Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yumurtalık Ameliyatlı Fare Modelinde Gebelik Oluşumuna Uterus Katkılarını İnceleme Yöntemleri

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64763

⸱

7 Nisan 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Gebelik oluşumu, kompleks embriyo ve uterus çapraz ilişkisini içeren dinamik bir süreçtir. Maternal uterin ortamın bu süreçlere kesin katkıları aktif bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. Burada, bu araştırma sorularını ele almak için in vivo hayvan modellerinin tasarlanmasına yardımcı olacak ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır.

Özet

Gebeliğin oluşması için, uygulanabilir bir blastosist, implantasyonu ve plasenta oluşumunu kolaylaştırmak ve devam eden hamileliği sağlamak için alıcı bir uterus astarı (endometriyum) ile başarılı bir şekilde etkileşime girmelidir. Embriyonik defektlerin neden olduğu gebelik başarısındaki sınırlamalar iyi bilinmektedir ve son yıllarda in vitro fertilizasyon (IVF) ve yardımcı üreme teknolojilerinin yükselişiyle büyük ölçüde aşılmıştır. Bununla birlikte, henüz, alan, yetersiz alıcı bir endometriyumun neden olduğu sınırlamaların üstesinden gelmemiştir, bu nedenle IVF başarı oranlarının durgunlaşmasına neden olmuştur. Yumurtalık ve endometriyal fonksiyonlar yakından iç içe geçmiştir, çünkü yumurtalık tarafından üretilen hormonlar endometriyumun adet siklikliğinden sorumludur. Bu nedenle, gebeliğin kemirgen modellerini kullanırken, gözlemlenen bir sonucun yumurtalık veya uterus eksikliğinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek zor olabilir. Bunun üstesinden gelmek için, gebeliğe uterusa özgü katkıların incelenmesine izin vermek için embriyo transferi veya yapay desidualizasyon ile yumurtalık ameliyatı yapılmış bir fare modeli geliştirilmiştir. Bu makalede, yumurtalık ameliyatının nasıl yapılacağına dair talimatlar verilecek ve sağlıklı donörlerden embriyo transferini takiben başarılı yapay desidualizasyonu veya hamileliği desteklemek için eksojen hormonların temini için çeşitli teknikler hakkında bilgi verilecektir. Bu teknikler arasında deri altı enjeksiyonu, yavaş salınımlı peletler ve ozmotik mini pompalar bulunur. Her yöntemin temel avantajları ve dezavantajları tartışılacak ve araştırmacıların kendi araştırma soruları için en iyi çalışma tasarımını seçmelerini sağlayacaktır.

Giriş

Son yıllarda yardımcı üreme teknolojilerinin kullanımının artmasıyla birlikte, gebe kalmanın önündeki birçok engel aşılmış ve birçok çiftin doğurganlık sorunlarına rağmen aile kurmasına izin verilmiştir1. Oosit veya sperm eksiklikleri genellikle in vitro fertilizasyon veya intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu kullanılarak atlanabilir; Bununla birlikte, uterus ve endometriyal alıcılık ile ilgili konular, üreme potansiyelinin zor bir "kara kutusu" olmaya devam etmektedir2.

Hamilelik, yüksek kaliteli bir embriyo alıcı bir endometriyum (uterus astarı) ile başarılı bir şekilde etkileşime girdiğinde kurulur. Herhangi bir adet döngüsünde başarılı hamilelik şansı düşüktür, yaklaşık% 30'dur3,4. Başarılı olanların sadece% 50-60'ı gebeliğin 20. haftasını geçerek ilerler ve implantasyon başarısızlığı 20 haftaya ulaşmayan gebeliklerin% 75'inden sorumludur3. 1990'ların sonlarına kadar uzanan bu rakamlara rağmen, alan henüz yetersiz alıcı bir endometriyumun neden olduğu sınırlamaların üstesinden gelememiştir. Bu, son yıllarda IVF başarı oranlarının durgunlaşmasına ve bazen de düşmesine neden olmuştur 5,6.

Açıklanamayan infertilitesi olan kadınlar genellikle yer değiştirmiş bir alıcılık penceresine sahiptir veya bilinmeyen nedenlerden dolayı alıcılığa ulaşamazlar. Son zamanlarda, embriyo transferinin zamanlamasını bireyin alıcılık penceresine uyarlamak amacıyla yüzlerce genin ekspresyonunu değerlendiren endometrial reseptivite dizisi geliştirilmiştir 7,8,9. Bununla birlikte, implantasyon süreci tamamlandıktan sonra ortaya çıkan gebelik komplikasyonlarının patogenezi hala anlaşılamamıştır.

