Method Article

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak mikrobiyomunun bileşimi, hayvanın gelişimi ve yaşamı boyunca konakçı fizyolojisi üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Mikrobiyomdaki bileşimsel değişikliklerin ölçülmesi, bu fizyolojik değişiklikler arasındaki fonksiyonel ilişkilerin belirlenmesinde çok önemlidir. Caenorhabditis elegans , konak-mikrobiyom etkileşimlerinin moleküler itici güçlerini incelemek için güçlü bir konak sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Şeffaf vücut planı ve floresan etiketli doğal mikropları ile, tek bir C. elegans hayvanının bağırsak mikrobiyomundaki nispi mikrop seviyeleri, büyük bir partikül ayırıcı kullanılarak kolayca ölçülebilir. Burada, bir mikrobiyomun deneysel kurulumu, C. elegans popülasyonlarının istenen yaşam evresinde toplanması ve analizi, ayıklayıcının çalıştırılması ve bakımı ve elde edilen veri kümelerinin istatistiksel analizleri için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, ilgilenilen mikroplara dayalı olarak sıralayıcı ayarlarını optimize etmeye yönelik hususları, C. elegans yaşam evreleri için etkili geçit stratejilerinin geliştirilmesini ve bağırsak mikrobiyom bileşimine dayalı hayvan popülasyonlarını zenginleştirmek için sıralayıcı yeteneklerinin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Yüksek verimli uygulamalara ölçeklenebilirlik potansiyeli de dahil olmak üzere protokolün bir parçası olarak potansiyel uygulama örnekleri sunulacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan evrimi sürekli mikrobiyal etki altındadır1. Çevredeki çeşitli mikroplardan, hayvan konakçıları, konakçının yeteneklerini genişleten ve fizyolojisini ve hastalığa duyarlılığınıartıran belirli ortaklar2 edinir 3. Örneğin, bağırsak mikrobiyomunun metagenomik analizleri, çoğu insan bağırsak mikrobiyomunda 5 bulunan obez farelerde4 daha fazla enerji hasadı ve depolanması sağlayabilecek zenginleştirilmiş metabolik mikrobiyal gen sınıflarını ortayaçıkardı. Nedensel ilişkiler kurmak ve mikrobiyom etkisinin moleküler belirleyicilerini belirlemek için hala büyük bir ihtiyaç vardır, ancak ilerleme, mikrobiyom karmaşıklıkları ve konakçı sistemlerin büyük ölçekli taramaya izlenebilirliği nedeniyle engellenmiştir.

Model organizma C. elegans, mikrobiyom ve konak fizyolojisi arasındaki bağlantıların moleküler olarak anlaşılmasını ilerletmek için bir platform sağlar. C. elegans, mukozal tabaka ve villus yapılarına sahip 20 bağırsak hücresine sahiptir. Bu hücreler, mikrobiyal ürünleri algılayan ve bağırsak kolonizörlerini potansiyel olarak düzenleyen antimikrobiyal moleküller üreten bol miktarda kemoreseptör genleri ile donatılmıştır 6,7. Bu korunmuş biyoloji C. elegans insülin sinyali, TGF-beta ve MAP Kinaz 8,9,10 dahil olmak üzere bağırsak mikroplarını düzenleyen konakçı sinyallemesinde çok sayıda keşfe yol açmıştır.

