Burada, kemirgen veya insan yağ dokusundan izole edilen mikrovasküler fragmanların işlevsel, vaskülarize bej yağ dokusunun mühendisliğine basit bir yaklaşım olarak kullanımını özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikrovasküler Fragmanlardan Vaskülarize Termojenik Yağ Dokusunun Üç Boyutlu Kültürü
Bu makalede
Özet
Özet
Mühendislik termojenik yağ dokusu (örneğin, bej veya kahverengi yağ dokuları), metabolik hastalıklar için potansiyel bir tedavi olarak veya sağlık taraması ve ilaç testi için kişiselleştirilmiş mikrodokuların tasarımı için araştırılmıştır. Mevcut stratejiler genellikle oldukça karmaşıktır ve termojenik yağ dokusunun çok hücreli ve fonksiyonel özelliklerini tam olarak tam olarak tasvir edememektedir. Yağ dokusundan izole edilen arteriol, venüller ve kılcal damarlardan oluşan küçük bozulmamış mikrodamarlar olan mikrovasküler fragmanlar, vaskülarizasyon ve yağ dokusu oluşumunu sağlayan tek bir otolog hücre kaynağı olarak işlev görür. Bu makalede, mikrovasküler fragmanların yağ dokusu ve kültür koşullarından izole edilmesine yönelik protokoller de dahil olmak üzere, mikrovasküler fragmanlardan üç boyutlu, vaskülarize ve fonksiyonel termojenik yağ dokularının üretilmesini sağlamak için kültür koşullarını optimize etme yöntemleri açıklanmaktadır. Ek olarak, mühendislik dokularını karakterize etme teknikleri gibi en iyi uygulamalar tartışılmakta ve hem kemirgen hem de insan mikrovasküler fragmanlarından numune sonuçları sağlanmaktadır. Bu yaklaşım, obezite ve metabolik hastalıklara yönelik tedavilerin anlaşılması ve geliştirilmesi için kullanılma potansiyeline sahiptir.
Giriş
Bu protokolün amacı, potansiyel olarak otolog tek bir kaynaktan, mikrovasküler fragmandan (MVF) vaskülarize bej yağ dokusu geliştirmek için bir yaklaşımı tanımlamaktır. Kahverengi ve bej yağ dokularının metabolik regülasyon ile ilgili faydalı özellikler gösterdiği gösterilmiştir; Bununla birlikte, yetişkinlerde bu yağ dokusu depolarının küçük hacmi, özellikle obezite veya tip 2 diyabet 1,2,3,4,5,6,7 gibi hastalıklı durumlarda, sistemik metabolizma ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ilkelerine uygun olarak Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliğinin Uygulanmasına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio'daki Teksas Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
NOT: Aşağıda açıklanan adımlar için erkek Lewis Sıçanları kullanılmıştır. Bir dişi için hafif protokol ayarlamaları yapılmalı ve fare mikrovasküler fragmanı (MVF) koleksiyonu29. İnsan MVF'lerini (h-MVF'ler) kullanan protokoller için gereken tek adım, üreticinin protokolünü takiben h-MVF'leri....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bej / kahverengi yağ dokusunun birkaç önemli fenotipik morfolojik özelliği vardır: multilokülerdir / küçük lipit damlacıkları içerir, çok sayıda mitokondriye sahiptir (karakteristik olarak "kahverengimsi" görünümünün nedeni in vivo), buna bağlı olarak yüksek oksijen tüketim oranına / mitokondriyal biyoenerjetik özelliklere sahiptir, yüksek vaskülarize olmuş, lipoliz / insülin ile uyarılmış glikoz alımını arttırmıştır ve en ünlüsü, termojenik solunumda rol oynayan mitokondriyal bir protein olan yüksek düzeyde ay.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kahverengi/bej yağ dokusu mühendisliği alanı büyük ölçüde olgunlaşmamış 22,23,24,25,26,27,28 olup, beyaz yağ dokusu için yağ modellerinin büyük kısmıgeliştirilmektedir 8,22,31. Mühendislik kahvereng.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Teşekkürler
Dr. Acosta, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından CA148724 ve TL1TR002647 hibeleri ile desteklenmektedir. Dr. Gonzalez Porras, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından F32-0DK122754 Ödül Numarası altında desteklenmektedir. Bu çalışma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri (5SC1DK122578) ve San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Rakamlar kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Aminokaproik Asit | Sigma Aldrich | A2504-100G | 1 mg / mL konsantrasyonunda DMEM'e eklendi |
| Künt Uçlu Makas | Fisher scientific | 12-000-172 | Otoklavda sterilize |
| Bovin Serum Albümini (BSA) | Millipore | 126575-10GM | PBS'de 4 mg / mL ve 1 mg / mL |