Kadın üreme sistemi oldukça dinamiktir ve sıkı hormonal kontrol altındadır. Hipotalamik-hipofiz-gonadal (HPG) ekseni, folikül olgunlaşması ve östrojen ve progesteron aktivitesi dahil olmak üzere yumurtalık döngüsünün yönlerini düzenleyen luteinize edici hormon ve folikül uyarıcı hormonun salınımını kontrol eder. Buna karşılık, uterus adet döngüsü östrojenler ve progesteron10,11 tarafından düzenlenir. Bu nedenle, uterus biyolojik mekanizmalarının incelenmesi yumurtalık etkisi ile karmaşıktır. Örneğin, kanser tedavilerinin uterusu nasıl etkileyebileceğini incelerken, gözlemlenen herhangi bir uterus fenotipinin (gebelik kaybı veya adet aklikliği gibi) uterusa doğrudan bir hakaretin sonucu mu yoksa yumurtalıklara verilen hasardan kaynaklanan bir sonuç mu olduğunu ayırt etmek zor olabilir.

Doğurganlığı kapsamlı bir şekilde anlamak için, gebeliğe uterus katkıları karakterize edilmelidir. Önemli olarak, bu anlayış yumurtalık kontrolü altında uterus fonksiyonunun ötesine geçmelidir. Bu insanlarda incelenemez; Bu nedenle, hayvan modelleri sıklıkla kullanılır. Bu nedenle, ovariektomi (OVX), araştırmacıların eksojen olarak hormon sağlayarak kemirgen östrus döngülerini (adet döngüsüne benzer) düzenlemelerini sağlamak için yaygın olarak kullanılır. Ek olarak, OVX, uterus yanıtlarının yumurtalık etkisinden bağımsız olarak incelenmesine izin verir12. Bununla birlikte, hormonlar OVX sonrası hemen sağlanmazsa, araştırmacılar tarafından dikkatlice düşünülmesi gereken bir menopoz fenotipi ortaya çıkacaktır.

OVX, 13,14,15,16,17 kemirgen modellerinde sıklıkla kullanılır ve yeterli eğitimden sonra gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır. Yöntemler, tek başına yumurtalığın mı yoksa yumurtalık ve yumurta kanalının mı çıkarıldığına ve hayvanın yaşına bağlı olarak değişir (yetişkin, bisiklete binen hayvanlar, yüzeylerinde görünür bir korpus luteum bulunan daha büyük yumurtalıklara sahiptir, yani yumurtalıklarının görselleştirilmesi daha kolaydır). Benzer şekilde, deri altı enjeksiyonları14, yavaş salınımlı peletler 15, ozmotik mini pompalar18 ve yumurtalık aşılaması dahil olmak üzere birçok hormon takviyesi yöntemi mevcuttur.

Bu makalede, yumurtalık ameliyatının nasıl yapılacağı ve deri altı enjeksiyonları, yavaş salınımlı peletler ve ozmotik mini pompalar dahil olmak üzere üç tip hormon takviyesinin nasıl hazırlanacağı hakkında ayrıntılı talimatlar verilmiştir. OVX'ten yararlanan deneysel sonlanım noktaları için iki ayrıntılı protokol ve ardından eksojen hormon takviyesi (embriyo transferi ve yapay desidualizasyon) sağlanmıştır. Bu makalede, özellikle hamilelik ve doğurganlık araştırma alanlarında, rahim üzerindeki etkileri izole etmek için çalışmaların nasıl yapılacağı konusunda araştırmacılara rehberlik etmek amacıyla her yaklaşımın güçlü ve zayıf yönleri tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvanlar, sıcaklık kontrollü, yüksek bariyerli tesislerde (Monash Üniversitesi Hayvan Araştırma Laboratuvarı) ücretsiz yiyecek ve su erişimi ve 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü ile barındırıldı. Tüm prosedürler Monash Hayvan Araştırma Platformu Etik Komitesi'nin (#21908, 17971) onayına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve hayvanların bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Uygulama Kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Cerrahi hazırlık

  1. Sert / kuru mal döngüsündeki prosedürler için gerekli tüm cerrahi aletleri, gazlı bezleri ve kağıt havluları 121 ° C'de 30 dakikalık bir bekleme süresi ve 30 dakikalık bir kuruma süresi ile otoklavlayın.
  2. Cerrahi çalışma alanı için steril bir tezgah pedi yerleştirin ve analjezikler hazırlayın.
    1. Karprofeni steril salin içinde 1 mg / ml'ye seyreltin ve bupivakaini steril salin içinde% 0.5 (w / v) çözeltiye seyreltin.
    2. 400 mL'lik kafes su şişesine 3,5 mL meloksikam ekleyin.
  3. Kurtarma kafesleri için ısı pedlerini önceden ısıtın ve geri kazanan hayvanlara dolaylı ışık yakmak için ısı lambaları ayarlayın.
  4. Saç filesi, yüz maskesi, önlük ve eldivenler dahil olmak üzere tüm uygun KKD'lerin giyildiğinden emin olun.
  5. Eldivenlere düzenli olarak etanol püskürtmek ve etanol kontaminasyonunu önlemek için hayvanı veya cerrahi aletleri kullanmadan önce buharlaşmalarına izin vermek de dahil olmak üzere iyi steril teknik uygulayın.

