Yöntem makalesi

Yenidoğan Farelerden İnterskapular Yağ Dokusunun Stromal Vasküler Fraksiyonundan Kahverengi Adipositlerin Farklılaşması ve Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 Şubat 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Preadipositler, yenidoğan farelerden alınan interskapular kahverengi yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan izole edilir ve lipid damlacıkları biriktiren, moleküler belirteçleri eksprese eden ve olgun kahverengi adipositlerin mitokondriyal morfolojisini gösteren hücrelere farklılaşır. Bu hücreler ayrıca immünofloresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kahverengi yağ dokusu (BAT) sadece memelilerde bulunur ve termojenik bir işleve sahiptir. Kahverengi adipositler, çoklu lipid damlacıklarına sahip çok gözlü bir sitoplazma, merkezi bir çekirdek, yüksek bir mitokondriyal içerik ve ayrılmayan protein 1'in (UCP1) ekspresyonu ile karakterize edilir. BAT, metabolik enerjiyi ısı olarak dağıtma kabiliyeti nedeniyle obezite ve buna bağlı metabolik bozukluklar için potansiyel bir terapötik hedef olarak önerilmiştir. BAT fonksiyonunu ve regülasyonunu araştırmak için kahverengi adiposit kültürü vazgeçilmezdir. Mevcut protokol, yeni doğan farelerden kahverengi adipositlerin kültürlenmesi için doku işlemeyi ve hücre farklılaşmasını optimize eder. Ek olarak, hem konfokal immünofloresan hem de transmisyon elektron mikroskobu ile farklılaşmış adipositlerin görüntülenmesi için prosedürler gösterilmiştir. Burada açıklanan tekniklerle farklılaştırılan kahverengi adipositlerde, yüksek UCP1 seviyeleri, artmış mitokondriyal kütle ve lipid damlacıkları ile mitokondri arasındaki çok yakın fiziksel temas dahil olmak üzere klasik BAT'ın ana tanımlayıcı özellikleri korunur ve bu da bu yöntemi BAT çalışmaları için değerli bir araç haline getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyaz ve kahverengi yağ dokusu anatomik konumları, hücresel kökenleri, fonksiyonları, morfolojileri ve toplam kütleleri bakımından farklılık gösterir. Beyaz yağ dokusu (WAT), vücudun ana fizyolojik enerji deposudur ve hücresel hacimlerinin çoğunu kaplayan tek bir dev lipid damlacığına sahip oldukça özelleşmiş hücrelerde büyük miktarlarda triaçilgliserol (TAG) depolar1. TAG lipoliz, oruç tutma veya diğer negatif enerji dengesi durumlarında enerji taleplerini karşılamak için sistemik dolaşıma giren serbest yağ asitlerini serbest bırakır. Ek olarak, WAT, metabolik, bağışıklık ve üreme düzenleyici işlevlere sahip olan sırasıyla adipokinler ve lipokinler olarak adlandırılan protein ve lipid ürünlerini salgılar ve böylece WAT'ı vücuttaki en büyük endokrin doku yapar2.

Kahverengi yağ dokusu (BAT), ana fizyolojik işlevi hipotermiyi önlemek için titremeyen termojenez olan çok daha küçük bir organdır. Farelerde ve yeni doğan insanlarda BAT, interskapular boşlukta bulunan iyi tanımlanmış bir organdır. Yetişkin insanlarda interskapular BAT (iBAT) yoktur; bununla birlikte, aksi takdirde çoğunlukla WAT içeren depolara entegre edilmiş kahverengi adiposit benzeri hücre kümeleri geliştirirler. Bu "beyaz-kahverengi" (brite) adipositler, klasik iBAT adipositleri ile morfolojik ve moleküler özellikleri paylaşır, ancak farklı bir hücresel kökene sahiptirler 3,4.

