Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aldehit Dehidrogenaz 1A1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için AlDeSense'in uygulanması

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64713

⸱

31 Mart 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Biochemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 4Cancer Center of Illinois, University of Illinois Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Canlı hücrelerde ALDH1A1 aktivitesini ölçme yöntemleri, köklülüğün biyobelirteci olarak statüsü nedeniyle kanser araştırmalarında kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde ALDH1A1 aktivitesinin göreceli seviyelerini belirlemek için izoform seçici bir florojenik prob kullandık.

Özet

Kanser tedavisinden sonra nüks genellikle kanser kök hücreleri (CSC'ler) olarak bilinen tümör hücrelerinin bir alt popülasyonunun kalıcılığına atfedilir ve bunlar dikkat çekici tümör başlatıcı ve kendini yenileme kapasiteleri ile karakterize edilir. Tümörün kökenine (örneğin, yumurtalıklar) bağlı olarak, CSC yüzey biyobelirteç profili önemli ölçüde değişebilir, bu da bu tür hücrelerin immünohistokimyasal boyama yoluyla tanımlanmasını zorlu bir çaba haline getirir. Aksine, aldehit dehidrogenaz 1A1 (ALDH1A1), CSC'ler de dahil olmak üzere hemen hemen tüm progenitör hücrelerde korunmuş ekspresyon profili nedeniyle, CSC'leri tanımlamak için mükemmel bir belirteç olarak ortaya çıkmıştır. ALDH1A1 izoformu, çeşitli endojen ve ksenobiyotik aldehitlerin karşılık gelen karboksilik asit ürünlerine oksidasyonundan sorumlu olan 19 enzimden oluşan bir süper aileye aittir. Chan ve ark. yakın zamanda ALDH1A1 aktivitesinin tespiti için izoform seçici bir "açma" probu olan AlDeSense'i ve ayrıca hedef dışı boyamayı hesaba katmak için reaktif olmayan bir eşleştirme kontrol reaktifini (Ctrl-AlDeSense) geliştirdi. Bu izoform seçici aracın, K562 miyelojen lösemi hücrelerinde, mamosferlerde ve melanom kaynaklı CSC ksenogreftlerinde ALDH1A1 aktivitesinin tespiti yoluyla çok yönlü bir kimyasal araç olduğu zaten gösterilmiştir. Bu makalede, probun faydası, beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde göreceli ALDH1A1 aktivitesinin belirlendiği ek florimetri, konfokal mikroskopi ve akış sitometri deneyleri ile gösterilmiştir.

Giriş

Kanser kök hücreleri (CSC'ler), kök hücre benzeri özellikler sergileyen tümör hücrelerinin bir alt popülasyonudur1. Kanserli olmayan meslektaşlarına benzer şekilde, CSC'ler kendini yenilemek ve çoğalmak için olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. ATP bağlayıcı kaset taşıyıcılarının yukarı regülasyonu gibi diğer yerleşik mekanizmalarla birlikte, CSC'ler genellikle ilk cerrahi debulking çabalarından ve sonraki adjuvan tedaviden2 korunur. Tedavi direnci3, nüks4 ve metastaz5'teki kritik rolleri nedeniyle, CSC'ler kanser araştırmalarında bir öncelik haline gelmiştir. CSC'leri tanımlamak için kullanılabilecek çeşitli hücre yüzey antijenleri (örneğin, CD133) olmasına rağmen, 6, sitoplazmada bulunan aldehit dehidrojenazların (ALDH'ler) enzimatik aktivitesinden yararlanmak çekici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır7. ALDH'ler, reaktif endojen ve ksenobiyotik aldehitlerin karşılık gelen karboksilik asit ürünlerine oksidasyonunu katalize etmekten sorumlu 19 enzimin bir üst ailesidir8.

