Modifiye Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak İnsan Plazmasında Kalsitonin Geniyle İlgili Peptidin (CGRP) Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

Kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), perivasküler lokalizasyonu olan nöronal liflerde ve nöronal olmayan dokularda bulunan 37 amino asitlik bir nöropeptittir. CGRP'nin iki formu, α- ve β-CGRP,% 90'dan fazla homolojiyi paylaşır ve fizyolojik fonksiyonları paylaşır; Bununla birlikte, αCGRP merkezi ve periferik sinir sisteminde, βCGRP ise enterik sinir sisteminde bulunur ^1,2. Nosiseptör aktivasyonu ve kalsiyuma bağımlı ekzositoz üzerine, CGRP nöronlardan salınır ve arteriyel vazodilatasyon ve plazma protein ekstravazasyonunu içeren steril nörojenik inflamasyonu indükler 3,4,5,6,7. Buradan, CGRP postkapiller damarlarda görülür ve migren 8,9,10,11 gibi afferent nosiseptif aktivasyona neden olan hastalıklar için bir biyobelirteç olabilir. CGRP, anjiyogenez ve immün modülasyondaki rolü nedeniyle COVID-19'a da dahil edilmiştir ve olumsuz hastalık evrimini öngörebilir^12,13. Bu nedenle, insan plazmasında CGRP'nin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir protokol geniş bir değere sahip olabilir.

Belki de en çok dikkat CGRP'nin migrendeki rolüne verilmiştir. Preklinik ve klinik çalışmalara dayanarak, CGRP migren için olası bir biyobelirteç ve tedavi için bir hedef olarak ortaya konmuştur 3,4,5,6,7,8,9,10. Bazı çalışmalar, kontrol katılımcılarına göre epizodik migreni olan kohortlarda CGRP yüksekliği bulmuştur^10,14,15. CGRP inhibitörlerinin migren baş ağrısı tedavisi için klinik çalışmalardaki başarısı, migren baş ağrıları için nedensel bir faktör olarak yüksek CGRP'yi ima ediyor gibi görünmektedir. Bununla birlikte, tüm araştırmacılar bu sonuçları doğrulamamıştır^16,17,18,19. Ayrıca, CGRP'nin migrenin baş ağrısı olmayan semptomlarındaki rolü henüz aydınlatılmamıştır; Mevcut çalışma, migrenin vestibüler semptomlarında CGRP'nin rolünü anlama arzusuyla motive edildi.

Literatürdeki tutarsız CGRP immünoassay verileri çeşitli nedenlere bağlı olabilir. İlk olarak, CGRP'nin periferik vaskülatürdeki yarı ömrü, serin proteazlar 21, insülin parçalayıcı enzimler ve diğer metaloproteazlar 22, nötral endopeptidazlar²³ ve endotelin dönüştürücü enzim-1^24'ün aktivitesi nedeniyle 6.9 dakika ^20'dir. İkincisi, CGRP'yi ölçmek için kullanılan immünoassayların değişken teknik detayları bu tür çalışmalarda tam olarak tanımlanmamıştır. Son olarak, immünoassay metodolojisinin standardizasyon eksikliği resmi daha da karmaşıklaştırmaktadır.

Bu makalede, insan plazmasında α- ve βCGRP'nin saflaştırılmasına ve doğru bir şekilde nicelleştirilmesine izin veren modifiye enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) protokolü açıklanmaktadır. Kitin antikorları amilin, kalsitonin veya P maddesi ile çapraz reaktif değildir. Bu protokol, verileri burada sunulan ani artış ve geri kazanım ve seyreltmenin doğrusallığı gibi gerekli doğrulama deneylerinden geçmiştir. Validasyondan geçen böyle bir CGRP ELISA protokolü daha önce literatürde tam olarak tanımlanmamıştır. Bu protokol, migrenin yanı sıra kardiyolojik 2,25, dermatolojik²⁶, obstetrik 27, romatolojik^28,29, kas-iskelet sistemi^30,31, endokrin ^32,33 ve CGRP'nin ilişkili olduğu viral hastalıklar^12,13 bağlamında insan plazmasındaki CGRP'yi ölçmek için kullanılabilir.

Bu protokol, Johns Hopkins Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (NA_00092491) onayı ile rıza gösteren bireylerden alınan insan plazma örnekleri kullanılarak geliştirilmiştir.

1. Numune toplama ve hazırlama

1. Standart venipunktur yöntemleri 34 ile antekübital venden 5 mL tam kan toplayın^ve 6 mL'lik bir vakuminer etilendiamintetraasetik asit (EDTA) toplama tüpüne alın.
2. Hedef peptidin lizizini bloke etmek için toplandıktan sonra tüpe 0.5 mL aprotinin (10.000 KIU / mL) rekabetçi serin proteaz inhibitörü ekleyin. Aprotinin'in kanla yeterince karışmasını sağlamak için tüpü 10 kez ters çevirin. Daha sonra, tüpleri bir sonraki adıma kadar buz üzerinde saklayın.
3. Tüpü 604 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de kan toplanmasından sonraki 60 dakika içinde santrifüj edin.
4. Plazma fraksiyonunu bir pipetle çıkarın ve 2 mL yuvarlak tabanlı steril kriyovyallere aktarın.
5. Kriyoviyalleri hemen -80 ° C'de 2 haftaya kadar saklayın.