Beyaz adipositlerin aksine, kahverengi adipositler çok sayıda küçük lipid damlacıklarına ve bol miktarda mitokondriye sahiptir5. Ayrılma proteini 1 (UCP1, termojenin olarak da bilinir), kahverengi ve brite adipositler tarafından benzersiz bir şekilde eksprese edilir ve iç mitokondriyal zarda (IMM) proton sızıntısına aracılık eder, böylece elektron taşınmasını ATP sentezinden ayırır ve ısı üretir. BAT'taki titremeyen termojenez, soğuk stimülasyonuna yanıt olarak BAT'taki sempatik terminallerdensalınan norepinefrin (NE) tarafından aktive edilir 6. NE, kahverengi adipositlerin yüzeyindeki beta-adrenoseptörlere (çoğunlukla beta 3) bağlanır ve hücre içi cAMP aracılı bir sinyal kaskadını tetikler. Bu, TAG lipoliz, mitokondriyal yağ asitlerinin beta oksidasyonu ve UCP1 aktivasyonu3 üzerine ısı üretimi ile sonuçlanır. Kahverengi adipositlerde lipid damlacıkları ve mitokondri arasındaki yakın fonksiyonel ilişki, geniş ve çok sıkı fiziksel temasa sahip alanlarda bu organeller arasındaki etkileşim gibi yapısal paralelliklere sahiptir 7,8.

iBAT bol miktarda kan damarına ve sempatik terminallere sahiptir9. Bu yapılar, preadipositler, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve hücre dışı matriks molekülleri ile birlikte adipoz stromal vasküler fraksiyonu (SVF) oluşturur10. Preadipositlerden 11,12,13,14,15 olgun adipositler ürettiği birçok protokol bildirilmiştir (Ek Tablo 1); Bununla birlikte, doku işlemede ve farklılaşma kültürü ortamının bileşiminde aşırı farklılıklar gösterirler. Burada açıklanan protokol, (1) anahtar adipojenik transkripsiyon faktörleri peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör gama (PPARγ) ve CCAAT/arttırıcı bağlayıcı protein alfa (C/EBPa) eksprese eden, (2) olgun adiposit belirteçleri perilipin1 (PLIN1) ve küme belirleyicisi 36'yı (CD36) eksprese eden, (3) bol miktarda lipid damlacıkları biriktiren, (4) yüksek mitokondriyal kütleye ve yüksek miktarda OXPHOS kompleksine sahip olan kahverengi adipositlerin verimli ve tekrarlanabilir farklılaşmasına izin verir, (5) yüksek UCP1 seviyeleri ile belirlenen termojenik potansiyele sahiptir ve (6) olgun kahverengi adipositlerin fenotipi ile ilişkili mitokondriyal morfolojik değişikliklere sahiptir. Bu metodoloji, jeneralize lipodistrofinin altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılır 15,16,17.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan prosedürleri, Pontificia Universidad Católica de Chile'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu çalışma için C57BL / 6J ve 129J suşlarının karışık bir arka planından türetilen her iki cinsiyetten P0.5 yenidoğan fareleri kullanıldı.

1. Doku ekstraksiyonu

  1. Çalışma tezgahını %70 etanol solüsyonu ile temizleyin ve dezenfekte edin ve steril cerrahi malzeme kullanın.
  2. P0.5 yenidoğan yavrularına, kurumsal olarak onaylanmış protokolü takiben cerrahi makasla dekapitasyon yoluyla ötenazi yapın.
  3. Fareyi yüzüstü pozisyonda (aşağı bakacak şekilde) yerleştirin ve keskin bir makas kullanarak hayvanın sırtının orta seviyesindeki deride 1 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Cildi dikkatlice çıkarın.
    NOT: Bu adım kritiktir, çünkü cilt iyi bir şekilde çıkarılmazsa iBAT'ı yırtabilir ve zarar verebilir ve SVF'nin en iyi şekilde hazırlanmasını engelleyebilir.
  4. Küçük bir makas kullanarak iBAT'ı karkastan cerrahi olarak ayırın.
    NOT: iBAT, bağımsız olarak çıkarılabilen iki yağlı lobül olarak görselleştirilmiştir.
  5. Lobları bağımsız olarak çıkarmak için kavisli uçlu pense kullanarak her iki iBAT lobunu da hasat edin.
  6. İki lobu oda sıcaklığında 1,5 mL steril PBS içeren plastik bir tüpe yerleştirin. Gerekli tüm yavrular için doku ekstraksiyonu tamamlanana kadar dokuları kendi tüplerinde tutun.

