Modifiye Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak İnsan Plazmasında Kalsitonin Geniyle İlgili Peptidin (CGRP) Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

Pavan S. Krishnan; Fernando T. Zamuner; Carolyn M. Jenks; Johnny Y. Xie; Lisa Zhang; Mohammed Lehar; Neal S. Fedarko; Mariana Brait; John P. Carey

doi:10.3791/64775

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Modifiye Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak İnsan Plazmasında Kalsitonin Geniyle İlgili Peptidin (CGRP) Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

4.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64775

⸱

16 Haziran 2023

Pavan S. Krishnan¹^,² , Fernando T. Zamuner¹^,³ , Carolyn M. Jenks¹ , Johnny Y. Xie⁴ , Lisa Zhang⁵ , Mohammed Lehar¹ , Neal S. Fedarko⁶ , Mariana Brait¹^,³ , John P. Carey¹

¹Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Virginia Commonwealth University School of Medicine, ³Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁴Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, ⁵Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, ⁶ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

İnsan plazmasındaki kalsitonin gen ilişkili peptid (CGRP) konsantrasyonları ile ilgili yayınlanmış veriler tutarsızdır. Bu tutarsızlıklar, bu nöropeptidi ölçmek için standartlaştırılmış, doğrulanmış bir metodolojinin eksikliğinden kaynaklanıyor olabilir. Burada, insan plazmasındaki CGRP'yi saflaştırmak ve ölçmek için doğrulanmış bir enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolünü açıklıyoruz.

Özet

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), migren baş ağrılarının patofizyolojisinde varsayılan bir rol oynayan ve biyobelirteç statüsü için aday olabilen vazoaktif bir nöropeptittir. CGRP, aktivasyon üzerine nöronal liflerden salınır ve trigeminal efferent innervasyon alan vaskülatürde steril nörojenik inflamasyon ve arteriyel vazodilatasyonu indükler. Periferik vaskülatüründe CGRP'nin varlığı, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi proteomik tahliller kullanarak insan plazmasında bu nöropeptidi tespit etmek ve ölçmek için araştırmaları teşvik etmiştir. Bununla birlikte, 6.9 dakikalık yarılanma ömrü ve genellikle tam olarak tanımlanamayan tahlil protokollerinin teknik detaylarındaki değişkenlik, literatürde tutarsız CGRP ELISA verileri vermiştir. Burada, insan plazmasında CGRP'nin saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için modifiye edilmiş bir ELISA protokolü sunulmaktadır. Prosedürel adımlar, numune toplama ve hazırlama, saflaştırma aracı olarak polar sorbent kullanarak ekstraksiyon, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için ek adımlar ve ELISA yoluyla nicelleştirmeyi içerir. Ayrıca, protokol spike ve geri kazanım ve seyreltme deneylerinin doğrusallığı ile doğrulanmıştır. Bu doğrulanmış protokol teorik olarak sadece migren ile değil, aynı zamanda CGRP'nin rol oynayabileceği diğer hastalıklarla da bireylerin plazmasındaki CGRP konsantrasyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Giriş

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), perivasküler lokalizasyonu olan nöronal liflerde ve nöronal olmayan dokularda bulunan 37 amino asitlik bir nöropeptittir. CGRP'nin iki formu, α- ve β-CGRP,% 90'dan fazla homolojiyi paylaşır ve fizyolojik fonksiyonları paylaşır; Bununla birlikte, αCGRP merkezi ve periferik sinir sisteminde, βCGRP ise enterik sinir sisteminde bulunur ^1,2. Nosiseptör aktivasyonu ve kalsiyuma bağımlı ekzositoz üzerine, CGRP nöronlardan salınır ve arteriyel vazodilatasyon ve plazma protein ekstravazasyonunu içeren steril nörojenik inflamasyonu indükler 3,4,5,6,7.