Genel olarak, aldehit detoksifikasyonu, hücreleri istenmeyen çapraz bağlanma olaylarından ve kök hücre bütünlüğüne zarar verebilecek oksidatif stresten korumada çok önemlidir9. Dahası, 1A1 izoformu retinoik asit metabolizmasını kontrol eder ve bu da retinaldehit sinyali10 yoluyla gövdeyi etkiler. ALDH1A1 aktivitesini seçici olarak tespit etmek için küçük moleküllü aktivite tabanlı bir algılama (ABS) probu olan AlDeSense 11,12, yakın zamanda geliştirilmiştir. ABS tasarımları, bağlayıcı bir olaydan ziyade kimyasal bir değişiklik yoluyla analit tespiti yaparak, yüksek seçiciliğe ve hedef dışı tepkilerin azalmasına izin verir13,14,15,16. İzoform seçici florojenik probun tasarım prensibi, prob18'in floresan imzasını bastırmaya yarayan aldehit fonksiyonel grubundan kaynaklanan bir donör-fotoindüklenmiş elektron transferi (d-PeT) söndürme mekanizması17'ye dayanır. ALDH1A1 aracılı karboksilik aside dönüştürüldükten sonra, yüksek floresan bir ürün elde etmek için ışınımsal gevşemenin kilidi açılır. D-PeT söndürme hiçbir zaman% 100 verimli olmadığından, olası yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek artık floresan, bu tahlili oluştururken, eşleşen fotofiziksel özelliklere (örneğin, kuantum verimi) ve hücrelerde aynı sitoplazmik boyama modeline sahip yanıt vermeyen bir reaktif olan Ctrl-AlDeSense'in geliştirilmesi yoluyla göz önünde bulundurulmuştur. Birlikte kullanıldığında, bu benzersiz eşleştirme, yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri, florimetri, moleküler görüntüleme ve akış sitometrisi yoluyla düşük seviyeler sergileyenlerden güvenilir bir şekilde ayırt edebilir. Birçok önemli avantaj, geleneksel immünohistokimyasal yöntemlere göre izoform seçici aktive edilebilir boyaların kullanımı ile ilişkilidir. Örneğin, CSC'lerin bir tümörün derinliklerine gömüldüğü varsayılmıştır ve bu nedenle büyük antikorlara göre küçük bir molekül için daha erişilebilirdir19. Ek olarak, ters çevrilmiş floresan ürün herhangi bir hücresel bileşeni kovalent olarak değiştirmez, yani bir CSC'yi değiştirilmemiş bir durumda bırakmak için yıkama döngüleri yoluyla kolayca çıkarılabilir. Son olarak, açılma yanıtı, NAD + kofaktörüne olan bağımlılığı nedeniyle, MTT testi gibi, yalnızca canlı hücreleri ve işlevleri tanımlar.