2. Doku sindirimi

  1. Aliquot 300 μL kollajenaz tip II sindirim tamponu (tamponda %0.2 tip II kollajenaz [25 mM KHCO3, 1.2 mMMgS4, 120 mM NaCl, 5 mM glikoz, 12 mM KH2PO4, 4.8 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, %2.5 BSA ve pH 7.4'te %1 penisilin / streptomisin]) (Tablo 1) bir biyogüvenlik kabininde 1.5 mL'lik tüplerde.
    NOT: Çıkarılacak tek tek doku sayısı için yeterli tüp hazırlayın. Bu çalışmada, yedi yavrudan oluşan bir çöpe karşılık gelen yedi tüp kullanılmıştır.
  2. Tezgaha geçin ve hücre dışı matrisi bozmak için iBAT loblarını kollajenaz tip II sindirim tamponuna yerleştirin.
  3. iBAT dokularını 37 °C'de 45 dakika boyunca 800 rpm'de sürekli hafifçe çalkalayarak inkübe edin (Şekil 1).

3. Doku işleme

NOT: Sindirimden sonra, aşağıdaki tüm adımları sınıf II laminer akışlı doku kültürü başlığında gerçekleştirin.

  1. Her bir numune için iki set 1,5 mL plastik tüp hazırlayın ve etiketleyin.
  2. Bir P1.000 mikropipet ve filtrelenmiş uçlar kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek kollajenaz tip II sindirim tamponundaki doku süspansiyonunu mekanik olarak bozun. Her örnek için yeni bir uç kullanın.
    NOT: Bu kritik bir adımdır. Makroskopik homojenizasyon tamamlanana kadar dokuyu uç ve pipetle yukarı ve aşağı mekanik olarak ayırdığınızdan emin olun.
  3. Ayrıştırılmış dokuları ayrı ayrı 100 μm hücre süzgeçlerinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeni 1.5 mL'lik tüplere geçirin.
  4. Filtrelenmiş doku örneklerine 500 μL ACK tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, tüpleri 4-5 kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin.
    NOT: İlgilenilen hücrelere zarar verebileceğinden kuluçka süresini aşmayın.
  5. Doku örneklerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
  6. Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve peleti 1 mL kültür ortamında (% 10 FBS ile% 1 antibiyotik antimikotik, pH 7.2 ile DMEM-F12) yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  7. Süspansiyonları 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek bir P1.000 mikropipet ve filtrelenmiş uçlar kullanarak yeni 1,5 mL'lik tüplere geçirin.
  8. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Pelet, preadiposit içeren SVF'ye karşılık gelir.
  9. Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve peleti pipetleme yoluyla 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin.
  10. 5 mL kültür ortamı ekleyerek her numune için 15 mL'lik bir tüp hazırlayın.
  11. Her bir yeniden süspanse edilmiş peleti, 5 mL kültür ortamı içeren karşılık gelen 15 mL tüpüne ekleyin. Hücre içeriğini karıştırmak için tüpü 4-5 kez ters çevirin.
  12. Her bir numuneyi, her bir oyuğa 1 mL süspansiyon ekleyerek 24 oyuklu bir kültür plakasının altı oyuğuna tohumlayın (Şekil 1).

4. Stromal vasküler fraksiyon (SVF) kültürü

  1. Hücreler% 100 birleşmeye ulaşana kadar kültür ortamını her gün değiştirin.
    NOT: Bu süre zarfında, plastik olmayan yapışık hücreler çıkarılır ve bu da preadiposit içeren bir SVF ile zenginleştirilmiş bir birincil kültür ile sonuçlanır.
  2. Hücreler% 100 birleştiğinde, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 800 μL steril PBS ile yıkayın.
  3. Her oyuğa 150 μL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücrelerin ayrılması için kültür plakasını inkübatörde 3 dakika boyunca yerleştirin.
    NOT: Faz kontrast ışık mikroskobu kullanarak hücrelerin ayrıldığını doğrulayın.
  4. Her oyuğa 850 μL kültür ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin.
  5. Hücreleri adım 3.12'de ekilen altı kuyudan toplayın ve bunları 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. 6 mL kültür ortamı ekleyerek toplam hacmi 12 mL'ye çıkarın. İçeriği karıştırmak için tüpü 4-5 kez ters çevirin.
  7. Numunenin 1 mL'sini 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tohumlayın. Hücreler birleşene kadar kültür ortamını her gün değiştirin.
  8. Hücreler %100 birleştiğinde, adım 4.3'teki ile aynı inkübasyon koşullarını izleyerek 150 μL %0.25 tripsin-EDTA ile ayırın ve deney için gerekli olan kuyu yüzey alanına göre tohumlayın.
  9. 8. adımı izleyerek hücreleri sabitledikten sonra yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirin.
    NOT: Daha sonraki deneyler için 35.000 hücre/cm²'lik bir yoğunluk önerilir (protein ve toplam RNA ekstraksiyonu, 330.000 hücre [6 oyuklu bir plakanın bir oyuğu]; immünofloresan [IF], 10.500 hücre [96 oyuklu bir plakanın bir oyu]).