2. Yumurtalık ameliyatı

  1. İzofluran içeren bir gaz anestezi makinesi kullanarak, indüksiyon kutusunu akış hızı 4 L / dak olarak ayarlanmış% 5 izofluranda 3-5 dakika önceden doldurun.
  2. Fareyi indüksiyon kutusunun içine yerleştirin ve bilinçsiz olduğunda, burun konisine hareket ettirin ve izofluran buharlaştırıcısı ~% 2,5'e ayarlanmış olarak akış hızını 0,4 L / dak'ya düşürün.
    NOT: Prosedürün geri kalanında kullanılan izofluran yüzdesi, fare suşuna, yaşına ve tedavilere (örneğin, kemoterapi) maruz kalmaya bağlı olarak değişir ve her bir hayvanın solunum modellerinin yakından değerlendirilmesine dayanarak ayarlanmalıdır. Solunum şekilleri normal karın nefesleri olarak kalmalıdır. Hızlı, torasik nefesler, derin bir cerrahi düzleme ulaşılmadığını veya sürdürülemediğini gösterebilir; Bu durumda, izofluran buharlaştırıcı yüzdesini gerektiği gibi ayarlayın.
  3. Tüpü sıkarak ve gözü nazikçe okşayarak göz kayganlaştırıcısını cömertçe uygulayın.
  4. Omurganın kamburluğunda ve altında küçük (2 cm x 2 cm) bir alanı tıraş edin.
  5. Boynun tırnaklarında deri altından 1 mg / mL'lik seyreltilmiş bir çözeltiden 5 mg / kg karprofen uygulayın.
  6. Farenin arka ayak parmağını sıkıştırarak ayak parmağı sıkıştırma refleksi ile anestezinin derinliğini test edin. Ayak parmağı sıkışma reaksiyonu yoksa, hayvan derin cerrahi düzlemdedir ve prosedür devam edebilir.
  7. Cerrahi bölgeye betadin uygulayın ve cerrahi bir örtü (2 cm x 2 cm pencere kesilmiş bir gazlı bez) ile örtün.
  8. Sıçan dişli forseps kullanarak, cildi sırtın kamburluğundan yukarı doğru çekin ve ~ 5 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
    NOT: Hayvanın sırtında bu yükseklikte bir cilt kesisi, hayvanın klipsleri çıkarma ve klips onarımı gerektirme şansını azaltmak için cerrahi klips yerleştirme için en iyisidir.
  9. Künt forseps kullanarak, cildi altta yatan kas tabakasından uzaklaştırarak künt disseke etmeye devam edin, aşağı ve bir tarafa böbreğe doğru hareket edin.
  10. Böbrek, yumurtalık ve yumurtalık yağ yastığını kas duvarından görsel olarak tanımlayın.
    NOT: Böbrek koyu kırmızı bir renkte görünecek, yağ yastığı parlak beyaz görünecek ve eğer görünürse, yumurtalık yağ yastığı içinde küçük pembe bir nokta gibi görünecektir.
  11. Forseps kullanarak, kas tabakasını tutun ve kaldırın. Keskin cerrahi makasla ~ 0.5-1 cm'lik bir kesi yapın. Kas duvarını forseps ile tutmaya devam edin ve yumurtalık yağ yastığını insizyondan çekmek için makaslardan künt forsepslere geçin.
  12. Kavisli bir iğne tutucu kullanarak, uterus boynuzunun distal ucundaki yumurtalık ve yumurta kanalının altına kelepçeleyin.
    NOT: Alternatif olarak, yumurtalık tek başına çıkarılabilir ve yumurta kanalı bozulmadan bırakılabilir. Bununla birlikte, yumurtalık ve yumurta kanalı arasındaki ayrımı doğru bir şekilde görselleştirmek için diseksiyon mikroskobu gereklidir.
  13. Yumurtalıkları makas veya neşterle çıkarın. Aşırı kanamayı önlemek için 30 saniye boyunca kelepçelemeye devam edin.
  14. Kelepçeyi çıkarın ve gerekirse steril gazlı bezle yıkayın.
  15. Kas duvarı insizyonunu kapatmak için, insizyonun üstünü kaldırmak için forseps kullanın, böylece insizyon doğal olarak bir araya gelir.
  16. Kas duvarı insizyonunu cerrahın düğümü ile kapatmak için ipek dikişler (boyut 3-0) kullanın.
  17. İğne takılı olmadan 1 mL'lik bir şırınga kullanarak topikal olarak iki ila üç damla bupivakain uygulayın ve diğer tarafta 2.9-2.17 adımlarını tekrarlayın.
  18. Cilt insizyonunu kapatmak için, aşırı bupivakain kuruyan bölgeyi temizlemek için gazlı bez kullanın ve cildin iki tarafını birbirine bastırın.
  19. İyileşme sürecinin bir parçası olarak şişme için yer açan bir ila iki adet 7 mm'lik cerrahi klips uygulayın.
  20. Fareyi bir kurtarma kafesine götürün ve 15 dakika boyunca yakından izleyin.
    NOT: Hayvanlar çabuk uyanmalıdır; Normal torasik solunum paternleri için solunumu yakından izlediğinizden emin olun.

