Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

Summary

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Abstract

Bağırsak mikrobiyomunun bileşimi, hayvanın gelişimi ve yaşamı boyunca konakçı fizyolojisi üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Mikrobiyomdaki bileşimsel değişikliklerin ölçülmesi, bu fizyolojik değişiklikler arasındaki fonksiyonel ilişkilerin belirlenmesinde çok önemlidir. Caenorhabditis elegans , konak-mikrobiyom etkileşimlerinin moleküler itici güçlerini incelemek için güçlü bir konak sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Şeffaf vücut planı ve floresan etiketli doğal mikropları ile, tek bir C. elegans hayvanının bağırsak mikrobiyomundaki nispi mikrop seviyeleri, büyük bir partikül ayırıcı kullanılarak kolayca ölçülebilir. Burada, bir mikrobiyomun deneysel kurulumu, C. elegans popülasyonlarının istenen yaşam evresinde toplanması ve analizi, ayıklayıcının çalıştırılması ve bakımı ve elde edilen veri kümelerinin istatistiksel analizleri için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, ilgilenilen mikroplara dayalı olarak sıralayıcı ayarlarını optimize etmeye yönelik hususları, C. elegans yaşam evreleri için etkili geçit stratejilerinin geliştirilmesini ve bağırsak mikrobiyom bileşimine dayalı hayvan popülasyonlarını zenginleştirmek için sıralayıcı yeteneklerinin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Yüksek verimli uygulamalara ölçeklenebilirlik potansiyeli de dahil olmak üzere protokolün bir parçası olarak potansiyel uygulama örnekleri sunulacaktır.

Introduction

Hayvan evrimi sürekli mikrobiyal etki altındadır¹. Çevredeki çeşitli mikroplardan, hayvan konakçıları, konakçının yeteneklerini genişleten ve fizyolojisini ve hastalığa duyarlılığını^{artıran belirli} ortaklar² edinir 3. Örneğin, bağırsak mikrobiyomunun metagenomik analizleri, çoğu insan bağırsak mikrobiyomunda 5 bulunan obez farelerde⁴ daha fazla enerji hasadı ve depolanması sağlayabilecek zenginleştirilmiş metabolik mikrobiyal gen sınıflarını ortaya^çıkardı. Nedensel ilişkiler kurmak ve mikrobiyom etkisinin moleküler belirleyicile....

Protocol

1. Mikrobiyom karışımının hazırlanması

1. Bir gliserol dondurucu stoğundaki bakterileri bir lizojen et suyu (LB) plakasına veya uygun büyüme ortamına damgalayın veya çizin ve ilgilenilen bakteri suşlarına (tipik olarak 25 ° C) dayalı olarak optimum sıcaklıkta gece boyunca büyütün C . elegans doğal mikroplar).
2. LB plakasından, her bir bakteri izolatından tek bir koloni kullanın (ör., CeMbio koleksiyonunun 12 bakterisi) 800 μL LB ortamını 1 mL derin kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aşılamak için. 250 rpm'de çalkalayarak gece boyunca optimum sıcaklıkta inkübe edin.
   NOT: Bu protokol, tanımlanmış doğal mikrobiyomlarla (....

Results

Ergin ve larva popülasyon kapılarının tanımlanması
Burada, senkronize C. elegans L1'ler, standart bir laboratuvar diyeti olan E. coli OP50 (Eco) ile tohumlanmış bir NGM plakası üzerinde büyütüldü. C. elegans popülasyonları, 20 ° C'de 96 saat veya 120 saat büyümeden sonra LPS analizi için toplanmıştır (Şekil 2A). Yok oluşun nokta grafiği (EXT, vücut yoğunluğunun bir temsilcisi) ve uçuş süresi (TOF, vücut uzunluğunun bir temsilcisi) görsel olarak .......

Discussion

Akış vermimetrisi, çeşitli çalışmalarda C. elegans genlerini ve patojen kolonizasyonuna ve toksisitesine karşı yolakları karakterize etmek için kullanılmıştır^21,22. Burada, bağırsak mikrobiyomlarının konakçı fizyolojisini nasıl modüle ettiğini araştırmak için C. elegans'ı kullanan yüksek verimli bir yaklaşım sunulmaktadır. Koloni oluşturan birimler (CFU) veya 16S rRNA amplikon dizilimi 9,16,17,23,24 kullanan mevcut yöntemlerle karşıl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL konik tabanlı santrifüj tüpleri	VWR	10026-076
96 derin kuyu plakası (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 derin kuyu plakası (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96 kuyulu Costar plakası	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bakteriyoloji agar da yeterlidir.
Hava çekme manifoldu	V& P scientific	VP1171A
Çamaşır Suyu	Clorox
Çamaşır Suyu çözeltisi			Çamaşır Suyunu 5M Sodyum hipoklorit ile karıştırın 2: 1 (v / v)
Hücre Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu	Biotek	Cytation 5	Bakteriyel OD ölçümü
Santrifüj	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	96 kuyulu plaka ve konik tüpler için
Floresan Mikroskop	Nikon	TiE
ggplot: Verileri Çizmek için Çeşitli R Programlama Araçları.	R paketi	Sürüm 3.3.2
Büyük Parçacıklı Otomatik Numune Alma	Cihazı Union Biometrica	LP Örnekleyici
Büyük Partikül Sıralayıcı	Birliği Biometrica	COPAS Biyosorter
Levamizol	Fisher	AC187870100
Lizojen Et Suyu (LB)	RPI	L24066	Standart LB Bacto-tripton, maya özü ve NaCl kullanan ev yapımı tarifler de yeterli.
M9 çözümü			22 mM KH2PO4 monobazik, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematod Büyüme Ortamı	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 otoklavlamadan sonra eklenir.
RStudio	GNU	Sürüm 1.3.1093
Sodyum hipoklorit	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Mikroskop	Nikon	SMZ745
Steril 10 cm çapında petri kapları	Corning	351029
Steril 12 oyuklu plakalar	VWR	10062-894
Steril 24 oyuklu plakalar	VWR	10062-896
Steril 6 cm çapında petri kapları	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787