Yöntem makalesi

Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması

DOI:

10.3791/64734

⸱

7 Nisan 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, X kromozomal anomalileri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki over hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için floresan in situ hibridizasyona dayalı iki yöntem sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya çapında milyonlarca insan doğurganlıkla ilgili sorunlarla uğraşmaktadır. Azalmış doğurganlık, hatta infertilite, kromozomal anormalliklerin en yaygın olduğu genetik bozukluklar da dahil olmak üzere birçok farklı nedenden kaynaklanabilir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), insanlarda kromozomal anormallikleri tespit etmek için iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. FISH esas olarak sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerin spermatozoasındaki kromozomal anormalliklerin analizi için kullanılır. Ayrıca, bu teknik, yumurtalık disgenezine neden olduğu bilinen X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için kadınlarda da sıklıkla uygulanır. Bununla birlikte, lenfositlerde ve / veya bukkal hücrelerde X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında bilgi hala eksiktir.

Bu çalışmanın amacı, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için FISH'e dayalı iki yöntem sunarak kadınlarda X kromozomal anormallikleri ile ilgili temel araştırmaları ilerletmektir. İlk olarak, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan aşılanmamış yumurtalık korteks dokusunda izole yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza hücreleri ve stromal hücreler) X kromozomal içeriğini belirlemek için bir yöntem tanımlanmıştır. İkinci yöntem, uzun süreli aşılamadan sonra X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan immün sistemi baskılanmış farelere yumurtalık dokusunda yeni oluşan sekonder ve antral foliküllerin yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirleyerek kromozomal anormalliklerin folikülogenez üzerindeki etkisini değerlendirmeye yöneliktir. Her iki yöntem de X kromozomal anormallikleri olan kadınların üreme potansiyeli hakkında fikir edinmek için gelecekteki araştırmalarda yardımcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kısırlık, erkek veya kadın üreme sisteminin bir sağlık sorunudur ve dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 186 milyon bireyi etkilemektedir1. İnfertil çiftlerin en az% 35'inde infertilite, kadın üreme sisteminin bir bozukluğundan kaynaklanır2. Kadın infertilitesine neden olabilecek genetik faktörler, genital sistem anormallikleri, endokrin disfonksiyon, inflamatuar hastalıklar ve iyatrojenik tedavi gibi birçok faktör vardır3.

İnfertil kadınların yaklaşık %10'unda genetik anormallikler mevcuttur 4,5. Tüm genetik anormallikler arasında, X kromozomu anormallikleri yumurtalık disgenezisinin en yaygın nedenidir2. Birçok çalışma, Turner sendromu (TS) veya Triple X sendromlu kadınlarda X kromozomal anormalliklerinin, germ hücrelerinin hızlandırılmış kaybı veya bozulmuş oogenez 6,7,8 nedeniyle erken yumurtalık yetmezliği ile ilişkili olduğunu bildirmiştir.

X kromozomunun anormallikleri ayrılabilir: 1) X kromozomlarının sayısının farklı olduğu ancak X kromozomlarının sağlam olduğu sayısal sapmalar; ve 2) X kromozomunun genetik materyal kazandığı veya kaybettiği yapısal sapmalar 3,9. X kromozomunun sayısal anormallikleri yapısal anormalliklerden daha yaygındır ve genellikle hücre bölünmesi sırasındaki kendiliğinden hatalardan kaynaklanır 3,9. Mayoz sırasında böyle bir hata meydana geldiğinde, anöploid gametlere ve nihayetinde tüm hücrelerde kromozomal anormallikleri olan yavrulara yol açabilir. Ontogenezin erken evrelerinde mitoz sırasında meydana gelen hataların bir sonucu olarak somatik hücrelerde kromozom kusurları ortaya çıktığında, mozaikliğe yol açabilir. Bu bireylerde hem normal X kromozomal içeriğine sahip hücreler hem de X kromozomal anormalliklerine sahip hücreler mevcuttur.

1980'lerde, metafaz ve interfaz kromozomları10,11 üzerindeki spesifik nükleik asit dizilerini görselleştirmek ve bulmak için floresan in situ hibridizasyon (FISH) adı verilen sitogenetik bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, kromozomdaki belirli bir diziye bağlanmak için floresan etiketli DNA problarını kullanır ve daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.

