiş bilgi, yeni kontrol araçları geliştirmek için kullanılabilecek değerli bilgiler sağlayacaktır. Örneğin, koku alma ile ilgili genlerin tanımlanması, araştırmacıların yeni kovucular geliştirmesine yardımcı olabilirken, konakçı-patojen etkileşimlerinde yer alan genlerin tanımlanması, sonunda anti-patojenik efektörler taşıyan transgenik sivrisineklerin gelişmesine yol açabilir. Bu koleksiyon tüm bu konulara değiniyor ve dünyanın dört bir yanından vektör biyologlarının elinde, burada açıklanan yöntemler sivrisinek biyolojisinin birçok yönüne ilişkin yeni ve benzersiz içgörüleri kolaylaştırmaya yardımcı olacak. Gelecek için önemli bir zorluk, yeni kontrol stratejileri üretmek veya mevcut stratejileri tamamlamak veya optimize etmek için bu konu alanlarında üretilen bilgilerden yararlanmak olacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu yayın, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, EPC'ye 1026692 Hatch projesi tarafından desteklenmiştir.

Kaynaklar

  1. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
  2. Bhutta, Z. A., Sommerfeld, J., Lassi, Z. S., Salam, R. A., Das, J. K. Global burden, distribution, and interventions for infectious diseases of poverty. Infectious Diseases of Poverty. 3, 21(2014).
  3. Caminade, C., McIntyre, K. M., Jones, A. E. Impact of recent and future climate change on vector-borne diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1436 (1), 157-173 (2019).
  4. Caragata, E. P., et al. Prospects and pitfalls: Next-Generation tools to control mosquito-transmitted disease. Annual Review of Microbiology. 74, 455-475 (2020).
  5. Jones, R. T., Ant, T. H., Cameron, M. M., Logan, J. G. Novel control strategies for mosquito-borne diseases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 376 (1818), 20190802(2021).
  6. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (1), 0007831(2020).
  7. Jensen, B. M., et al. Topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies. Journal of Visualized Experiments. (179), e63391(2022).
  8. Chen, T. Y., et al. A magnetic-bead-based mosquito DNA extraction protocol for next-generation sequencing. Journal of Visualized Experiments. (170), e62354(2021).
  9. Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (164), e61835(2020).
  10. Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved fecundity and fertility assay for Aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (EAgaL plates). Journal of Visualized Experiments. (171), e61232(2021).
  11. Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. V. Studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito. Journal of Visualized Experiments. (174), e61849(2021).
  12. Wang, X., et al. Heterologous expression and functional analysis of Aedes aegypti odorant receptors to human odors in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (172), e61813(2021).
  13. Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection method for Anopheles gambiae embryos. Journal of Visualized Experiments. (173), e62591(2021).
  14. Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus. Journal of Visualized Experiments. (159), e61375(2020).
  15. Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and injecting embryos of Culex mosquitoes to generate null mutations using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (163), e61651(2020).
  16. Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Small-Cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (171), e62588(2021).
  17. Liu, X., et al. A bacterial oral feeding assay with antibiotic-Tteated mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61341(2020).
  18. Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the microsporidian parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (162), e61574(2020).
  19. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Culex QuinquefasciatusAnopheles GambiaeGenetically-engineered MosquitoesMicroinjection TechniquesDNA Extraction ProtocolInsecticide Toxicity BioassayAedes AegyptiNeuropeptides RegulationCRISPR/Cas9Plasmodium FalciparumArtificial Membrane Feeding
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.