C. elegans, mikropları hem gelişim sırasında büyüme için diyetleri hem de yetişkinler olarak mikrobiyom olarak kullanır. Yaşlılıkla birlikte, bazı mikroplar bağırsak lümeninde aşırı birikebilir ve konak-mikrop ilişkisi simbiyozdan patogenezegeçer 11. Doğal ortamlarında, C. elegans çok çeşitli bakteri türleriyle karşılaşır12,13. Doğal habitatlarda (çürük meyveler, bitki sapı ve hayvan vektörleri) toplanan temsili örneklerden 16S rDNA'nın dizilenmesi, C. elegans'ın doğal mikrobiyomuna dört bakteri filumunun hakim olduğunu ortaya koydu: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes ve Actinobacteria. Bu bölümler içinde, habitat 12,13,14,15'e dayalı olarak bakterilerin çeşitliliği ve zenginliğinde büyük farklılıklar vardır. C. elegans araştırma topluluğu17 için oluşturulan en iyi mikrobiyom cinslerini temsil eden 63 üyeli (BIGbiome)16 ve 12 üyeli (CeMbio) koleksiyonları dahil olmak üzere çeşitli tanımlanmış topluluklar oluşturulmuştur. Hem mikrobiyomlar hem de bileşen suşları, vücut büyüklüğü, büyüme oranları ve stres tepkileri gibi C. elegans'ın fizyolojisi üzerinde çeşitli etkilere sahip olabilir 9,16,17. Bu çalışmalar, C. elegans'ı mikrobiyom araştırmaları için bir model olarak kurmak için kaynaklar ve örnekler sağlar.

Burada, popülasyon ölçeğinde mikrobiyom bileşimini ve konakçı fizyolojisinin temel ölçümlerini aynı anda ölçmek için C. elegans sistemini kullanan büyük partikül sıralayıcı (LPS) tabanlı bir iş akışı (Şekil 1) sunulmaktadır. Mikrobiyal açıdan, iş akışı, artan mikrobiyal etkileşimlerle topluluğun sağlamlığını ve plastisitesini test etmek için tanımlanmış bir mikrobiyomu veya tek mikropları bir araya getirmek için uyarlanabilir. Konakçı tarafında, iş akışı, mikrobiyomdaki floresan mikropların kolonizasyon seviyelerini ölçmek ve gelişim, vücut büyüklüğü ve üreme açısından konakçı fizyolojik okumasını sağlamak için yüksek verimli tahliller sağlar. Birlikte ele alındığında, C. elegans mikrobiyom modeli, konakçı fizyolojisini modüle eden metabolik ve genetik belirleyicileri saptamak için yüksek verimli ekranlar sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikrobiyom karışımının hazırlanması

  1. Bir gliserol dondurucu stoğundaki bakterileri bir lizojen et suyu (LB) plakasına veya uygun büyüme ortamına damgalayın veya çizin ve ilgilenilen bakteri suşlarına (tipik olarak 25 ° C) dayalı olarak optimum sıcaklıkta gece boyunca büyütün C . elegans doğal mikroplar).
  2. LB plakasından, her bir bakteri izolatından tek bir koloni kullanın (ör., CeMbio koleksiyonunun 12 bakterisi) 800 μL LB ortamını 1 mL derin kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aşılamak için. 250 rpm'de çalkalayarak gece boyunca optimum sıcaklıkta inkübe edin.
    NOT: Bu protokol, tanımlanmış doğal mikrobiyomlarla (örneğin, CeMbio) kullanım için optimize edilmiştir, ancak uygun koşullar altında büyüme veya diğer kültür kapları (tüpler) ile bireysel mikroplar için kolayca ayarlanabilir.
  3. Her mikrobun büyümesini spektrofotometri ile değerlendirin. 20 μL'lik bir alikotu 80 μL LB'ye aktarın ve çözeltiyi şeffaf düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. OD600'ü bir plaka okuyucuda ölçün.
  4. Gece boyunca büyüdükten sonra, derin kuyucuklu kültür plakasını 4.000 x g'da 10 dakika boyunca bakterileri peletlemek için santrifüjleyin ve süpernatanı 96 oyuklu bir aspirasyon manifoldu veya çok kanallı pipet kullanarak aspirasyonla çıkarın.
  5. OD600 değerlerini kullanarak, steril M9 ortamı kullanarak her mikropun konsantrasyonunu 1.0'lık son OD600'e normalleştirin.
  6. Mikropları birleştiriyorsanız, deney için gereken bakteri kültürü miktarını belirleyin ve her bir bakteri suşunun eşit hacimlerini yeterli büyüklükte bir tüpte (örneğin, 5 mL veya 15 mL tüpler) birleştirerek bir mikrobiyom ana karışımı oluşturun.
  7. Mikropların 30-50 μL'sini, her bir nematod büyüme ortamı (NGM) agar içeren plakanın veya kuyu18'in merkezine son OD600 1.0 ile tespit edin. Tohumlanmış mikrobiyomun gece boyunca optimum sıcaklıkta (burada 25 °C) büyümesine izin verin.
    NOT: NGM agar plakalarını Wormbook'taki talimatlara göre önceden hazırlayın veya önceden karıştırılmış NGM tozu18 kullanın. Örneğin, 12 oyuklu plakalar için 3 mL NGM eklenir ve 24 oyuklu plakalar için 1.5 mL eklenir.