5. Adipojenik farklılaşma

  1. Hücreleri indüksiyon ortamı ile inkübe edin (% 10 FBS,% 1 antibiyotik antimikotik, pH 7.2, 500 nM deksametazon, 125 nM indometasin, 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin [IBMX], 5 μM rosiglitaz, 1 nM T3 ve 20 nM insülin ile DMEM-F12) 72 saat (0. gün ila 2. gün) (Şekil 2).
    NOT: Kültür ortamı iki günde bir değiştirilmelidir; Bu nedenle, ilk orta değişiklik, ilk indüksiyondan sonraki 2. günde gerçekleşmelidir.
  2. Bakım ortamına geçin (% 10 FBS,% 1 antibiyotik antimikotik, pH 7.2, 5 μM rosiglitazon, 1 nM T3 ve 20 nM insülin ile desteklenmiş DMEM-F12) (Tablo 1) 3. günde ve bu bakım ortamını 7. güne kadar koruyun (Şekil 2).
    NOT: Bakım ortamı 5. ve 7. günlerde değiştirilmelidir. Küçük lipid damlacıkları, farklılaşmanın 3. gününden itibaren faz kontrast mikroskobu ile görüntülenebilir. Büyük lipid damlacıkları, farklılaşmanın 7. gününde belirgindir. 7 günden daha uzun süren farklılaşma prosedürleri, muhtemelen lipid yüklü hücrelerin yüksek kaldırma kuvvetine bağlı olarak, ayrılma yoluyla hücre kaybına neden olur.

6. Hücresel homojenat hazırlama

  1. Farklılaşmanın 0. ve 7. günlerinde kültür ortamını çıkarın ve hücreleri steril PBS ile 3 kez yıkayın.
  2. Son temizlikten sonra, her kuyucuğa 1.3 mL steril PBS ekleyin.
    NOT: Son plaka temizlenene kadar hücreleri buzda tutun.
  3. Hücreleri, bir hücre sıyırıcı ile 6 oyuklu bir plakanın (~ 330.000 hücre) bir oyuğundan mekanik olarak hasat edin ve hücresel süspansiyonu 1.5 mL'lik bir tüpe koyun.
  4. Numuneleri 2.800 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. PBS'yi bir mikropipetle çıkarın ve tüpleri buz üzerinde tutun.
  6. Hücresel peleti proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile RIPA tamponunda yeniden süspanse edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Hücresel peleti parçalamak için 70-80 μL yeterlidir.
  7. Numuneleri 21.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı dikkatlice 1.5 mL'lik bir tüpe çıkarın ve peleti atın.
    NOT: Süpernatant, hücresel homojenatı temsil eder.
  9. Toplam proteinin18,19 kolorimetrik tespiti ve kantitasyonu için bikinkoninik asit (BCA) kullanarak hücresel homojenatın protein konsantrasyonunu belirleyin.

7. Batı lekeleme

  1. 30 μg hücresel homojenat hazırlayın (adım 6.8'den itibaren) ve piyasada bulunan SDS-PAGE numune yükleme tamponunu ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Poliakrilamid jel elektroforezi-SDS20'de (PAGE-SDS) her proteinin moleküler ağırlığına göre çözün.
    NOT: PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 ve UCP1 için %10 PAGE-SDS, OXPHOS için %12 PAGE-SDS ve TOM20 için %15 PAGE-SDS kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
  3. Proteinleri 2 saat boyunca 350 mA'da PVDF membranına ( Malzeme Tablosuna bakınız) elektrotransfer edin.
    NOT: Buz kabı 1 saat sonra değiştirilmelidir. Tüm süreç boyunca, odayı buz üzerinde tutun.
  4. Antikorların veri sayfalarındaki önerileri izleyerek 2 saat boyunca Tris tamponlu salin (TBS)% 0.1 Tween 20 (TBS-T) içinde% 5 BSA veya yağsız süt ile membranları bloke edin.
  5. Birincil antikorlarla (bu çalışmada kullanılan antikorlar Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır) gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm antikorlar, bloke edici çözelti içinde 1: 1.000'e seyreltilmiştir.
  6. Membranları 3 kez% 0.1 TBS-T ile yıkayın ve yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikoru ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  7. Membranları% 0.1 ile 3 kez yıkayın. TBS-T'dir. 1x TBS ile son bir yıkama yapın. Membranları görselleştirmeye kadar 1x TBS'de saklayın. En fazla 1 saat saklanması tavsiye edilir.
  8. Membranları kemilüminesans20 veya tercih edilen başka bir yöntemle görselleştirin.

8. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek immünofloresan testini gerçekleştirin.
    1. Kahverengi preadipositlerin birincil kültürlerini P0.5 yenidoğan farelerden (adım 4.8'i izleyerek) optik tabanlı 96 oyuklu plakalarda tohumlayın ve ayırt edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. Hücreleri farklılaşmanın 0. ve 7. gününde% 4 PFA ile 20 dakika boyunca sabitleyin ve steril PBS ile 3 kez yıkayın.
    3. Hücreleri 15 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 3 balık jelatini ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile bloke edin.
    4. Steril PBS ile 3 kez yıkayın ve nemli bir odada gece boyunca 4 ° C'de% 1 BSA / PBS'de PLIN1 antikoru (1:400, Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
    5. Steril PBS ile 3 kez yıkayın ve florofor konjuge ikincil antikor ile 1: 1.000'de (% 1 BSA / PBS) ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    6. Çekirdekleri 1 μg/mL Hoechst 33342 ve lipid damlacıklarını 1 μg/mL BODIPY ile oda sıcaklığında 30 dakika boyayın .
      NOT: Floresan görüntüleri bir hücre görüntüleme sistemi kullanılarak elde edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Genel olarak, 20x büyütme ile iki ila üç kanalla kuyu başına 9 veya 16 fotoğraf elde edildi.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek transmisyon elektron mikroskobu yapın.
    1. Kahverengi preadipositleri 35 mm x 10 mm hücre kültürü kaplarında büyütün ve ayırt edin.
    2. Farklılaşmanın 0. ve 7. günlerinde, ortamı çıkarın ve hücreleri 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda, pH 7.0'da% 2.5 glutaraldehit ile 1 saat sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. Hücreleri 10 dakika boyunca 0.05 M sodyum kakodilat tamponu ile 3 kez yıkayın ve 15 dakika boyunca% 1 sulu osmiyum tetroksit ile muamele edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    4. Hücreleri 3 kez 5 dakika boyunca bi-distile su ile yıkayın ve 15 dakika boyunca% 1 sulu uranil asetat ile muamele edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    5. Hücreleri her seferinde 5 dakika boyunca %30, %50, %70, %95 ve %100 etanol gradyanı ile kurutun.
    6. Hücreleri 30 dakika boyunca 1: 1 epon / etanol ve daha sonra 1 saat boyunca epon içine önceden gömün ( Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Hücrelerin dahil edilmesi, tüm hücre kültürü tek tabakasını kaplamak için taze epon eklenerek doğrudan tabağa yerleştirilir. Epon'un 60 °C'de 24 saat fırında polimerize olmasına izin verin.
    7. Hücre kültürü kabını 2 dakika boyunca sıvı nitrojene batırın ve ardından plastik inklüzyonu gevşetmek için pense kullanarak kırın.
    8. Bir ultramikrotomda yüzeye paralel ince kesimler (80 nm) elde etmek için inklüzyon segmentlerini hücrelerle birlikte bir reçine bloğuna yapıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).
    9. Reynolds ve ark.21'e göre, kesikleri %1 sulu uranil asetat ile 4 dakika ve kurşun sitrat ile 5 dakika boyayın.
    10. Izgaraları bir elektron mikroskobunda görselleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipogenez, hem kahverengi adiposit oluşumunu indükleyen anahtar proteinlerin ekspresyonundan hem de işleyişinden sorumlu olan bir transkripsiyon faktörleri ağı tarafından düzenlenir22, PPARγ ve C/EBPα 23,24,25 gibi klasik adipojenik düzenleyiciler ve ayrıca olgun adipositlerinbelirteçleri 26,27. Termojenik kahverengi adipoz fenotipinin elde edilm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, olgun kahverengi adipositlerin moleküler ve morfolojik özelliklerine sahip hücreler üretmek için basit ve tekrarlanabilir iki fazlı bir farklılaşma prosedürüdür (Şekil 2). iBAT'ın cerrahi olarak toplanması ilk kritik adımdır, çünkü doku yırtılması başlangıç materyalinin canlılığını ciddi