figure-introduction-1
Şekil 1: AlDeSense'in floresan açılımını gösteren şematik. İzoform seçici boya, ALDH1A1 tarafından aktive edilir ve yumurtalık kanseri hücrelerinde yüksek ALDH1A1 aktivitesini florimetri, moleküler görüntüleme ve akış sitometrisi yoluyla tanımlamak için kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Geçmiş çalışmalarda, izoform seçici florojenik prob testi, K562 insan kronik lösemi hücrelerinde, MDA-MB-231 insan meme kanseri hücrelerinde ve B16F0 murin melanom hücrelerinde ALDH düşük (ALDH-) hücrelerden ALDH yüksek (ALDH +) hücrelerini başarıyla tabakalaştırdı. Bu önemlidir, çünkü birçok kanser türü için yüksek ALDH1A1 protein ekspresyonu daha kötü bir klinik prognozu gösterir20. Bu, yüksek ALDH1A1 seviyelerinin, tedaviden kaçabilen, direnç geliştirebilen ve vücuda yayılabilen CSC'lerin göstergesi olduğunu varsaymaktadır. Bununla birlikte, yumurtalık kanseri durumunda, tam tersi bulguyu bildiren çalışmalar vardır (yüksek ALDH1A1 ekspresyonu, hasta sağkalımının iyileşmesi ile bağlantılıdır)21,22,23,24. Bu ilk bakışta çelişkili görünse de, ekspresyon mutlaka tümör mikroortamındaki değişikliklerden (örneğin, pH akısı, oksijen gradyanları), NAD + kofaktör veya aldehit substratlarının mevcudiyeti, karboksilik asit seviyeleri (ürün inhibisyonu) ve enzim aktivitesini değiştirebilen translasyonel sonrası modifikasyonlardan etkilenebilecek enzim aktivitesi ile ilişkili değildir25 . Ek olarak, yumurtalık kanseri beş ana histolojik tipe (yüksek dereceli seröz, düşük dereceli seröz, endometrioid, berrak hücreli ve müsinöz) ayrılır ve bunların ALDH1A1 aktivitesinin değişken seviyelerine sahip olacağını varsayıyoruz26. Yumurtalık tümörlerinde ALDH1A1 aktivitesini araştırmak amacıyla, yukarıda belirtilen farklı histolojik tiplere ait beş yumurtalık kanseri hücre hattından oluşan bir panelde ALDH1A1 + popülasyonlarını tanımlamak için izoform seçici bir florojenik prob testi kullanılmıştır. Bu çalışmada test edilen hücre hatları, berrak hücreli ve seröz histotipleri kapsayan BG-1, Caov-3, IGROV-1, OVCAR-3 ve PEO4 hücrelerini içerir. Burada, probun çok yönlülüğü ve genellenebilirliği, diğer ölümsüzleştirilmiş kanser hücre hatlarında ve hasta örneklerinde benzer çalışmalar yapmak isteyen araştırmacılar için CSC'leri tanımlamak için vurgulanmıştır. AlDeSense'in kullanımı, karmaşık doku mikro ortamlarında CSC bakımında yer alan biyokimyasal yollara ışık tutacak ve potansiyel olarak prognozu belirlemek ve kanser saldırganlığını ölçmek için klinik bir araç olarak hizmet edecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Florimetri ile yumurtalık kanseri hücre homojenatlarında toplam ALDH1A1 aktivitesini ölçün

  1. Aşağıdaki hücre kültürü ortamının 5 mL'sinde bir T25 hücre kültürü şişesinde 1 × 106 hücreyi çözün:
    1. IGROV-1 ve PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyeri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S).
    2. BG-1 ve Caov-3: Dulbecco'nun %10 FBS ve %1 P/S ile Modifiye Kartal Ortamı (DMEM).
    3. OVCAR-3:% 20 FBS,% 1 P / S ve 0.01 mg / mL insülin ile RPMI 1640.
  2. Hücreleri bir inkübatörde iki ila üç geçiş için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Hücrelerin geçmeden önce% 80-90 akıcılığı geçmediğinden emin olun.
  3. Hücreleri 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin içinde tripsin haline getirin, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve 5 dakika boyunca 25 ° C'de santrifüjleme (180 × g) yoluyla pelet 1 ×10 7 hücre.
  4. Süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice çıkarın, peleti 1 mL 1x PBS'de hücreleri yeniden askıya alarak yıkayın ve adım 4'te tarif edildiği gibi aynı koşullar altında santrifüjleme yoluyla hücreleri yeniden pelet edin.
  5. Hücreleri 1x PBS'de 1x proteaz inhibitörü çözeltisinde yeniden askıya alın. 2.5 × 106 hücre başına bu çözeltinin 1 mL'sini kullanın.
  6. Bir hücre homojenizatör probu ile hücre süspansiyonunu 2 dakika (1 s darbe,% 40 genlik) boyunca buz üzerinde sonikleştirin.
  7. 15 dakika boyunca 25 °C'de santrifüjleme yoluyla (3.200 × g) pelet çözünmez/membran fraksiyonları. Süpernatanı çıkarın ve saklayın, çünkü bu sonraki adımlarda kullanılacak homojenattır. Deneyi üçlü olarak gerçekleştirmek için homojenatları üç küvete ayırın.
  8. 4 μM'lik nihai prob konsantrasyonunu elde etmek için probu homojenata ekleyin. çözeltiyi iyice karıştırmak için pipeti üç kez yukarı ve aşağı indirin.
  9. Floresan sinyalini ilaveden hemen sonra ve bir florimetre üzerinde istenen inkübasyon sürelerinden sonra ölçün. Kuluçka süresi, maksimum kıvrım açılımını görmek için optimize edilebilir (bu deneyde 1 saat). Kuluçka süresi, karşılaştırılan tüm hücre hatları boyunca sabit olmalıdır.
    1. Uyarma dalga boyunu 496 nm olarak ayarlayın.
    2. Emisyonu 510-600 nm olarak ayarlayın.
    3. Yarık genişliğini 0,5 mm'ye ayarlayın.
    4. Çözeltiyi 1 mL'lik bir kuvars küvete pipetleyin, florimetreye yerleştirin ve taramaya basın.
  10. İzoform seçici boyanın kıvrım aktivasyonunu belirlemek için 516 nm'deki (maksimum floresan dalga boyu) son floresan yoğunluğunu, ilk okumadan aynı dalga boyundaki yoğunluğa bölün.

2. Yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri görüntülemek için floresan mikroskobu kullanımı

  1. 1 × 106 hücreyi, uygun hücre kültürü ortamının 5 mL'sinde bir T25 hücre kültürü şişesinde çözün.
  2. Hücreleri bir inkübatörde iki ila üç geçiş için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Hücrelerin geçmeden önce% 80-90 akıcılığı geçmediğinden emin olun.
  3. Konfokal görüntülemeden bir gün önce, 8 delikli bir odacıklı slaytta plaka 4 × 105 hücre.
    1. Her bir kuyucuğun tabanını 10 dakika boyunca poli-L-lizin (0.1 mg / mL, kuyucuk başına 100 μL) ile kaplayın, daha sonra aspire edin.
    2. Hücre kültürü sınıfı su (kuyucuk başına 100 μL) ekleyerek ve aspire ederek her bir kuyuyu 3 kez yıkayın.
    3. Hücreleri 10 dakika boyunca% 0.25 tripsin içinde tripsin haline getirin, otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın ve hücreleri kuyucuk başına 4 × 105 hücrede plakalayın.
    4. Hücrelerin bir gecede yerleşmesine ve bağlanmasına izin verin (12-16 saat).
  4. Büyüme ortamını aspire edin ve 2 μM prob veya kontrol probu ile desteklenen serumsuz ortam (kuyucuk başına 500 μL) ekleyin.
  5. Prob ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri hemen görüntüleyin.
  6. Konfokal mikroskobu açın ve numune için ayarlayın.
    1. Numuneyi en düşük büyütmede dikkatlice yükleyin; Doğru konumlandırmayı sağlamak için hücreleri bulun.
    2. Objektif lensin 10x büyütmede olduğundan emin olun ve hücreleri bulun.
  7. Bu deney için FITC kanalı (uyarma: 488 nm lazer; emisyon: 516-521 nm) ve T-PMT (iletilen ışık) kanalı gereklidir. Önyargıyı ortadan kaldırmak için deneyin tamamı boyunca aynı z-düzlemine odaklanmak için T-PMT kullanarak hücreleri bulun ve bunlara odaklanın.
  8. Lazer gücünü ve FITC kazancını, AlDeSense örneklerinde sinyal görmeye devam ederken Ctrl-AlDeSense örneklerinden gelen sinyalin minimum düzeyde algılanabildiği uygun ayara ayarlayın. Her parametre, ilgili çubuğu kaydırarak ayarlanabilir. Doğru parametreleri tanımlamak için ayarların birkaç kez ayarlanması gerekebilir. Optimize edildikten sonra, aynı parametreleri kullanarak denemenin geri kalanını bu hücre satırında tamamlayın.
  9. Tedavi koşulu başına toplam üç kuyucuk için kuyu başına üç görüntü çekin (toplamda dokuz görüntü). Floresan kanalını veya birleştirilmiş görüntüyü kullanmak yerine önyargıyı önlemek için T-PMT kullanarak uygun düzleme odaklanın.
  10. ALDH1A1+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için görüntüleri işleyin.
    1. Görüntü işleme yazılımını kullanarak, czi dosyasını farklı kanallara bölün.
    2. Toplam hücre sayısını ve toplam floresan hücre sayısını sayın.
    3. ALDH1A1+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için, floresan hücrelerin sayısını her görüntüdeki toplam hücre sayısına bölün. Görüntüleri manipüle etmeden her görüntü için aynı şekilde saymak zorunludur, çünkü örneğin, parlaklığı ayarlamak kafa karıştırıcı bir değişken ekleyebilir.