| Collagenase Tip 1'e | Fisher bilimsel | NC9633623 | BSA 4 mg / mL içinde 6 mg / mL'ye seyreltilmiş, Kıyılmış yağın sindirimi |
| Deksametazon | Thermo Scientific | AC230302500 | 2 mg / ml stok konsantrasyonunda etanol içinde seyreltilmiş |
| Tek kullanımlık alt pedler | Fisher scientific | 23-666-062 | Ameliyat sırasında sıvı emilimi için |
| Diseksiyon Makası | Fisher scientific | 08-951-5 | Otoklavda |
| sterilize edinDulbecco ve başbakan; s Modifiye Eagle & Prime; s Orta (DMEM) | Fisher bilimsel | 11885092 | |
| Dulbecco′ s Modifiye Eagle & Prime; s Orta/Besin Karışımı F-12 Jambon (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| Fetal Sığır Serumu | Fisher bilimsel | 16140089 | DMEM'de %20 v/v'ye eklendi. |
| Fibrinojen | Sigma Aldrich | F8630-25G | 20 mg / mL konsantrasyonunda DMEM'de çözündürülmüş, Kan plazmasında bulunan protein ve hidrojel Şişesi'nin ana bileşeni |
| , 250 mL | Fisher bilimsel | FB500250 | Geniş bir yüzey alanı kullanarak yağın sindirilmesine izin verir |
| Forseps | Fisher scientific | 50-264-21 | Otoklavda sterilize edin, Doku ve filtrelerin kullanımı için |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 10 mM stok konsantrasyonunda etanol içinde seyreltilmiş |
| İnsan MVF'si | Gelişmiş Çözümler Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Bu çalışmada üç farklı hastadan (52, 54 ve 56 yaşındaki kadınlar) izole edilen İnsan MVF'leri (hMVF'ler) kullanılmıştır. |
| İndometasin | Sigma Aldrich | I7378 | 12.5 mM stok konsantrasyonunda etanol içinde seyreltilmiş |
| Domuz pankreasından insülin | Sigma Aldrich | I5523 | 5 mg / ml stok konsantrasyonunda 0.01 N HCl içinde seyreltilmiş |
| MycoZap | Fisher bilimsel | NC9023832 | DMEM'de ağırlıkça %0.2'ye eklendi, Mikoplazma Profilaktik |
| Pennycilin/Streptomisin (10.000 U/mL) | Fisher bilimsel | 15140122 | DMEM'de %1 v/v'ye eklenir. |
| Petri kapları, polistiren (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 kan damarlarının çıkarılması ve kıyma için, eleklerin önceden ıslatılması için 8 (kapak) ve 500 veya 37 & mikro ile filtreleme yaparken kullanım için 8 (çanak); M |
| , Petri kapları, polistiren (35 mm x 10 mm) | Fisher scientific | 50-202-036 | Parçaları saymak için |
| Fosfat Tampon Salin (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Steril deiyonize su ile 1x'e seyreltilir. |
| Sıçan Makası (Andwin Mini Arco Evcil Hayvan Düzeltici) | Fisher bilimsel | NC0854141 | |
| Rosiglitazone | Fisher bilimsel | R0106200MG | 10 mM stok konsantrasyonunda DMSO'da seyreltilmiş |
| Makas | Güzel Bilim Araçları | 14059-11 | İlk insizyon için 1, epididimal insizyon için 1, uç kırpma için 1 |
| Ekran 37 &mikro; M | Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi | 652222R | 3 "yuvarlak kareler halinde kesin ve etilen oksit içinde sterilize edilmiş, Parça sıkışması ve çok küçük parçaların/tek hücrelerin ve döküntülerin çıkarılması |
| Ekran 500 ve mikro; M | Carolina Biyolojik Tedarik Şirketi | 652222F | 3 "yuvarlak kareler halinde kesin ve etilen oksit içinde sterilize edildi, Daha büyük parçaları/kalıntıları temizler |
| Tırtıklı Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Otoklavda sterilize edin, İnsizyondan önce cildin sıkıştırılması için |
| Steriflip Filter 0.22 &; m | Millipore | SE1M179M6 | |
| Trombin | Fisher scientific | 6051601KU | Deiyonize suda 10 U / mL'ye seyreltilmiş, Fibrinojeni fibrine dönüştüren bir pıhtılaşma ajanı olarak kullanılır |
| Tiroid hormonu (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | 0.02 mM stok konsantrasyonunda 1N NaOH içinde seyreltilmiş |
| Zucker diyabetik yağlı (ZDF) sıçanlar - obez (FA / FA) veya yağsız (FA / +) erkek | Charles Nehri | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 | Charles Nehri'nden (Wilmington, MA) elde edilmiştir. Sıçanlar 4 haftalıkken alındı ve ötenaziye kadar (15-19 haftalık) Purina 5008 ile beslendi. Çalışmada kullanılan tüm FA / FA sıçanlarında glikoz seviyeleri (lateral safen veninden gelen kan) 300 mg / dL'den yüksekti. Tüm hayvanlar, 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsü ile sıcaklık kontrollü bir ortamda barındırıldı ve ad libitum ile beslendi. |
Kaynaklar
- Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
- Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