2. Mikrobiyom üzerinde büyüme için senkronize C. elegans'ın hazırlanması

  1. Solucanlar olgun yetişkinliğe ulaşana kadar Escherichia coli OP50 ile tohumlanmış NGM plakalarında (6 cm çapında) yaklaşık 100 solucan büyütün. Bu protokolün amaçları doğrultusunda, C. elegans N2 suşu kullanılmıştır, ancak protokol diğer nematod suşlarına kolayca uyarlanabilir.
  2. 6 mL M9 tamponu ekleyin (artı% 0.01 triton X-100; M9-TX) tabağa, yaklaşık 100 gravid yetişkin solucanı 15 mL'lik konik bir tüpe yıkamak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
  3. İki kısım çamaşır suyunu bir kısım 5 M NaOH ile karıştırarak taze yapılmış ağartma solüsyonu hazırlayın.
  4. Solucanları pelet yapmak için solucanları 30 saniye boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Hacmi 4 mL'ye düşürmek için aspire edin ve ardından 2 mL ağartıcı solüsyonu ekleyin.
  5. Kapağı sıkıca kapatın ve tüpü sallayın. Çözeltideki yetişkin solucanları stereo mikroskop altında 10x büyütmede izleyin. Yetişkin vücutları parçalanmaya başladığında, tipik olarak 3,5 dakika sonra, sallamayı bırakın ve 30 saniye boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Bir pipetle minimum hacme kadar aspire edin. Ağartıcıyı yıkamak için M9-TX'de dört kez yeniden askıya alın, santrifüjleyin ve aspire edin.
  7. 4-6 mL M9-TX'de yeniden süspanse edin ve tüpü gece boyunca bir döndürücüye yerleştirin, böylece yumurtaların L1 aşamasında çatlamasına ve senkronize olmasına izin verin.
  8. Ertesi gün, tüpten M9-TX'de 10 μL L1 solucanı alın ve temiz bir Petri kabına bırakın. Stereo mikroskop altında 20x toplam büyütmede yaşayan L1 solucanlarının sayısını sayın.
  9. L1 yoğunluğuna bağlı olarak, mikrobiyom tohumlu NGM plakalarının kenarına ~50 senkronize L1 larvası bırakmak için uygun hacmi pipetleyin ve 20 °C'de inkübe edin. Solucanların istenen yaşa kadar büyümesine izin verin (yetişkinliğin 2. günü veya 3. günü).