Günümüzde, FISH klinik bir tanı aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve kromozomal anormalliklerin saptanmasında altın standart olarak kabul edilmektedir10. Üreme tıbbı alanında, sperm üzerindeki FISH analizi, somatik hücrelerde sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerde spermatozoanın X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır12,13,14. Bu çalışmalar, kromozomal anormallikleri olan erkeklerin, normal karyotipli erkeklere kıyasla menilerinde bulunan anöploid spermatozoa sıklığının daha yüksek olduğunu göstermiştir 12,13,14.

Spermatozoanın aksine, kromozomal anormalliği olan bireylerde yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza / teka hücreleri ve stromal hücreler dahil) X kromozomal içeriği ve bu hücrelerin anöploidisinin üreme potansiyelleri üzerindeki olası sonuçları hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık hücrelerinin karyotipi hakkında spermatozoaya kıyasla az bilgi bulunmasının önemli bir nedeni, kadınların oosit veya yumurtalık korteks dokusu elde etmek için folikül delinmesi veya ameliyatı gibi invaziv bir prosedürden geçmek zorunda kalmalarıdır. Bu nedenle dişi gametlerin araştırma amacıyla elde edilmesi zordur.

Şu anda, Hollanda'da TS15'li genç kadınlarda yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonunun etkinliğini araştırmak için gözlemsel bir müdahale çalışması yapılmaktadır. Hastanın over korteks dokusunun bir parçası, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için mevcuttu16,17. Çalışmanın bir parçası olarak, lenfositler veya bukkal hücreler gibi yumurtalık dışı somatik hücrelerde kromozomal anormallik taşıyan kadınlarda yumurtalık hücrelerinde kromozomal anormalliklerin olup olmadığını belirlemek için ayrışmış yumurtalık korteks dokusunun FISH'ine dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Ayrıca yumurtalık hücrelerinde anöploidinin folikülogenez üzerine etkisi de belirlenmiştir. Bu amaçla, immün sistemi baskılanmış farelerde uzun süreli ksenotransplantasyon sırasında yapay olarak indüklenen folikülogenez sonrası yumurtalık korteks dokusunun histolojik kesitlerinin analizini sağlayan yerleşik bir FISH protokolü değiştirilmiştir. Bu çalışmada, X kromozomal anomalileri olan kadınlarda aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki yumurtalık hücrelerinde X kromozomal içeriğini belirlemek için FISH'e dayalı iki yöntem sunulmuş ve bu konudaki temel bilimi geliştirmek amaçlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TurnerFertility çalışma protokolü, İnsan Denekleri İçeren Araştırma Merkez Komitesi (NL57738.000.16) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada TS'li 93 kadının yumurtalık korteks dokusu elde edilmiştir. Güvenlik önlemleri gerektiren malzemeler Tablo 1'de listelenmiştir.

Tablo 1: Güvenlik önlemleri.

MalzemeTehlike
Asetik asitCiddi cilt yanıkları ve solunum sisteminin tahrişi
KollajenazGözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
cesaretGözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
DNaz IGözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
EtanolSon derece yanıcı
FormaldehitSoluma, yutma ve cilt temasından sonra toksiktir
Formamid
(floresan problarda)		Doğmamış çocuğa zarar verebilir
ArjantinGözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
MetanolSon derece yanıcıdır, soluma, yutulması ve cilt teması ile toksiktir
Nonidet P40Cildi veya gözleri tahriş eder
ArjantinGözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder
Proteinaz KSoluma sonrası solunum güçlüğü
KsilenSon derece yanıcıdır, inhalasyon ve cilt temasından sonra toksiktir. Gözlerle temasından kaçının.

Tablo 1: Güvenlik önlemi gerektiren malzemeler.