3. Hormon preparatı: Subkutan enjeksiyon

  1. 1 mg / mL stok östradiol çözeltisi yapın.
    1. 0.001 g (1 mg) östradiol tozunu 1.5 mL steril bir tüpe tartın.
    2. Tüpe 1 mL% 100 etanol ekleyin ve birkaç saniye boyunca vorteks yapın.
      NOT: Etanol, görünür östradiol tozu lekeleri ile berrak kalacaktır.
    3. Herhangi bir etanol buharlaşmasını önlemek için tüpü filmle sarın.
    4. Tüpü alüminyum folyoya sarın ve östradiol tozunu tamamen çözmek için gece boyunca bir rocker üzerine yerleştirin.
    5. Bu 1 mg/mL stoğu susam yağında istenen son konsantrasyona kadar seyreltin.
      NOT: Yapay desidualizasyondan önce astarlama için 3 gün boyunca 100 ng'lik dozlar gereklidir ve progesteron verildiğinde 25 ng'lik ek düşük dozlar gereklidir. Bu, progesteron reseptör ekspresyonunu kontrol eden geri besleme döngüsü ile mücadele etmektir. Embriyo transferi için, 4. günde embriyo transferinden önce 1. günde ve 3. günde iki doz 100 ng gereklidir. Embriyo transferi sırasında, 25 ng'lik düşük bir doz da gereklidir.
    6. Gerekli miktarda östradiol'ü yağda 1 mL'lik bir şırıngaya çekin ve ardından 26 G'lık bir iğne ucu takın.
    7. Uygun dozu deri altından (tırnakta veya yanda; embriyo transferinden veya yapay desidualizasyondan önce veya embriyo transferi sırasında astarlama için 100 ng / 100 μL veya 25 ng / 100 μL) gerekli sıklıkta enjekte edin.
      NOT: Yağ çok viskozdur, bu nedenle iğneyi çıkarmadan önce yavaşça enjekte ettiğinizden ve birkaç saniye durakladığınızdan emin olun. Bu, enjeksiyon bölgesinden sızan yağ miktarını en aza indirecektir.
  2. 200 mg / mL'lik bir progesteron stok çözeltisi yapın.
    1. 0.4 g (400 mg) progesteron tozunu 5 mL'lik steril bir tüpe tartın.
    2. Tüpe 2 mL% 100 etanol ekleyin ve birkaç saniye boyunca vorteks yapın.
      NOT: Etanol beyaz renkte olacaktır.
    3. 3.1.3-3.1.4 arasındaki adımları yineleyin.
    4. Susam yağındaki 200 mg/mL stoğu istenen son konsantrasyona kadar seyreltin.
      NOT: Embriyo transferini desteklemek için günde 2 mg'lık dozlar gereklidir.
    5. Uygun dozu (örneğin, hamileliği desteklemek için günde 2 mg / 100 μL) 3.1.6-3.1.7 adımlarında olduğu gibi deri altından enjekte edin.