3. Bağırsak mikrobiyom analizleri için solucan popülasyonunun toplanması

  1. Solucanları bakteri çimlerinden 1-2 mL M9-TX ile sterilize edilmiş 2 mL 96 oyuklu derin bir plakaya yıkayın.
    NOT: Önemli biyofilmler oluşturan mikrobiyal suşlar için, mikrobiyal kalıntıları parçalamak için plakayı 5 dakika boyunca sıvı ile çalkalayın.
  2. Solucanları peletlemek için derin kuyu plakasını 300 x g'da 1 dakika santrifüjleyin ve ardından bir aspirasyon manifoldu kullanarak sıvıyı çıkarın.
    NOT: Kullanıcılar, bir aspirasyon manifoldu mevcut değilse, sıvıyı manuel olarak çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanabilir. Solucan örneklerinin kaybını önlemek için pipet uçlarının kuyucukların dibine temas etmediğinden emin olun.
  3. 1,2 mL çok kanallı pipet kullanarak derin kuyu plakasının her bir oyuğuna 1,8 mL M9-TX ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve 300 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Sıvıdaki bakterileri gidermek için bu adımı dört kez tekrarlayın.
  4. Son yıkamadan sonra, aspirasyon manifoldunu kullanarak her bir kuyucuğun hacmini 100 μL'ye getirin.
    NOT: Yetişkinleri yerçekimi kullanarak larvalardan ayırmak için, plakayı 30-60 saniye boyunca tezgahta bırakın ve yetişkin solucanların kuyunun dibine batmasına izin verin. Ardından, larvaları süspansiyondan çıkarmak için plakayı aspire edin.
  5. Her bir kuyucuğa M9-TX'de 100 μL 10 mM levamisol ekleyin ve solucanların 5 dakika boyunca felç olmasına izin verin. Levamizol işleminden sonra, gerekirse bakteri kümelerini azaltmak için 2.3 adımında açıklanan ağartıcı solüsyonunun% 4'ünü 2 dakika boyunca her bir oyuğa ekleyin. Ağartma işleminden sonra M9-TX ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamadan sonra 100 μL'lik bir son hacme aspire edin.
  6. Solucanları, M9-TX'de 150 μL 10 mM levamisol içeren düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Solucan yoğunluğunu oyuk başına 50-100'de tutun ve popülasyon çok kalabalıksa solucanları birden fazla kuyuya bölün.