1. İzole edilmiş bireysel yumurtalık korteks hücrelerinde FISH

  1. Bireysel hücreler elde etmek için yumurtalık korteks dokusunun ayrışması
    1. Kriyoprezervasyonlu/çözülmüş yumurtalık korteks dokusunu bir neşter kullanarak yaklaşık 1 mm x 1 mm x 1 mm'lik küçük parçalara ayırın.
    2. C. histolyticum'dan 0.1 mg/mL doku ayrışma enzim karışımı, 10 μg/mL DNaz I ve 1 mg/mL kollajenaz I içeren 4 mL önceden ısıtılmış (37 °C) L15 besiyerinde doku fragmanlarını 37 °C'de maksimum 75 dakika boyunca enzimatik olarak sindirin. Çürütme karışımını her 15 dakikada bir yukarı ve aşağı doğru pipetin.
    3. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 4 mL soğuk L15 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Ayrışmış dokuyu bir kez 8 mL soğuk L15 ortamı ile 500 x g'de santrifüjleme ile yıkayın ve hücrelere zarar vermemek için vorteks olmadan 500 μL L15 ortamında tekrar askıya alın.
    4. Büyük ölçüde bireysel stromal hücreler ve küçük foliküller (tek bir granüloza hücresi tabakası ile çevrili oositler) içeren hücre süspansiyonunu plastik bir Petri kabına aktarın ve hücre süspansiyonunu stereomikroskop altında inceleyin (100x büyütme).
    5. 75 μm'lik plastik pipet kullanarak küçük folikülleri (<50 μm) manuel olarak toplayın ve foliküllerin birikmesini önlemek için folikülleri 4 °C'de %10 FBS ile desteklenmiş bir L15 ortam damlacığına aktarın. En fazla 30 dakika boyunca folikül toplama işlemini gerçekleştirin. FISH analizinden önce foliküler hücre yayılımını iyileştirmek için, saflaştırılmış folikülleri% 0.06 tripsin, 1 mg / mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mg / mL glikoz çözeltisine aktarın ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    6. Küçük foliküllerle kontaminasyonu önlemek için özel dikkat göstererek 75 μm'lik plastik pipet kullanarak korteks hücresi süspansiyonundan yumurtalık stromal hücreleri elde edin.
  2. Bireysel yumurtalık hücresinin FISH analizi
    1. Tripsin / EDTA / glikoz veya stromal hücreler (n > 1.000) ile tedavi edilen yumurtalık foliküllerini (önerilen n = 5-20) bir slayt üzerinde 5 μL 0.15 mM KCl / 15 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) damlacıklarına aktarın ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Slaytları 300 μL 0,05 mM KCl/%7,5 asetik asit/%22,5 metanol içinde oda sıcaklığında (RT) 2 dakika kurutun ve önceden sabitleyin. Fiksasyonu tamamlamak için slaytları RT'de 2 dakika boyunca metanol / asetik asit (3: 1) ile örtün.
    3. 5 L damıtılmış suya 876 g sodyum klorür ve 441 g tri-sodyum sitrat dihidrat ekleyerek 20x standart sodyum sitrat (SSC) yapın. Daha sonra, 2x SSC elde etmek için 900 mL demineralize (demi) suya 20x SSC'nin 100 mL'sini ekleyin. Numuneyi 73 °C'de 2x SSC'de yıkayın, 100 μL% 2 proteinaz K ile örtün ve bir kapak kayması ile kapatın. Slaytları hibridizasyon istasyonunda 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Kapak kapağını çıkarın ve slaytları RT'de DPBS'de 5 dakika yıkayın. Bu aşamada, malzeme henüz cam kızaklara tam olarak tutturulmamıştır ve bu nedenle bir sallama platformuna yerleştirilmemelidir.
