Method Article

Fare Koroid Pleksusunun Mikrodiseksiyonu ve Tüm Montajlı Taramalı Elektron Mikroskobu Görselleştirmesi

DOI:

10.3791/64733

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörobilimde az çalışılmış bir doku olan koroid pleksus (SP), merkezi sinir sisteminin sağlığında ve hastalığında önemli bir rol oynar. Bu protokol, SP'yi izole etmek için bir mikrodiseksiyon tekniğini ve hücresel yapısının genel bir görünümünü elde etmek için taramalı elektron mikroskobunun kullanımını açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beynin ventriküllerine çıkıntı yapan oldukça vaskülarize bir yapı olan koroid pleksus (SP), nörobilimde en az çalışılan dokulardan biridir. Bu küçük yapının merkezi sinir sisteminin (CNS) sağlığı ve hastalığında çok önemli bir rol oynadığı giderek daha açık hale geldiğinden, SP'nin beyin ventriküllerinden düzgün bir şekilde diseke edilmesi, fonksiyonel analizden yapısal analize kadar aşağı akış işlemeye izin verecek şekilde son derece önemlidir. Burada, lateral ve dördüncü beyin ventrikül faresi CP'nin özel alet veya ekipmanlara ihtiyaç duymadan izolasyonu açıklanmaktadır. Bu izolasyon tekniği, SP içindeki hücrelerin canlılığını, işlevini ve yapısını korur. Yüksek vaskülarizasyonu nedeniyle, SP bir binoküler mikroskop kullanılarak beynin ventrikül boşlukları içinde yüzerken görselleştirilebilir. Bununla birlikte, aşağı akış analizi için gerekli olan transkardiyal perfüzyon, SP dokusunun tanımlanmasını zorlaştırabilir. Daha sonraki işleme adımlarına (örneğin, RNA ve protein analizi) bağlı olarak, bu, SP'yi bromofenol mavisi ile transkardiyal perfüzyon yoluyla görselleştirerek çözülebilir. İzolasyondan sonra, SP, bu özel beyin yapısının işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için RNA, protein veya tek hücre analizi de dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak işlenebilir. Burada, yapının genel bir görünümünü elde etmek için tüm montaj CP'sindeki taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıkı bariyerler, merkezi sinir sistemini (CNS), kan-beyin bariyeri (BBB) ve kan-beyin omurilik sıvısı (BOS) bariyeri dahil olmak üzere çevreden ayırır. Bu engeller CNS'yi dış hakaretlere karşı korur ve dengeli ve kontrollü bir mikro çevre sağlar 1,2,3. BBB zaman içinde kapsamlı bir şekilde çalışılmış olsa da, koroid pleksusta (SP) bulunan kan-BOS bariyeri sadece son on yılda artan araştırma ilgisi kazanmıştır. Bu son bariyer beynin dört ventrikülünde bulunabilir (Şekil 1A, B) ve merkezi bir stroma, sızdıran kılcal damarlar, fibroblastlar ve bir l....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan deneyleri ulusal (Belçika Kanunu 14/08/1986 ve 22/12/2003, Belçika Kraliyet Kararnamesi 06/04/2010) ve Avrupa mevzuatına (AB Direktifleri 2010/63/EU, 86/609/EEC) göre gerçekleştirilmiştir. Fareler ve hayvan protokolleri üzerindeki tüm deneyler Ghent Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanmıştır (izin numaraları LA1400091 ve EC 2017-026).

1. Hazırlık

  1. Anestezikler: Bir terminal anestezi hazırlayın. Örneğin, fosfat tamponlu salin (PBS) içinde bir sodyum pentobarbital (≥100 mg / kg) çözeltisi hazırlanabilir.
  2. Transkardiyal perfüzyon çözeltisi: % 0.5 bromofenol mavisi il....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarif edilen protokol, SP'nin fare beyni lateral (Şekil 2A-C) ve dördüncü (Şekil 2D-F) ventriküllerinden etkili bir şekilde izole edilmesini kolaylaştırır. Tüm beyni izole ettikten sonra, forsepsler beyni sagittal olarak hemiseke etmek ve lateral ventriküllerde yüzen CP'leri tanımlamak için kullanılır. Dördüncü ventrikülden SP, beynin serebellar tarafından izole edilebilir. Bromofenol mavisi ile.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, koroid pleksusun (SP) lateral ventrikülden ve bir fare beyninin dördüncü ventrikülünden izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. SP'nin tüm bu montaj yöntemi, CP morfolojisinin, hücresel kompozisyonun, transkriptomun, proteomun ve sekretomun tam bir görünümünü elde etmek için bir teknik repertuarı kullanarak daha fazla analizi kolaylaştırır. Bu tür analizler, beynin ventriküllerinden çıkıntı yapan bu olağanüstü yapıyı daha iyi anlamak için çok önemlidir. Bu bilgi, SP'nin sağlıkve hastalık.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Belçika Alzheimer Araştırma Vakfı (SAO; proje numarası: 20200032), Flanders Araştırma Vakfı (FWO Vlaanderen; proje numaraları: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) ve Baillet Latour Fonu tarafından desteklenmiştir. VIB BioImaging Core'a eğitim, destek ve enstrüman parkına erişim için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
26G x 1/2 iğneHenke Sass Wolf4710004512
Alüminyum numune bağlantılarıEM Sciences75220
Kakodilat tamponuEM Sciences11652
Karbon çeliği cerrahi bıçaklarSwann-Morton0210boyut: 0,45 mm x 12 mm
Karbon yapışkan tırnaklar -12 mmEM Sciences77825-12
Kritik nokta kurutucu Bal-Tec CPD030
Kiriş 540ZeissSEM sistemi
ForsepsGüzel Bilim Araçları GmbH 91197-00
GluteraldehitEM Bilimleri16220
HeparinSigma-AldrichH-3125
Ismatec Reglo ICC Dijital Peristaltik pompa 2 kanallıMetrohm Belçika NVCPA-7800160
Osmiyum Tetroksit ve nbsp;EM Sciences19170
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148
Fosfat tamponlu salin (PBS)LonzaBE17-516F
Platin Karar yeter sayısı Q150T ESPBS, Ca++, Mg++ veya fenol kırmızısı içermez; steril filtreli
Sodyum pentobarbitalKela NV514
Numune Sepeti Paslanmaz ÇelikEM Sciences70190-01
Stemi DV4 Stereo mikroskopZeiss
Cerrahi makasFine Science Tools GmbH 91460-11

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Choroid PlexusMicrodissection TechniqueMouse Brain VentriclesScanning Electron MicroscopyWhole Mount SEMTranscardial PerfusionBromophenol Blue StainingChoroid Plexus IsolationMorphological AnalysisEpithelial Cells

Related Articles