4. Büyük partikül sıralayıcının ve otomatik örnekleyicinin kurulması

  1. Hava kompresörünü, bilgisayarı ve LPS cihazını açın. Atık tankını kontrol edin ve boşaltın. Ardından, boş atık tankına 500 mL çamaşır suyu ekleyin. Hacim düşükse kılıf ve su depolarını kontrol edin ve yeniden doldurun. 250 μm akışkan ve optik çekirdek tertibatının (FOCA) yerinde olduğundan emin olun.
  2. Kalite kontrol için kontrol parçacıklarını çalıştırın. LPS enstrüman yazılımını açın. Yazılım penceresinde, 488 nm ve 561 nm lazerleri açmak için Lazerleri Etkinleştir'i işaretleyin.
    NOT: Kontrol parçacıkları önceki 2 hafta içinde çalıştırılmışsa ve bu süre içinde FOCA değiştirilmemişse, 4.2-4.5 adımlarını atlamak mümkündür.
  3. Kontrol parçacıklarını ayarla > öğesini seçin. Varsayılan ayarlara gitmek için istemde Hayır'ı seçin. Her kullanımdan önce kontrol partiküllerini (50 mL'lik konik bir tüpte 10 mL dH,2O ve 10 mL kontrol partikülleri) vorteksleyin ve numune portuna yükleyin.
  4. Hazır olduğunuzda, 500 olay kaydetmek için Al'a tıklayın. Olay hızının 15-30 olay/sn arasında olduğundan emin olun.
    NOT: Olay hızı 15–30 olay/sn değilse, makine ayarlarını yapmak için bir mühendisle iletişime geçilmelidir.
  5. Tüm parametreler için varyasyon katsayısını (CV) inceleyin. CV %15 < ise kalite kontrolden geçilir ve LPS yazılımı kapatılabilir. CV %15 > ise, tekrar çalıştırın ve lazeri akış hücresiyle hizalamak için mikrometreleri yeni yapılmış kontrol parçacıklarıyla ayarlayın.
  6. Otomatik örnekleyiciyi bağlayın ve açın. Otomatik örnekleyici cihaz yazılımını açın. Bu, otomatik örnekleyiciyi ve LPS yazılımını açar. LPS yazılım penceresinde, Yeni > Deney Dosyala'ya ve ardından Yeni > Örnek Dosyala'ya gidin. Henüz yapılmadıysa, Lazerlerin 488 nm ve 561 nm lazerleri açmasını etkinleştir'i işaretleyin.
  7. LPS yazılım penceresinde uçuş süresi (TOF), sönme (EXT) ve floresan kanalları kullanarak alım nokta grafikleri için şablonlar oluşturun. Tüm solucanları yakalamak için iyi bir başlangıç maksimum sayısı TOF ve EXT için 8.000'dir. Floresan ölçekleri her mikroba göre değişecektir. Floresan olmayan mikrop (örneğin, OP50) ve tek başına her bir floresan mikrop (mikroplar karıştırılıyorsa) üzerinde yetiştirilen kontrol solucanı örneklerini her deneyde kontrol olarak dahil edin.
    1. Ölçeklendirmeyi değiştirmek için grafiğin gövdesine sağ tıklayın. TOF ve EXT geçit seçimine yardımcı olmak için 1. gün yetişkinleri veya senkronize L1'ler (veya ilgilenilen popülasyon) gibi kontrol hayvanlarını kullanın.
  8. Otomatik örnekleyici penceresinde Prime'ı seçin. Doğru yerleşik komut dosyasını seçmek için Dosya > Komut Dosyasını Aç'a gidin ve ardından Tamam'a tıklayın.
    1. Yalnızca analiz için, Al ile betiği seçin. Sıralama için, Dağıt ile komut dosyasını seçin. 96 kuyulu plakalardan elde etmek için, 96 kuyulu komut dosyasını seçin; 384 kuyucuklu plakalardan almak için, 384 kuyulu komut dosyasını seçin. Örnek hacmi (40 veya 100 μL) için, ilgili hacme sahip komut dosyasını seçin.
  9. Analiz için istenen kuyucukları seçmek için otomatik numune alma yazılımı menüsündeki Plaka Şablonu'na gidin. Kontrol örneklerini yükleyin. Plaka otomatik örnekleyiciye yüklendikten sonratage ve sabitlendi, otomatik örnekleyici penceresindeki Run Plate düğmesine basın. İstendiğinde dosyayı kaydedin.
    NOT: Kontrol sampLP s'de 50 mL'lik bir konik tüp ile ampl'yi takmadan önce s'deampreyr.
  10. Alım tamamlandığında, LPS yazılım penceresinin üst şeridindeki Verileri Depola düğmesine tıklayın ve verileri tekrar kaydedin.