4. Hormon hazırlığı: Yavaş salınımlı peletler

  1. Laminer akışlı veya sınıf II biyogüvenlik başlığının yüzeyine bir folyo döşeyin.
  2. Tüm ekipmanı (eldivenler, Petri tabakları, 1 mL şırıngalar, ince forseps) davlumbaza yerleştirin ve UV'yi 20 dakika boyunca açın.
    NOT: UV'yi, dolgu macunu davlumbazın içinde ayarlanacağı gibi açmayın.
  3. Silastik boruyu% 100 etanol ile yıkayın ve davlumbazda hava ile kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, boru boyunca ~ 1 cm uzunluklarını işaretleyin ve bir neşterle kesin.
  4. Pistonu bir şırıngadan çıkarın ve ~ 200 μL sızdırmazlık maddesi sıkın. Pistonu değiştirin ve şırıngadan az miktarda sızdırmazlık maddesi bastırın.
  5. Borunun bir ucuna az miktarda sızdırmazlık maddesi uygulayın ve eldivenli bir parmağınızla pürüzsüzleştirin.
  6. Gece boyunca veya davlumbazın içindeki UV ışığında 20-30 dakika kurumaya bırakın.
  7. Sterilize edilmiş bir Petri kabına uygun miktarda progesteron dökün. Forseps kullanarak, peleti doldurmak için peletleri progesteron tozuna alın.
    1. Progesteronu yoğunlaştırmak için peletin kapalı ucuna davlumbaz yüzeyine dokunun. Alternatif olarak, progesteronu doldurmak için sterilize forsepsin ucunu kullanın. Daha fazla sızdırmazlık maddesi için yeterli alana izin verin.
  8. Açık ucu, adım 3.4-3.5'te açıklandığı gibi sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
  9. Progesteron peletlerini içeren Petri kabını ışıktan korumak için folyoya sarın.
  10. 37 ° C'de% 1 odun kömürü ile soyulmuş FCS'de (cs-FCS: PBS) inkübe ederek deri altına yerleştirmeden önce peletleri en az 72 saat boyunca aktive edin.
    NOT: Peletler önceden tek bir kapalı uçla dökme olarak yapılabilir. Bununla birlikte, her seferinde bunları doldurmak için taze progesteron kullanılmalıdır. Progesteron ile doldurmadan önce önceden hazırlanmış peletlerin UV ile sterilize edildiğinden emin olun. Peletler 6-10 gün boyunca ~ 500 μg / gün salgılar, bu da yapay desidualizasyon ve embriyo transfer prosedürleri için yeterli destektir, ancak progesteron reseptör aktivitesini 4-5 günden fazla tutmak için ek bir düşük doz östrojen enjeksiyonu gerekebilir. 10 günden sonra, yedek bir progesteron peleti gerekebilir.

5. Hormon hazırlığı: Ozmotik mini pompalar

  1. Progesteronu sulu bir çözelti içinde istenen konsantrasyonda hazırlayın ve uygun mini ozmotik pompa modelini seçin (bkz.
    NOT: Bölüm 7 için (deneysel prosedür: embriyo transferi), 12 gün boyunca 2 mg / gün verilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, 28 mg progesteronu hayvan başına ~ 100 μL steril suda çözün (belirli hacim için üreticinin talimatlarını izleyin). Seri seyreltmeler gerekebilir. Bölüm 8 için (deneysel prosedür: yapay desidualizasyon), 3 gün boyunca günde 500 μg verilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, 1.500 μg progesteronu, hayvan başına ~ 100 μL steril suda çözün. Dolum prosedürü sırasında kaybedilen hacmi hesaba katmak için ekstra çözelti hazırlayın.
  2. Ekipmanı (eldivenler, düşük tüylü mendiller, Petri tabakları, steril tuzlu su, 1 mL şırıngalar, küçük tartım tekneleri, folyo ve 0,01 g'a kadar hassas kantarlar) sınıf II biyogüvenlik başlığı içine yerleştirin ve ardından UV'yi 20 dakika boyunca açın.
  3. Hormon çözeltisini 1 mL'lik bir şırıngaya çekin ve ardından hava kabarcığı olmadığından emin olarak steril bir doldurma tüpü takın.
  4. Pompayı ve akış moderatörünü steril bir tartım teknesinde tartın.
  5. Dolum borusunu, daha fazla ilerleyemeyene kadar pompanın üstündeki açıklıktan geçirin.
  6. Pompayı dik tutarak, tüpü doldurmak için şırınganın pistonunu yavaşça itin.
    NOT: Pompaya hava kabarcıkları sokabileceğinden hızlı dolumdan kaçınılmalıdır.
  7. Çözelti pompanın üstünden taştığında, dolum tüpünü yavaşça çıkarın ve fazla çözeltiyi steril düşük tüylü bir mendille silin.
  8. Akış moderatörünü, daha fazla ilerleyemeyene kadar pompanın üst kısmındaki açıklıktan yerleştirin. Tamamen içeri girdikten sonra, pompayı ve akış moderatörünü birlikte sıkıca bastırın.
  9. Doldurulmuş pompayı, akış moderatörü yerinde olacak şekilde tartın.
    NOT: Adım 5.3 ve adım 5.8'den elde edilen ağırlık farkı, yüklenen çözeltinin net ağırlığını verecektir (yani, 0,1 g'lık bir artış = 100 μL çözelti eklenmiştir).
  10. Doldurulmuş pompayı steril salin ile doldurulmuş steril bir Petri kabına yerleştirin.
  11. Tüm pompalar doldurulduktan sonra, Petri kabını folyoya sarın ve en az 4-6 saat (veya kullanıma hazır olana kadar) astarlamak için 37 ° C'lik bir inkübatörün içine yerleştirin.