şekilde sınırlar. Doku işleme de önemlidir, çünkü kalıntı içermeyen homojen bir hücre süspansiyonu, kültürlenebilecek SVF miktarını büyük ölçüde artırır. Mevcut çalışmada, sadece 100 μm hücr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman, FONDECYT (1181214 ve 1221146) ve Anillos (ACT210039) tarafından VC ve doktora bursları olan ANID'ye, AMF'ye 21171743 ve FS'ye ANID 21150665'a sağlandı. Alejandro Munizaga'ya numunelerin işlenmesindeki yardımı ve transmisyon elektron mikroskobu için teknik tavsiyeleri için teşekkür ederiz. İllüstrasyonlar BioRender kullanılarak üretildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x Tris/Glisin TamponuBioRad1610734
%16 Paraformaldehit Sulu ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri15710
35 mm TC ile işlenmiş Kolay Kavramalı Stil Hücre Kültürü KabıFalcon353001
3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX)Calbiochem410957
%40 Akrilamid/Bis Çözeltisi, 37.5:1BioRad1610148
6 oyuklu plaka SPL Yaşam Bilimleri -
96 kuyulu optik siyah w/kapaklı hücre kültürü sterilThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Önceden Boyanmış Protein Merdiveni Maöstrojen02102-250
ACK parçalama tamponu GibcoA10492-01
Amonyum Persülfat ve nbsp;BioRad1610700
Antibiyotik-antimikotikGibco 
Anti-fare IgG, HRP'ye bağlı AntikorHücre Sinyali7076
Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı Antikor   Hücre Sinyalizasyonu7074
Lekeleme dereceli engelleyici ve nbsp;BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C / EBP ve alfa; antikorHücre Sinyali2295
CaCl < sub > 2 < / sub >Calbiochem & nbsp;
CD36 antikoruInvitrogenPA1-16813
Hücre Süzgeci 100 ve mikro; m, naylonFalcon352360
Hücre Süzgeci 40 & m, naylonFalcon352340
Kollajenaz tip IIGibco17101-015
Sitasyon 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuBiotek
Deksametazon SigmaD4902
DMEM/F-12, tozGibco12500062
EMBed-812 GÖMME KİTİ (Epon)Elektron Mikroskobu Bilimleri14120
Etanol mutlakMerck 100983 
Fetal sığır serumu Gibco16000-044
Soğuk su balık derisinden elde edilen jelatinSigmaG7041
GlikozGibco 15023-021
Gluteraldehit% 25 Sulu ÇözeltiElektron Mikroskobu Bilimleri16210
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 594Yaşam TeknolojileriA11012
Halt Fosfataz İnhibitör Kokteyli 100X Thermo Scientific78427
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Bağışıklık Lekesi PVDF Membranı BioRad1620177
İndometazin ve nbsp;Sigma I7378 
İnsülin SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Şerit İşaretleyici Azaltıcı Numune Tamponu Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ su steril -
Mitoprofile Total OXPHOS Kemirgen WB antikoru KokteyliAbcam MS604
NaClMerck 
OmniPur  10x PBS Sıvı KonsantresiCalbiochem6505-OP
Osmiyum Tetroksit Elektron Mikroskobu Bilimleri19100
Perilipin 1 antikoruHücre Sinyali9349
PPAR ve gama; (81B8) antikorHücre Sinyali2443
RIPA tampon lizisi Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Sodyum bikarbonat SigmaS5761
Sodyum Kakpedil ElektronMikroskobu Bilimleri12300
Sodyum Dodesil Sülfat ve nbsp;BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Termo Bilimsel
TEMED BioRad1610800
TOM20 antikorHücre Sinyali42406
Tris Tamponlu Salin (TBS-10X)Hücre Sinyali12498
Triton X-100 Sigma93443
Tripsin-EDTA (%0,25)Gibco25200056
Tween 20, Moleküler Biyoloji SınıfıPromega H5152
UCP1 antikorHücre Sinyali14670
Ultracut RLeica 
Uranil Asetat ElektronMikroskobu Bilimleri22400
Westar Sun SiyanojenXLS063
Westar Süpernova SiyanojenXLS3
152400622082915295521064041000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341(2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kahverengi Adipoz DokuAdiposit DiferansiyasyonuKonfokal mm nofloresansTransmisyon Elektron MikroskopisiMitokondriyal FonksiyonUCP1 EkspresyonuLipid Damlac klar

İlgili makaleler