5. Hayvan başına C. elegans özelliklerinin ve bağırsak mikrobiyom seviyelerinin analizi

  1. Ham veriler üç dosya türünde depolanır: .lmd, .bxr3 .txt. .txt dosya etiketli metin dosyasını analiz için R programına yükleyin. R19'da aşağıdaki adımları tamamlayın.
  2. Analiz için bir çerçeve olarak tidyverse20 paketini kullanın.
  3. ggplot işlevini (tidyverse'e dahildir) kullanarak, TOF değerlerini x ekseni ve EXT değerlerini y ekseni olarak kullanarak LPS verilerini çizin. Normal bir çizim iki nokta bulutu gösterecektir. Birinin orijine ve x eksenine yakın olduğundan emin olun, larvalar ve küçük döküntüler gibi daha küçük parçacıkları gösterir ve ikinci parçacık grubu grafiğin sağ üst köşesine doğrudur ve yetişkin nematodları temsil eder.
  4. Bu gruplamayı kılavuz olarak kullanarak, yeterli TOF ve EXT kesme değerlerini seçin. Geçitleme, fizyolojideki değişikliklere bağlı olarak farklı mikroplar üzerindeki C. elegans suşlarına göre değişebilir (örneğin, koyu ve berrak hayvanlar veya yumurta taşıyıcısındaki değişiklikler EXT katsayılarını değiştirebilir).
  5. Yetişkinleri ve larvaları TOF ve EXT geçitleme ile ayırmak için işlev alt kümesini kullanın. Buradaki örnekte, yetişkin hayvanlar için kapı > 1.200 ve EXT > 1.000 ayarını kullanın.
  6. İstatistiksel farklılıklar için elde edilen veri kümelerini analiz edin; Bu deney için R'deki t-test işlevini kullanın.
    1. Mikrobiyomun boyutu ve optik yoğunluğu üzerindeki etkisini belirlemek için C. elegans, koşullar arasında sırasıyla TOF ve EXT değerlerini karşılaştırın. TOF, solucan boyutunun bir temsilcisidir ve belirli zamanlarda hayvanların büyüme oranlarındaki değişiklikleri gösterebilir. EXT değişiklikleri, yumurtaların saçtığı ışık nedeniyle gelişimin sonu ile yetişkinlik arasında en büyüktür ve bu geçişin ve doğurganlığın zamanlamasındaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Analizler sırasında tutulmuşlarsa döllerin oranını ve dağılımlarını değerlendirin.
    2. Bağırsak mikrobiyom kolonizasyon seviyelerindeki değişiklikleri belirlemek için, önce her hayvan için ayrı TOF değerlerine bölerek floresan değerlerini (örneğin kırmızı veya yeşil sütunlar) normalleştirin. Solucanlar büyüdükçe ve yetişkin oldukça, bağırsaklarının hacmi de büyür. Normalleştirme, örnek hayvan boyutu dağılımlarındaki farklılıklardan kaynaklanan artefaktları azaltmaya yardımcı olur. Koşullar arasında bağırsak mikrobiyom kolonizasyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için normalleştirilmiş hayvanları kullanın.
      NOT: Bir ham veri örneği ve ilgili R komut dosyaları, Ek Dosya 1 JOVE_worm_microbiome.txt ve Ek Dosya 2 JOVE_worm_microbiome.r'de bulunabilir. İki floresan bakteri kullanılarak konakçı ve mikrobiyomun bu analizlerinin temsili bir örneği için Şekil 2 ve Şekil 3'e bakın.