    5. Slaytları RT'de DPBS'de 5 dakika boyunca yıkayın, ardından her biri 2 dakika boyunca% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanolde dehidrasyon yapın. Susuz bırakılmış numuneyi havayla kurutun ve floresan etiketli problarla hibritleştirin.
    6. Yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kontrol olarak X kromozomu için sentromere özgü bir prob ve başka bir kromozoma özgü sentromerik prob seçin. Bu durumda, doğrudan florokrom SpectrumGreen ile etiketlenmiş kromozom X (CEP X [DXZ1]) ve doğrudan florokrom SpectrumOrange ile etiketlenmiş kromozom 18 (CEP 18 [D18Z1]) için sentromere özgü problar kullanılır.
    7. Numuneye 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 ve 18 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hibridizasyon sırasında probun buharlaşmasını önlemek için slaytlara yapıştırılmış bir kapak kayması ile kapatın. Slaytları 3 dakika boyunca 73 ° C'de denatürasyon için hibridizasyon istasyonuna aktarın, ardından 37 ° C'de bir gece inkübasyonu sırasında hibridizasyon yapın.
    8. Hibridizasyondan sonra kapak kaymasını ve kalan yapıştırıcıyı slayttan çıkarın. Slaytları 2 dakika boyunca 72 ° C'de 0.4x SSC / % 0.3 Ara-20'de yıkayın, ardından RT'de 2x SSC /% 0.1 Ara-20'de 1 dakika inkübasyon yapın.
    9. Slaytları% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanolde 2 dakikalık inkübasyonlarla kurutun ve karanlıkta hava kurutun. Slaytları 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir montaj ortamı ile örtün. Floresan mikroskobu ile analizden önce -20 ° C'de en az 10 dakika bekletin.
  3. Görüntüleme
    1. X kromozomu için sinyalleri, bir görüntü işleme yazılımına bağlı bir floresan mikroskobu ile inceleyin.
      1. İlk olarak, florokrom DAPI'yi seçin.
        1. 630x büyütmede Yeni Hücre > Canlı > Yakalama'yı seçerek bir görüntü elde edin. Eşiği olan yeni bir pencere açılacaktır. Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.
        2. Daha koyu/daha parlak (12), yarıçap (3) ve derinlik (1) için bir öneri içeren iyileştirme içeren yeni bir pencere görünecektir. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın.
      2. İkinci olarak, florokrom SpectrumOrange'ı seçin ve Yakala'ya tıklayın.
        1. Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.
        2. İyileştirme içeren pencere, daha koyu/daha parlak (-11), yarıçap (2,7) ve derinlik (0,6) için bir öneriyle birlikte görünür. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın.
      3. Son olarak, florokrom SpectrumGreen'i seçin ve Yakala'ya tıklayın.
        1. Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.
        2. İyileştirme içeren pencere, daha koyu/daha parlak (0), yarıçap (3) ve derinlik (0) için bir öneri içeren bir öneriyle birlikte görünür. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın. Görüntüyü yeni oluşturulan bir dosyaya kaydedin.
          NOT: Somatik hücreler sadece kontrol kromozomu 18'in iki sinyali görünür olduğunda değerlendirildi. Çoğu oositte, her kromozom için sadece bir sinyal tespit edilebilir.
    2. Sinyal kaybını önlemek için slaytları analizden sonra karanlıkta 4 ° C'de saklayın.

2. Aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun parafin kesitleri üzerinde FISH

NOT: TS'li 18 dişinin kriyoprezervasyonlu/çözülmüş yumurtalık korteks dokusunun bir parçası, 5 ay boyunca şiddetli kombine immün yetmezlikli (SCID) farelere ksenograf edildi. Ksenografting prosedürü daha önce tanımlanmış ve Université Catholique de Louvain'de (Brüksel, Belçika) Hayvan Araştırmaları Komitesi'nin hayvan refahı ile ilgili yerel yönergelerini izleyerek gerçekleştirilmiştir (referans 2014 / UCL / MD / 007) 18,19.

  1. Folikül içeren ksenograflı over korteks dokusunun bölümlerinin seçilmesi
    1. Ksenograflı over korteks dokusunu %4 formaldehit içinde sabitleyin ve dokuyu parafin içine yerleştirin. Ekstra parafini çıkarmak için blokları bir neşterle kesin ve parafin bloğunu bir dönme mikrotomunda 4 μm kalınlığa kesin.
    2. Hangi bölümlerin folikül içerdiğini belirlemek için hematoksilin ve eozin (HE) boyaması için parafin şeridinin her yedinci bölümünü seçin. Bölümü 40-45 ° C'de bir su banyosuna koyun ve immünohistokimya mikroskop slaytlarına monte edin.
  2. Deparafinizasyon ve HE boyama
    1. Slaytları 60 ° C'de 10 dakika boyunca bir sobaya koyun ve daha sonra slaytları 5 dakika boyunca% 100 ksilene batırın. Slaytları doğrudan sobanın üzerine yerleştirmek gerekli değildir. Bölümleri %100 etanolde 15 sn, ardından %96 etanolde 2 x 15 sn nemlendirin. Slaytları musluk suyunda 2 dakika durulayın.
    2. Slaytları hematoksilin içinde 10 dakika boyunca lekeleyin ve daha sonra slaytları musluk suyunda kısaca durulayın. Slaytları kısaca bir bikarbonat çözeltisine daldırın (5 L damıtılmış suya 100 g magnezyum sülfat ve 10 g sodyum bikarbonat). Slaytları musluk suyunda 5 dakika durulayın.
    3. Slaytları 4 dakika boyunca eozin ile karşı boyayın ve slaytları% 100 etanol, ardından ksilen ile üç kez dehidre edin. Slaytlardaki HE lekelerini örtün ve foliküllü bölümleri seçmek için HE bölümlerini ışık mikroskobu altında değerlendirin (100x büyütme).
  3. DNA FISH için parafin kesitlerinin ön işlemi ve hibridizasyonu
    1. Parafin şeritten foliküller içeren bölümden önce veya sonra yatan yeni bölümleri seçin. Bir bölümü cam slayta monte edin. Parafin bölümlerini 56 °C'de bir ocakta en az 45 dakika kurutun. Slaytları doğrudan sobanın üzerine yerleştirmek gerekli değildir.
    2. Ksilen içindeki bölümleri 10 dakika boyunca ayırın. Slaytları% 99.5 etanol içine batırın ve musluk suyunda 5 dakika durulayın. Slaytları 96 ° C'de 10 dakika boyunca hedef alma çözeltisi (düşük pH) ile ön işlemden geçirin. Soğuduktan sonra, slaytları damıtılmış suda durulayın.
    3. Slaytları 5 dakika boyunca 0.01 M hidroklorik asit ile tedavi edin, ardından 37 ° C'de 15 dakika boyunca pepsin sindirimi (200 U / mL) izleyin. Slaytları tekrar 0,01 M hidroklorik asitte ve daha sonra PBS'de durulayın.
    4. Slaytları %1 formaldehit/PBS ile 5 dakika sabitleyin. Slaytları PBS'de kısaca durulayın ve sonra tekrar yarı suda durulayın. Slaytları% 99.5 etanol içinde kurutun ve havayla kurumasını bekleyin.
    5. Granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kontrol olarak X kromozomu için bir sentromere özgü prob ve başka bir kromozoma özgü sentromerik prob seçin. Burada, kromozom 18 kontrol olarak kullanılır.
    6. Doğrudan florokrom SpectrumGreen ile etiketlenmiş 5 μL prob CEP 18 (D18Z1) ve önceden işlenmiş slaytlara doğrudan florokrom SpectrumRed ile etiketlenmiş CEP X (DXZ1) probu uygulayın. Bir kapak fişi uygulayın ve alanı fotoğraf yapıştırıcı ile kapatın. Slaytları 10 dakika boyunca 80 ° C'de denatürasyon ve 37 ° C'de gece boyunca hibridizasyon için bir hibridizatöre yerleştirin.
    7. Ertesi gün, slaytları 42 ° C'de 2x SSC'de 5 dakika durulayın, ardından 73 ° C'de% 0.3 Nonidet P40'ta 2 dakika ve 1 dakika durulayın. 2x SSC'yi yenileyin ve slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tekrar durulayın. Bölmelerin karanlıkta kalması için küveti örtün.
    8. Slaytları damıtılmış suda kısaca durulayın. Slaytları% 99.5 etanol içinde kurutun ve tekrar hava kurumasını bekleyin. Son olarak, slaytları DAPI ve montaj ortamı içeren bir çözelti ile monte edin.
  4. Görüntüleme
    1. Sonuçları 630x büyütmede floresan mikroskobu altında analiz edin. Bilgisayarda görüntü işleme yazılımını açın. Profil olarak FISH'i seçin.