6. Cerrahi prosedür: Deri altı hormon peletlerinin ve mini pompaların yerleştirilmesi

  1. Alanı bölüm 1'e göre hazırlayın (cerrahi hazırlık).
  2. Hayvanları 2.1-2.3 adımlarına göre uyuşturun.
  3. Boynun tıraşında küçük bir alanı tıraş edin (~ 1 cm x 1 cm).
  4. Bacak kanadında deri altından 1 mg / mL'lik seyreltilmiş bir çözeltiden 5 mg / kg karprofen uygulayın.
  5. Ayak parmağı sıkışma refleksini test edin. Refleks yoksa, hayvan derin cerrahi düzlemdedir ve prosedür başlayabilir.
  6. Cerrahi bölgeye betadine uygulayın ve cerrahi bir örtü (2 cm x 2 cm pencere kesilmiş bir gazlı bez) ile örtün.
  7. Sıçan dişli forseps kullanarak, cildi boynun tırnağından (gerçek tırmık ile sırtın kamburluğu arasında) yukarı doğru çekin ve ~ 5 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
  8. Künt forseps kullanarak, künt cildi altta yatan kas tabakasından aşağı doğru bir yönde diseke eder.
    NOT: Ozmotik mini pompa yerleştirme için, hayvanın bir tarafı boyunca bir cep oluşturun, böylece pompa hayvanın hareketini kısıtlamaz veya kesi yerine bastırmaz.
  9. Hormon peleti veya mini pompa için yeterli alan yapıldıktan sonra, pelet veya mini pompayı almak için steril forseps kullanın ve künt diseksiyonla yapılan deri altı cebine yerleştirin.
  10. Cilt insizyonunu kapatmak için, pelet veya mini pompanın cebe yeterince uzak olduğundan ve cerrahi klipslerin zarar vermeyeceğinden emin olun.
  11. Topikal olarak bupivakaini adım 2.17'ye göre uygulayın.
  12. Yarayı bir cerrahi klipsle kapatın. Fareyi bir kurtarma kafesine götürün ve 15 dakika boyunca yakından izleyin. Bu kısa bir prosedür olduğundan, hayvanlar dakikalar içinde ayakta durmalıdır.

7. Deneysel prosedür: Embriyo transferi

  1. Yumurtalık ameliyatı yapılan hayvanlar için, embriyo transferinden 3 gün önce 100 ng/100 μL östradiol subkutan enjeksiyonu ile hormon-prime (adım 3.1).
  2. Embriyo transferinden bir gün önce, hormon, 2 mg / 100 μL medroksiprogesteron asetat deri altı enjeksiyonu ile hayvanları astarlar (adım 3.2).
  3. Alanı bölüm 1'e göre hazırlayın (cerrahi hazırlık).
  4. Hayvanları 2.1-2.3 adımlarına göre uyuşturun.
  5. Prosedürü 2.4-2.10 adımlarına göre başlatın.
  6. Diseksiyon mikroskobu altında, 26 G iğne ucu olan bir intrauterin enjeksiyon noktası oluşturun.
  7. Beş blastosisti bir M2 medya damlasına pipetleyin ve sonra bunları uterus boynuzuna aktarın.
  8. Kas duvarı insizyonunu kapatmak için, insizyonun üst kısmını forseps kullanarak kaldırın, böylece insizyon doğal olarak bir araya gelir.
  9. İpek dikişler kullanarak, kas duvarı bölgesini bir cerrahın düğümü ile kapatın. Topikal olarak bupivakain damlaları uygulayın.
  10. Diğer tarafta 7.5-7.8 arasındaki adımları yineleyin.
  11. Cilt insizyonunu kapatmak için, aşırı bupivakain kuruyan bölgeyi temizlemek için gazlı bez kullanın ve cildin iki tarafını birbirine bastırın.
  12. İyileşme sürecinin bir parçası olarak şişme için yer açan bir ila iki cerrahi klips uygulayın.
    NOT: Hayvanlar yumurtalık ameliyatı yapılırsa, embriyo transferi sırasında eksojen hormonlar gereklidir. Deri altından progesteron (2 mg) enjekte edin veya deri altı progesteron peleti veya ozmotik mini pompa yerleştirin. Aşırı progesteron ile mücadele etmek için, embriyo transferi sırasında düşük doz (25 ng / 100 μL) östrojenin deri altı enjeksiyonu gereklidir.
  13. Fareyi dikkatlice bir kurtarma kafesine taşıyın ve 15 dakika boyunca yakından izleyin.
    NOT: Hayvanlar çabuk uyanmalıdır; Normal torasik solunum paternleri için solunumu yakından izlediğinizden emin olun.