6. C. elegans hayvanlarının bağırsak mikrobiyom özelliklerine göre sınıflandırılması

  1. Adım 3'te açıklandığı gibi floresan etiketli mikroplar (örneğin, RFP) üzerinde yetiştirilen bir C. elegans popülasyonu toplayın. Solucanlar, en az 5 mL numune içeren 50 mL'lik konik tüplere yerleştirilmelidir. Tüm yetişkinler ve yavrular dahil olmak üzere yaklaşık 2.000 solucan / mL hedefleyin.
    NOT: Bu, LP örnekleyici kullanılarak düz tabanlı 96 oyuklu bir plakada da yapılabilir. Solucan yoğunluğunu oyuk başına 50-100'de tutun.
    1. LP örnekleyici kullanılmışsa, LP örnekleyiciyi kapatın ve bağlantısını kesin. Ayırmadan önce numune ve temizleme hatlarını LPS'ye yeniden bağlayın.
  2. LPS yazılımını açın, Yeni > Deney Dosyası'na ve ardından Yeni > Örnek Dosyala'ya gidin. X ekseninde TOF ve y ekseninde Yok Olma ile bir nokta grafiği oluşturun. X ekseninde TOF ve y ekseninde Kırmızı ile başka bir nokta grafiği oluşturun. Daha önce kullanılanla aynı eksen ölçeğini ve lazer ayarlarını kullanın. 488 nm ve 561 nm lazerleri açmak için Lazerleri Etkinleştir'i işaretleyin
    NOT: Bu grafikler daha önce oluşturulmuşsa, grafikleri yüklemek için Dosya > Deney Aç'a ve Dosya > Örnek Aç'a gidin.
    1. Kontrol s'yi yerleştirinampamptüpampport. Al/Dağıt iletişim kutusunda, Al'ı tıklatın. İstendiğinde dosyayı kaydedin. Popülasyonları ayırt etmek için yeterli sayıda solucan ölçüldükten sonra, İptal'i tıklatın.
      NOT: Akış hızları yaklaşık 15–30 olay/sn olmalıdır. Değilse, tek tek hayvanların damlacık başına analiz edildiğinden veya sıralandığından emin olmak için solucan konsantrasyonlarını ayarlayın. LPS'de solucanlar, lazerin yolundan farklı pozisyonlarda (düz, kıvrılmış veya bükülmüş) geçer. Konumlarına bağlı olarak lazeri ve dedektörü geçmeleri farklı bir zaman alabilir.
    2. TOF vs Extinction nokta grafiğinde, yetişkin nüfusun etrafına bir kapı çizin. TOF ve Kırmızı nokta grafiğinde, farklı mikrobiyom kolonizasyonu seviyelerine sahip yetişkin solucanlar için ilgi alanları olarak yüksek ve düşük kırmızı değerlere sahip alanların etrafına kapılar çizin. Geçit Hiyerarşisini Görüntüle'> gidin ve floresan kapıların yetişkin nüfus kapısının altında listelendiğinden emin olun. Ayarlar optimize edildikten sonra Dosya > Denemeyi Kaydet ve Dosya > Örneği Kaydet'e gidin.
      NOT: Buradaki örnekte, yetişkinler için TOF / EXT kapılarına göre hayvanları seçin ve kırmızı floresan protein eksprese eden bakterilerle yüksek veya düşük kolonizasyon sergileyen havuzlara ayırın. Bununla birlikte, LPS tarafından ölçülen parametrelerin herhangi bir kombinasyonu, ilgilenilen popülasyon(lar)ı tanımlamak için kullanılabilir.
  3. Ayırmadan önce, uygun toplama aparatının yüklendiğinden emin olun. 96 kuyulu plakayı toplama aparatına yüklemek için, toplama aşamasının 96 kuyulu bir plakayı yüklemek için hazırlanmış bir konuma taşınmasına izin vermek için Al/Dağıt iletişim kutusundaki Aşamayı Taşı bölümünün altında Plakayı Yükle A'yı > Taşı'yı seçin.
  4. Toplu sıralama için uygun tüp boyutunu seçin ve 15 mL veya 50 mL konik tüp yüklemek için Taşı'ya tıklayın. Al/Dağıt iletişim kutusunun Sıralama bölümünde, oluşturulan bölgelerin açılan listesinden sıralama geçidini seçin. Akış hücresi nozülünün hemen altındaki bir toplama tüpüne dağıtılacak tanımlı bölgeden nesne sayısını girin. Al / Dağıt iletişim kutusunun altındaki Toplu Sıralama düğmesine tıklayın.
  5. 96 oyuklu bir plakaya dağıtmak için Kalibre Edilmiş Plakalar > 96 oyuklu Plaka > Kurulum > Plakaları'na gidin. Ardından > Plaka Şablonunu Görüntüle'ye gidin, solucanların sıralanacağı kuyucukları seçin, her bir kuyucuğa sıralanacak nesnelerin sayısını girin ve ilgilenilen kapılı bölgeleri seçin. Birden fazla kapılı bölge aynı plakaya sıralanacaksa, Her Kuyu Kapısı kutusunu işaretleyin. Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklayın.