    2. DAPI emisyonunun 431 nm ve uyarımın 359 nm, Teksas kırmızı emisyonunun 613 nm ve uyarmanın 595 nm ve FITC emisyonunun 519 nm ve uyarımın 495 nm olarak ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin.
    3. Canlı > Tek Görüntü Yakala'yı seçerek bir görüntü elde edin. Soldaki Görüntü menüsündeki Pozlama Kaydırıcısı ve Kazanç Kaydırıcısı'nı hareket ettirerek pozlamayı ve kazancı ayarlayarak görüntü kalitesini optimize edin (ör. pozlama: 212 ms ve kazanç: 7,9). Gerekli pozlama ve kazanç görüntüye göre değişebilir; En iyi duruma getirilmiş bir görüntü elde etmek için bu işlem sırasındaki değişiklikleri gözlemleyin. Görüntüyü yeni oluşturulan bir dosyaya kaydedin.
    4. Sinyal kaybını önlemek için slaytları analizden sonra karanlıkta 4 ° C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşılamadan önce izole edilmiş yumurtalık hücrelerinde FISH
Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları göstermek için 45,X/46,XX (hasta A) veya 45,X/46,XX/47,XXX (hasta B) TS'li kadınlardan kriyokorunmuş over korteks dokusu kullanıldı. Hasta A'da lenfositlerin P'sinde 45,X karyotip, P'sinde 46,XX karyotip saptandı. B hastasında lenfositlerin 8'i 45,X, ('i 46,XX ve 4'ü 47,XXX idi. Kontrol (kırmızı) olarak X kromozomu (yeşil) ve kromozom 18 için sentromere özgü problar, TS hastalarının yumurtalık kor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH analizi, hem erkek hem de kadınların lenfositlerinde veya bukkal hücrelerinde X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için iyi bilinen bir tekniktir10. Birçok çalışma, X kromozomal anormallikleri olan erkeklerin gametleri üzerinde FISH'i tanımlamıştır, ancak FISH tarafından X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücreleri hakkında elde edilen ayrıntılı bilgiler hala14'ten yoksundur. Bu makalede, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan alınan aş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef ve Milan Intezar'a uzmanlıkları ve teknik yardımları için teşekkür eder. Finansman kaynakları: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ve Ferring.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asitBiosolve BV0001070602BS
Santrifüj 1200Hettich Universal4140
Kollajenaz ISigma131470
LamelVWR0631-0146
DAPIVektörH-1200
DNaz IRoche10104159001
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
EtanolEMSURE1009832500
Fetal Sığır Serumu (FBS)Yaşam teknolojisi10100147
DM4 B bölümleri için floresan mikroskobuLeica Microsystems 
Floresan mikroskop kapsamı A1Zeiss AXIO
Ayrışmış hücreler için floresan etiketli problarAbbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Doku kesitleri için floresan etiketli problarAbbott DiagnosticsCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
FormaldehitSigma252549
GlukozMerck108337
Tutkal (Fixogum)Leica MicrosystemsLK071A
HematoksilenSigma1159380025
Hibridizasyon tamponuAbott Diagnostics32-804826/06J67-001
Hibridizasyon İstasyonu DakoS2451
Hidroklorik asitMerck1003171000
Görüntü işleme yazılımı bireysel yumurtalık korteks hücreleri (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
Parafin kesitlerinde görüntü işleme yazılımı Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
İmmünohitokimya mikroskobu slaytlarıDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liferaz DHRoche05 401 151 001
Işık mikroskobuZeiss Batı Almanya
Magnezyum sülfatMerckA335586
MetanolHoneywell14262-1L
Montaj ortamıVectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
ParafinPoth Hile2712.20.10
PepsinSigmaP7000-25G
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco11530546
Plastik pipetCooperSurgical7-72-4075 / 1
Potasyum klorür ve nbsp;Merck1049361000
Proteinaz KQiagen19131
Rotasyon mikrotomu HM 355STermo sceintific
NeşterDahlhausen11.000.00.515
Ayrışmış hücrelerde BALIK için slaytTermo bilimselJ1810AM1JZ
Sodyum bikarbonatSigma55761-500G
Standart Sodyum Sitrat (SSC)Fisher Scientific, Invitrogen10515203
Stereomikroskop IX 70Olympus
Hedef Alma Solüsyonu    DakoGV80511-2
TripsinSigmaT4799
Ara-20ThermoFisher85113
KsilenBOOM760518191000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

FISH AnaliziOver Korteks DokusuKromozomal AnomalilerFolik logenezGran loza H creleriEnzimatik SindirimFloresan Mikroskobu

İlgili makaleler