8. Deneysel prosedür: Yapay desidualizasyon

  1. Yapay desidualizasyondan 8 gün önce bölüm 3'e (hormon hazırlama: deri altı enjeksiyonu) göre, 1. gün, 2. gün ve 3. günde 100 ng / 100 μL östradiol ile hayvanları hormon astarlayın.
  2. Yapay desidualizasyondan 2 gün önce bölüm 3'e (hormon preparasyonu: deri altı enjeksiyonu) göre, 7. gün, 8. gün ve 9. günde 5 ng / 100 μL östradiol ile hayvanları hormon astarlayın.
    NOT: Son enjeksiyon, yapay desidualizasyon prosedüründen önce en az 3 saat (ve en fazla 4 saat) yapılmalıdır.
  3. Yapay desidualizasyondan 2 gün önce, bölüm 4, bölüm 5 ve bölüm 8'e göre, deri altı progesteron pelet veya mini ozmotik pompalı (500 μg / gün) hormon primli hayvanlar.
  4. Alanı bölüm 1'e göre hazırlayın (cerrahi hazırlık).
  5. Hayvanları 2.1-2.2 adımlarına göre uyuşturun.
  6. Anestezinin derinliğini ayak parmağı sıkışma refleksi ile test edin. Ayak parmağı sıkışma reaksiyonu yoksa, hayvan derin cerrahi düzlemdedir ve prosedür devam edebilir.
  7. Fareyi eğilimli bir konuma getirin, kuyruğu kaldırın ve yavaşça vajinaya 6 mm çapında bir spekulum yerleştirin.
  8. Hayvanın burnunu anestezik burun konisinde tutarken, hayvanın alt gövdesini baskın olmayan elin birinci ve ikinci parmakları arasına yerleştirin. Vajinal açıklığı görünürde tutmak için kuyruğu yavaşça yukarı doğru itmek için baş parmağınızı kullanın.
  9. Cerrahi olmayan bir embriyo transfer ucu (20 μL pipete tutturulmuş) kullanarak 20 μL susam yağını bir uterus boynuzuna aktarın.
    1. Pipet seviyesini vajinal açıklıkla aynı seviyede tutarak, ucu vajinaya ve serviks yoluyla uterus boynuzuna yerleştirin. Uç uterus boynuzuna girdikten sonra, ucu endometriyal yüzeye hafifçe bastırın (yukarıdaki taşıma tekniğini kullanıyorsanız, bu hareket ikinci parmağa karşı hissedilecektir) ve yağı yavaşça dışarı atın.
      NOT: Pipet pistonunu basılı tutun, tüm yağın dağıldığından emin olmak için 10 saniye bekleyin ve pistonu basılı tutarken transfer ucunu yavaşça çıkarın.
  10. Spekulumu vajinadan çıkarın.
  11. Fareyi dikkatlice kurtarma kafesine taşıyın ve 15 dakika boyunca yakından izleyin.
    NOT: Hayvanlar çabuk uyanmalıdır. Normal torasik solunum paternleri için nefeslerini yakından izleyin.
  12. Hayvanların kullanımını sınırlayın ve işlemden sonra 96 saat boyunca sessiz bir ortamda saklayın.
    NOT: Yüksek sesler veya aydınlık ve karanlık döngülerindeki ani değişiklikler prosedürün başarısını etkileyecektir. Doku diseksiyonu sırasında, desidualizasyon başarısının derecesi, uterus ağırlığının vücut ağırlığına oranı olarak ölçülebilir. Yapay desidualizasyon prosedürü% 80 başarı oranına sahiptir. Bu nedenle, ondalıklaştırmayı başaramayan hayvanları hariç tutun ve deneyler için örneklem boyutlarını seçerken bunu hesaba katın.

9. Cerrahi prosedür: Cerrahi sonrası iyileşme, izleme ve klips onarımları

  1. Hayvanların, ev kafeslerine geri göndermeden önce gece boyunca yarı açık, yarı kapalı ısı pedlerini geri kazanmalarına izin verin.
  2. Ameliyat sonrası 5 gün boyunca hayvanları günlük olarak izleyin, enfeksiyon belirtileri için yara bölgesine çok dikkat edin.
  3. Gerekirse klip onarımı gerçekleştirin.
    1. Alanı bölüm 1'e göre hazırlayın (cerrahi hazırlık).
    2. Hayvanları 2.1-2.3 adımlarına göre uyuşturun.
    3. Klip hala mevcutsa, bir klip sökücü kullanarak mevcut klibi kaldırın.
    4. 2.19-2.21 adımlarına göre yeni bir cerrahi klips uygulayın.
  4. Cerrahi klipsleri ameliyattan 7 gün sonra 9.3.1-9.3.3 adımlarına göre veya hayvan bir sonraki anestezi altındayken çıkarın (embriyo transferi, yapay desidualizasyon prosedürü veya ameliyattan sonra deri altı enjeksiyonu gibi).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İyi karakterize edilmiş bir yapay desidualizasyon modeli bu protokol belgesinde açıklanmaktadır (Şekil 1A). Burada, genç yetişkin dişi farelere (8 haftalık) bölüm 1 ve bölüm 2'de tarif edildiği gibi cerrahi ovariektomi uygulandı. Fareler daha sonra, endojen yumurtalık hormonlarının, bölüm 3-7 ve bölüm 9'da açıklandığı gibi eksojen hormonlarla desteklenmeden önce dağılmasını sağlamak için 2 hafta dinlendirildi. Yapay desidualizasyon, susam yağının intravajinal enjeksiyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, OVX'in nasıl gerçekleştirileceği ve uterusun hamilelik ve doğurganlığa katkılarını anlamaya odaklanan çalışmalar için eksojen hormonların nasıl sağlanacağı konusunda adım adım talimatlar sunmaktadır. Bu yöntemlerin iki deneysel uygulamasında, embriyo transferinin gerçekleştirilmesi ve desidualizasyonun yapay olarak indüklenmesi de dahil olmak üzere iki ayrıntılı protokol sağlanmıştır.