  6. Sıralama numaraları ve konumları atandıktan sonra, 96 oyuklu bir plakaya dağıtımı başlatmak için Al/Dağıt iletişim kutusundan Plakayı Doldur düğmelerine tıklayın.
    1. 96 oyuklu plakanın tamamını doldurmadan önce, bir hayvan alt kümesinin veya kontrollerin 96 oyuklu bir plakaya test sıralamasını gerçekleştirin ve uygun sayıların ve istenen hayvan popülasyonlarının sıralandığından emin olmak için bir stereomikroskop kullanarak analiz edin. Doğru sıralama onaylandıktan sonra, deneysel numuneler için 6.3-6.6 adımlarını tekrarlayın. Verileri tekrar kaydetmek için LPS yazılım penceresinin üst şeridindeki Verileri Depola düğmesine tıklayın.
      NOT: Tüm ölçümler (EXT, TOF, RFP, GFP, vb.) sınıflandırılmış hayvanlar için de toplanabilir ve sınıflandırılmayanlarla karşılaştırılabilir. Bu, istenirse analiz ve sıralama modlarının aynı anda çalıştırılmasına izin verebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ergin ve larva popülasyon kapılarının tanımlanması
Burada, senkronize C. elegans L1'ler, standart bir laboratuvar diyeti olan E. coli OP50 (Eco) ile tohumlanmış bir NGM plakası üzerinde büyütüldü. C. elegans popülasyonları, 20 ° C'de 96 saat veya 120 saat büyümeden sonra LPS analizi için toplanmıştır (Şekil 2A). Yok oluşun nokta grafiği (EXT, vücut yoğunluğunun bir temsilcisi) ve uçuş süresi (TOF, vücut uzunluğunun bir temsilcisi) görsel olarak ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış vermimetrisi, çeşitli çalışmalarda C. elegans genlerini ve patojen kolonizasyonuna ve toksisitesine karşı yolakları karakterize etmek için kullanılmıştır21,22. Burada, bağırsak mikrobiyomlarının konakçı fizyolojisini nasıl modüle ettiğini araştırmak için C. elegans'ı kullanan yüksek verimli bir yaklaşım sunulmaktadır. Koloni oluşturan birimler (CFU) veya 16S rRNA amplikon dizilimi 9,16,17,23,24 kullanan mevcut yöntemlerle karşıl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH hibeleri DP2DK116645 (BSS'ye), Dunn Vakfı pilot ödülü ve NASA hibesi 80NSSC22K0250 (BSS'ye) tarafından desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği tarafından CPRIT Çekirdek Tesis Destek Ödülü (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 ve RR024574) ve Joel M. Sederstrom'un yardımı ve ayrıca LPS NIH hibesi (S10 OD025251) için bir enstrümantasyon hibesi. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL konik tabanlı santrifüj tüpleriVWR10026-076
96 derin kuyu plakası (1 mL)AxygenP-DW-11-C
96 derin kuyu plakası (2 mL)AxygenP-DW-20-C
96 kuyulu Costar plakasıCorning3694
AgarMillipore SigmaStandard bakteriyoloji agar da yeterlidir.
Hava çekme manifolduV& P scientificVP1171A
Çamaşır SuyuClorox
Çamaşır Suyu çözeltisi Çamaşır Suyunu 5M Sodyum hipoklorit ile karıştırın 2: 1 (v / v)
Hücre Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuBiotekCytation 5Bakteriyel OD ölçümü
SantrifüjThermo scientific Sorvall Legend XTR96 kuyulu plaka ve konik tüpler için
Floresan MikroskopNikonTiE
ggplot: Verileri Çizmek için Çeşitli R Programlama Araçları.R paketiSürüm 3.3.2
Büyük Parçacıklı Otomatik Numune AlmaCihazı Union BiometricaLP Örnekleyici
Büyük Partikül SıralayıcıBirliği BiometricaCOPAS Biyosorter
LevamizolFisherAC187870100
Lizojen Et Suyu (LB)RPIL24066Standart LB Bacto-tripton, maya özü ve NaCl kullanan ev yapımı tarifler de yeterli.
M9 çözümü 22 mM KH2PO4 monobazik, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematod Büyüme OrtamıRPIN81800-1000.01 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 otoklavlamadan sonra eklenir.
RStudioGNUSürüm 1.3.1093
Sodyum hipokloritSigma-Aldrich5M NaOH
Stereo MikroskopNikonSMZ745
Steril 10 cm çapında petri kaplarıCorning351029
Steril 12 oyuklu plakalarVWR10062-894
Steril 24 oyuklu plakalarVWR10062-896
Steril 6 cm çapında petri kaplarıCorning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877(2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles