Yöntem makalesi

Fare yumurtalık epigenomu ve transkriptomunun hücreye özgü eşleştirilmiş sorgulaması

DOI:

10.3791/64765

⸱

24 Şubat 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, çevirici ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemi ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, bir Cyp17a1-Cre fare hattına geçilen NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomunun ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için optimize edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre tipine özgü epigenomik ve transkriptomik değişikliklerin değerlendirilmesi, yumurtalık yaşlanmasını anlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, çeviri ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yönteminin optimizasyonu ve spesifik hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu (INTACT) yöntemi, yeni bir transgenik NuTRAP fare modeli kullanılarak hücreye özgü yumurtalık transkriptomu ve epigenomunun daha sonra eşleştirilmiş sorgulaması için gerçekleştirilmiştir. NuTRAP alelinin ekspresyonu, flokslu bir STOP kasetinin kontrolü altındadır ve promotöre özgü Cre hatları kullanılarak spesifik yumurtalık hücre tiplerine hedeflenebilir. Son çalışmalar, erken yaşlanma fenotiplerinin sürülmesinde yumurtalık stromal hücrelerini içerdiğinden, NuTRAP ekspresyon sistemi bir Cyp17a1-Cre sürücüsü kullanılarak stromal hücrelere hedeflenmiştir. NuTRAP yapısının indüksiyonu yumurtalık stromal fibroblastlarına özgüydü ve dizileme çalışmaları için yeterli DNA ve RNA tek bir yumurtalıktan elde edildi. Burada sunulan NuTRAP modeli ve yöntemleri, mevcut bir Cre çizgisine sahip herhangi bir yumurtalık hücre tipini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalıklar, spesifik hücre popülasyonlarından farklı katkılarla somatik yaşlanma1'de önemli oyunculardır. Yumurtalığın hücresel heterojenliği, toplu, tüm yumurtalık tahlillerinden moleküler sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Yumurtalık yaşlanmasında spesifik hücre popülasyonlarının rolünü anlamak, yaşlı kadınlarda doğurganlık ve sağlık düşüşünden sorumlu moleküler sürücüleri tanımlamanın anahtarıdır. Geleneksel olarak, spesifik over hücre tiplerinin multi-omik değerlendirmesi, lazer mikrodiseksiyon2, tek hücreli yaklaşımlar3 veya hücre sıralama4....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Tıbbi Araştırma Vakfı'ndaki (OMRF) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ebeveyn fareler Jackson Laboratuvarı'ndan (Bar Harbor, ME) satın alındı ve OMRF'de 14 saat / 10 saatlik bir ışık / karanlık döngüsünde (ışıklar sabah 6: 00'da yanıyor) bir HEPA bariyer ortamında SPF koşulları altında yetiştirildi ve barındırıldı.

NOT: Bu gösterimde, NuTRAP dişi (Suş # 029899, Jackson Laboratuvarı) ile eşleştirilmiş bir Cyp17iCre+/−(Suş # 028547, Jackson Laboratuvarı) erkek kullanıyoruz. İstenilen Cyp17-NuTRAP soyu (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox / WT), yumurta....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRAP ve INTACT protokollerinin bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık stromal / teka hücrelerine özgüllüğü, immünofloresan görüntüleme ve TRAP ile izole RNA'dan RNA-Seq ile gösterilmiştir. İlk olarak yumurtalıkta eGFP sinyalinin immünofloresan görüntülemesi ve eGFP sinyalinin teka ve stromal hücrelere lokalizasyonu yapıldı. Kısaca, 5 μm kesitler bir ksilen ve etanol gradyanı ile deparafinize edildi. Daha iyi eGFP sinyallemesi için, eGFP proteini .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NuTRAP fare modeli6, mevcut bir Cre sürücüsü ile herhangi bir hücre tipine uyarlanabilen belirli hücre tiplerinden transkriptom ve epigenomun eşleştirilmiş sorgulaması için güçlü bir transgenik etiketleme yaklaşımıdır. Burada, Cyp17-NuTRAP fare modelinin yumurtalık teka ve stromal hücreleri hedeflemedeki özgüllüğünü gösteriyoruz. Cyp17-NuTRAP modeli, yumurtalık yaşlanması, kanser ve hastalıkta rol oynayan teka ve stromal hücreye özgü epigenetik mekanizmaları daha fazla aydınlatmak için kullanılabi.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Vakfı (M2020207) ve Presbiteryen Sağlık Vakfı'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen MERIT ödülü I01BX003906 ve Amerika Birleşik Devletleri'nden (ABD) Paylaşılan Ekipman Değerlendirme Programı (ShEEP) ödülü ISIBX004797 tarafından da desteklenmiştir. Gazi İşleri Daire Başkanlığı, Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme Servisi. Yazarlar ayrıca yardım ve cihaz kullanımı için Klinik Genomik Merkezi (OMRF) ve Görüntüleme Çekirdeği Tesisi'ne (OMRF) teşekkür eder.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.1 M SpermidinSigma-Aldrich05292-1ML-F
1 M MgCl2Thermo ScientificAM9530G
%10 NP-40Thermo Scientific85124
100 mg/mL SikloheksimidSigma-AldrichC4859-1ML
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
30 &mikro; M hücre süzgeci Miltenyi Biotec130-098-458
Tüm Hazırlık DNA/RNA Mini KitiQiagen80204
anti-GFP antikoruAbcamAb290TRAP ve IHC için (GFP'ye tavşan poliklonal)
Tampon RLTQiagen79216RNA Lizis Tamponu protokolde
cOmplete, mini, EDTA içermeyen proteaz inhibitör tabletRoche11836170001TRAP Homojenizasyonu için Tampon
Cyp17iCre fare modeliJackson Laboratuvarı28547B6; SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 mıknatısInvitrogen12321D
Genotipleme PrimerleriIDTÖzelJenerik Cre - Jackson Laboratuvar protokolü 22392, Primerler: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Jackson Laboratuvar protokolü 30847, Primerler: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Jackson Laboratuvar protokolü 21509, Primerler: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Proteaz İnhibitörü kokteyli (100X)NPB Tamponu
M-280 Streptavidin Dynabeads için Thermo Scientific 1861278 Invitrogen11205D2.8 ve mikro; m boncuk çapı
MixMateEppendorf5353000529
Çekirdek İzolasyon Kiti: Nuclei EZ PrepSigma-AldrichNuc101Çekirdek Lizis Tamponu ve Çekirdek Depolama Tamponu İçerir
1 M HEPESGibco15630-080
5 M NaClTermo BilimselAM9760G
2M KClTermo BilimselAM9640G
0,5 M EDTAThermo ScientificAM9260G
0,5 M EGTAFisher Scientific50-255-956
NuTRAP fare modeliJackson Laboratuvarı29899B6; 129S6-Gt (ROSA) 26Sortm2 (CAG-NuTRAP) Evdr / J
Pierce DTT Ağırlıksız FormatThermo ScientificA39255
Protein G DynabeadsThermoFisher10004DTRAP
RNaseOUTiçin Invitrogen10777019
Sodyum HeparinFisher ScientificBP2425
Ultra saf 1M Tris-HCl, pH 7.5Invitrogen15567-027
VWR Tüp DöndürücüFisher BilimselNC9854190
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissect....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Over TranscriptomuH cre Tipine zgNuTRAP Fare ModeliTranslasyon Yapan Ribozom AfinitesiINTACT Y ntemiOver Stromal H creleriKromatin Eri ilebilirli iRNA Dizilememm nofloresan G r nt leme

İlgili makaleler