OVX'i gerçekleştirmek başlangıçta zor olsa da - özellikle kemirgen modellerinde yeni olan araştırma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal veya diğer çıkarları beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapı Desteği ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) IRIISS aracılığıyla mümkün olmuştur. Bu çalışma, Monash Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hemşirelik ve Sağlık Bilimleri Platformu Erişim Hibesi tarafından A.L.W.'ye (Winship-PAG18-0343) Monash Üreme Hizmetleri Platformu'na erişim için desteklenmiştir. A.L.W., Avustralya Araştırma Konseyi'nden (ARC) DECRA fonu DE21010037 tarafından desteklenmektedir. J.N.H. ve L.R.A., Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Bursu ile desteklenmektedir. L.R.A. Monash Graduate Excellence Bursu ile desteklenmektedir. K.J.H. ARC Future Fellowship FT190100265 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ALZET 1002 mini ozmotik pompalarBioScientific10020,25 & 14 gün boyunca L / h. Bölüm 7 (Deneysel prosedür - Embriyo transferi) için kullanın.
ALZET 1003D mini ozmotik pompalarBioScientific1003D1 & 14 gün boyunca L / h. Bölüm 8 için kullanın (Deneysel prosedür - Yapay desidualizasyon).
ALZET Reflex 7 mm klipslerBioScientific0009971Tercihe bağlı olarak yara kapatma için Refleks klipsler veya Michel klipsler kullanılabilir
ALZET Refleks klips aplikatörüBioScientific0009974Tercihe bağlı olarak yara kapatma için Refleks klipsleri veya Michel klipsleri kullanılabilir
ALZET Refleks klips çıkarıcıBioScientific0009976Tercihe bağlı olarak yara kapatma için Refleks klipsler veya Michel klipsler kullanılabilir
Bupivicaine enjeksiyonuPfizerNAStock% 0.5. Tuzlu
su Estradiol SigmaE8875
MeloksikamIliumNAAktif bileşen 0.5 mg / mL içinde% 0.05'te kullanın. 400 mL'lik kafes su şişesi başına 3,5 mL veya kurumunuzun veterinerinin reçete ettiği şekilde kullanın.
Michel klipsleriDanielsNS-000242
Çok amaçlı dolgu macunuDow Corning732
Ameliyatsız embriyo transferi (NSET) cihazıParaTechs600106 mm spekulum içerir. Tek kullanımlıktır.
ProgesteronSigmaP0130Etanolde çözünür. İçin kullanın  bölüm 3 (Hormon hazırlama - deri altı enjeksiyonu) ve  bölüm 4 (Hormon hazırlama - yavaş salınan peletler)
ProgesteronSigmaP7556Suda çözünür. Bölüm 5 için kullanın (Hormon hazırlama - ozmotik mini pompalar)
Göz merhemini yenileyinAllerganNA%42,5 w/v sıvı parafin, %57,3 w/v yumuşak beyaz parafin
Rimadyl CarprofenZoetisNAStok 50 mg/mL. 1 mg / ml'de kullanın (5 mg / kg doz için)
Kauçuk boruDow Corning508-008% 100 etanolde yıkanır ve 1 cm'lik parçalar halinde kesilir. İç çap 1.57 mm ±   0,23 mm; Dış çap 3.18 mm ± 0,23 mm; duvar 0.81 mm.
Susam yağıSigmaS3547
Sofsilk İpek sütürler boyut 3-0CovidienGS-832
:

Kaynaklar

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248(2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809(2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378(2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yapay DesidüalizasyonEmbriyo TransferiEksojen Hormon UygulamasıSubkutan EnjeksiyonProgesteron PeletleriEndometriyal ReseptiviteUterin Kornu
Yumurtalık Ameliyatlı Fare Modelinde Gebelik Oluşumuna Uterus Katkılarını İnceleme Yöntemleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.