3. Yüksek ALDH1A1 aktivitesine sahip hücreleri tanımlamak için akış sitometrisinin uygulanması

  1. 1 × 106 hücreyi, uygun hücre kültürü ortamının 5 mL'sinde bir T25 hücre kültürü şişesinde çözün.
  2. Hücreleri bir inkübatörde iki ila üç geçiş için 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun. Hücrelerin geçmeden önce% 80-90 akıcılığı geçmediğinden emin olun.
  3. 15 mL'lik bir santrifüj tüpündeki hücreleri santrifüj yoluyla (180 × g) 25 ° C'de 5 dakika boyunca tripsiniz, sayın ve pelet edin.
  4. PBS'de 1 mL 2 μM prob / kontrol probu çözeltisi içindeki hücreleri yeniden askıya alın. Boyaya eşit maruz kalmasını sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sallayın.
  5. Kuluçka döneminden sonra, hücreleri santrifüjleme yoluyla (180 × g) 25 ° C'de 5 dakika boyunca pelet edin. Hücreleri 0.5 mL PBS'de yeniden askıya alın. Akış sitometresini tıkayabilecek hücre kümelerini çıkarmak için hücreleri bir hücre süzgecinden (35 μm naylon ağ) geçirin. Hücreleri hemen buzun üzerine yerleştirin.
  6. Cihazı açın ve başlatma protokolünü çalıştırın.
  7. Kılıf sıvısı ve boş atık olup olmadığını kontrol edin.
  8. Hatları her biri 5 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu ve su ile çalıştırın.
  9. Düzgün çalışmasını sağlamak için kalite kontrol boncuklarını çalıştırın.
  10. Ayarlar sekmesinde, floresan filtresi için FSC (ileri saçılma), SSC (yan saçılma) ve FITC (floresein izotiyosiyanat) seçeneklerini belirleyin.
  11. Canlılık, tekli ve floresan için aşağıdaki grafikleri çizin. Lazer gücünü (kullanıcının cihazına özgü) optimize edin, böylece hücre popülasyonları daha fazla analiz için verilen parametreler dahilinde olur.
    1. FSC-A ve SSC-A dağılım grafiği: ana hücre popülasyonu grafiğin merkezine yakındır.
    2. FSC-A ve FSC-W dağılım grafiği: teklilerin göstergesi olan dar yatay bant (hücre kümeleri yerine).
    3. FITC-A ve FSC-A saçılma grafiği: izoform seçici florojenik açma probu tarafından sıralanan hücrelerin dağılımını gözlemleyin.
    4. FITC-A histogramı: ALDH1A1+ hücrelerinin yüzdesini belirlemek için FITC'ye dayalı popülasyondaki değişimi gözlemleyin.
  12. FITC lazer gücünü optimize etmek için, histogram eğrisinin sağ kuyruğu maksimum FITC-A sinyaline yakın olacak şekilde probla bir numune çalıştırın. Daha sonra, kontrol probu ile bir numune çalıştırın. Maksimum dinamik aralığı ortaya çıkarmak için bir popülasyon kayması gözlemlenebilir olmalıdır. Lazer gücü optimizasyonu adımının birden çok kez tekrarlanması gerekebilir, ancak bir deney için bir ayar belirlendikten sonra lazer gücü numuneler arasında değiştirilmemelidir.
  13. Her örneği 10.000 sayım için çalıştırın (üçlü olarak yapılır).
  14. Her hücre satırı için adım 3.12'yi tekrarlayın, çünkü alım ve ALDH1A1 aktivitesinde değişkenlik olacaktır.
  15. Numune toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hatları her biri 5 dakika boyunca %10 ağartıcı ve su ile çalıştırın, ardından cihazın kapatılmasını başlatın.
  16. Akış sitometri yazılımını kullanarak verileri işleyin ve istenen hücre popülasyonunu açın. Kapıları, tüm olaylar ALDH1A1- veya ALDH1A1+ kapısına düşecek şekilde ayarlayın. Dikdörtgen kapı seçimini kullanarak, ALDH1A1- kapısını, kontrol probu örneklerindeki olayların %>99,5'i bu kapı içinde gerçekleşecek şekilde ayarlayın. Kalan hücreler ALDH1A1+ olarak kabul edilecektir. Bu aynı kapılar daha sonra ALDH1A1- ve ALDH1A1+ olarak kabul edilen olayların sayısını ölçmek için prob örneğine uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yumurtalık kanseri hücre homojenatlarının toplam ALDH1A1 aktivitesi
Bu tahlilden elde edilen her hücre hattı için ortalama kıvrım dönüşleri şunlardır: BG-1 (1.12 ± 0.01); IGROV-1 (1.30 ± 0.03); Caov-3 (1.72 ± 0.06); PEO4 (2,51 ± 0,29); ve OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (Şekil 2).

figure-results-1
Şekil 2: ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Pan-seçicilik, birçok ALDH probunun önemli bir sınırlamasıdır; Bununla birlikte, son zamanlarda birkaç izoform seçici örnek bildirilmiştir 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. Bu çalışmada kull...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

AlDeSense teknolojisi için bekleyen bir patenti (US20200199092A1) açıklıyoruz.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JC'ye R35GM133581) ve Illinois Lisansüstü Bursu'ndaki Kanser Merkezi (SG'ye verildi) tarafından desteklenmiştir. JC, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı'na destekleri için teşekkür eder. Yazarlar, Dr. Thomas E. Bearood'a AlDeSense ve AlDeSense'nin stoklarının hazırlanmasına yaptığı ilk katkı için teşekkür eder. Oliver D. Pichardo Peguero ve Joseph A. Forzano'ya çeşitli sentetik öncüllerin hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Caov-3, IGROV-1 ve PEO4 hücreleri için Prof. Dr. Erik Nelson'a (Moleküler ve Bütünleştirici Fizyoloji Anabilim Dalı, UIUC) teşekkür ederiz. BG-1 hücreleri için Prof. Paul Hergenrother'e (UIUC Kimya Bölümü) teşekkür ederiz. Carl R. Woese Genomik Biyoloji Enstitüsü'ndeki Temel Tesislere, Zeiss LSM 700 Konfokal Mikroskop ve ilgili yazılıma erişim için teşekkür ederiz. BD LSR II CMtO Analizörüne erişim için Flow Sitometri Tesisi'ne teşekkür ederiz. Dr. Sandra McMasters'a ve Hücre Medyası Tesisi'ne hücre kültürü medyasının hazırlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  Kalsiyum, Magnezyum ve Sodyum Bikarbonat içermeyen HBSS'de %0.25 Tripsin, %0.1 EDTACorning    25-050-CI
1x Fosfat Tampon SalinCorning21-040-CMX12
AccuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
AlDeSenseSentezlenmiş şirket içi
BG-1Prof. Paul Hergenrother Lab, Illinois Üniversitesi Urbana-Champaign BioLite tarafından sağlanan bir hediye
25cm2 ŞişeTermo Fisher Bilimsel 
Biyogüvenlik Kabini 1300 serisi A2Thermo Fisher Scientific 
Caov-3Prof. Erik Nelson Lab, Illinois Üniversitesi tarafından sağlanan bir hediye Urbana-Champaign
Hücre homojenizatörüFisher Bilimsel
Santrifüj 5180REppendorf22627040
Contrl-AlDeSenseSentezlenmiş kurum içi
DMEM, %10 FBS, %1 P/SUIUC hücresi tarafından hazırlanmıştır. medya tesisi
Falcon Hücre Süzgeci Geçmeli Kapaklı Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpleri, 5 mLCorning352003
FCS Express 6UIUC CMtO
FL mikroskobuEVOS
FlorometreFoton Teknolojisi Uluslararası
Forma Serisi II Su Ceketli CO2  Kuluçkamakinesi Fisher Scientific3110
IGROV-1Prof. Erik Nelson Lab, Illinois Üniversitesi Urbana-Champaign tarafından sağlanan bir hediye
ImageJNIH
Innova 42R İnkübe Çalkalayıcı
LSM 700Zeiss
LSR IIBD
Nunc Lab-Tek Odacıklı # 1.0 Borosicilat Kapak Camı SistemiThermo Fisher Scientific 
OVCAR-3ATCCHTB-161
PEO4Illinois Üniversitesi Prof. Erik Nelson Laboratuvarı tarafından sağlanan bir hediye Urbana-Champaign
Pierce Proteaz İnhibitörü TabletleriThermo ScientificA32963
Poli-L-LizinCultrex3438-100-01
RockerVWR
RPMI, %10 FBS, %1 P/SUUCUC hücre ortamı tesisi tarafından hazırlanmıştır
RPMI, %20 FBS, %1 P/S, 0.01 mg/mL İnsülinUIUC hücre ortamı tesisi tarafından hazırlanmıştır
130189155383

Kaynaklar

  1. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
  2. Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).
  3. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  4. Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment. Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).
  5. Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis. Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).
  6. Kim, W. T., Ryu, C. J. Cancer stem cell surface markers on normal stem cells. BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).
  7. Pors, K., Moreb, J. S. Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development. Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).
  8. Jackson, B., et al. Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily. Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).
  9. Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism. Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).
  10. Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
  11. Anorma, C., et al. Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1. ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).
  12. Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity. Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).
  13. Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging. Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).
  14. East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging. Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).
  15. Yadav, A. K., et al. Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide. ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).
  16. Yadav, A. K., et al. An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells. Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).
  17. Ueno, T., et al. Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein. Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).
  18. Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).
  19. Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).
  20. Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform. Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).
  21. Meng, E., et al. ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling. PLoS One. 9 (9), e107142(2014).
  22. Kaipio, K., et al. ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors. The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).
  23. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers. PLoS One. 5 (4), e10277(2010).
  24. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).
  25. Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity. Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).
  26. Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).
  27. Tulake, W., et al. Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma. Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).
  28. Nwani, N. G., et al. A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer. Cancers. 11 (4), 502(2019).
  29. Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathology. 73, 1-6 (2018).
  30. Landen Jr, C. N., et al. Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).
  31. Condello, S., et al. β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids. Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).
  32. Storms, R. W., et al. Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).
  33. Duellman, S. J., et al. A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity. Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).
  34. Minn, I., et al. A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase. Nature Communications. 5, 3662(2014).
  35. Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).
  36. Yagishita, A., et al. Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells. Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).
  37. Maity, S., et al. Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer. Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).
  38. Koenders, S. T. A., et al. Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells. ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).
  39. Oe, M., et al. Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells. ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).
  40. Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells. Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).
  41. Okamoto, A., et al. Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1. Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kanser K k H creleriALDH1A1 AktivitesiAlDeSense ProbuAk SitometrisiKonfokal MikroskopiK k H cre BiyobelirteciH cre Pop lasyonu GatingiFlorojenik Prob
Aldehit Dehidrogenaz 1A1 aktivitesine dayalı yumurtalık kanseri hücrelerini tabakalaştırmak için AlDeSense'in uygulanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.