2. Plazma örneklerinin ekstraksiyonu

1. 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünün içine, kartuşun dış çıkıntıları tüpün dış çıkıntıları tarafından desteklenen bir ekstraksiyon kartuşu yerleştirin.
2. Kartuştan önce 5 mL% 100 metanol ve ardından 10 mL ultra saf su geçirerek kartuşu etkinleştirin.
   1. Sıvı, yerçekimi tahrikli akış yoluyla kartuştan geçirilirken, tüpte toplanacaktır.
   2. Sıvının kartuşu yutmamasını sağlamak için biriken fazla sıvıyı dışarı atın.
   3. Deney sırasında kartuşun kurumadığından emin olun.
3. 250 μL plazmayı 750 μL% 4 asetik asit ile seyreltin.
4. 1 mL plazma ve asetik asit çözeltisini kartuştan yavaşça geçirin.
   NOT: Bu adım, geçirilen her mililitre için yerçekimi güdümlü akış yoluyla yaklaşık 30 s sürmelidir.
5. Kartuşu 10 mL% 4 asetik asit ile yıkayın. Daha önce yapıldığı gibi, sıvının kartuşu yutmamasını sağlamak için fazla sıvıyı biriktikçe atın.
6. Son asetik asit damlası kartuştan serbest bırakıldıktan sonra, kartuşu tüpten çıkarın ve yeni bir 15 mL konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
7. 2.7 mL% 4 asetik asit ve% 0.3 mL% 100 metanol karıştırarak% 100 metanol ve% 4 asetik asitten oluşan 10: 1'lik bir çözelti hazırlayın. Bu çözeltiyi kartuştan bir seferde 1 mL geçirerek CGRP'yi etkisiz hale getirmek için bunu kullanın. Geçirilen her mililitre çözelti arasında 25 dakika duraklayın. Elüenti atmayın.
8. Tüp, metanol ve asetik asit çözeltisinin son mililitresi geçtikten 25 dakika sonra 3 mL salınan sıvıyı içerecektir. Elüentin her 1 mL'sini 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
   NOT: Bu, her kartuştan üç mikrosantrifüj tüpü vermelidir.
9. Tüm elüentin her tüpün dibinde olduğundan emin olmak için her tüpü 1 s boyunca mini bir santrifüje yerleştirin.
10. Tüm numuneleri 4 °C'de vakum santrifüjleme ile kurutun (sulu çözeltiler için 1.400 rpm'de yoğunlaştırıcı işlevine ayarlayın; g-kuvveti tüplerin konumuna bağlı olarak değişir ve bu nedenle 130-250 x g arasında değişir).
    NOT: Vakumlu santrifüjün numuneleri kurutması için geçen süre, kullanılan mikrosantrifüj tüpünün tipine bağlı olacaktır.
11. Tahlil prosedürüne geçmeden hemen önce (adım 4.1), önceden kurutulmuş numuneyi oda sıcaklığına (RT) veya 20 ° C'ye çözülmüş enzim immünoassay (EIA) tamponu (bakınız Malzeme Tablosu) ile yeniden oluşturun.
    NOT: Kurutulmuş numuneyi yeniden oluşturmak için kullanılan ÇED tamponunun hacmi, orijinal numune hacmine veya 250 μL'ye eşit olmalıdır.

3. ELISA plakasının hazırlanması - spesifik olmayan bağlamayı sınırlamak için bloke etme

1. Tabaktaki her bir kuyucuğa 250 μL tris tamponlu salin (TBS)/balık jelatin bloke edici tampon ekleyin.
2. Plakanın üzerine bir kapak tabakası yerleştirin ve RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
3. Kapak tabakasını çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak ters çevirerek veya aspirasyon yaparak plakayı boşaltın. Ardından, herhangi bir sıvı izini atmak için plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurutun.
4. Plakayı laminer akış başlığında 10 dakika boyunca bırakarak kurutun.
5. Plaka gözle görülür şekilde kuruduktan sonra, silika jel kurutucu poşet ile kavrama sızdırmaz bir folyo torbaya yerleştirin ve torbayı -20 ° C'de 24 saat boyunca saklayın.
   NOT: Plakalar, plaka inkübasyonundan sonraki 4 hafta içinde kullanılmalıdır.

4. Tahlil prosedüründen önce

1. Reaktifleri (ÇED tamponu, CGRP standardı, CGRP kalite kontrol, CGRP izleyici, yıkama tamponu) kit talimatlarına göre hazırlayın. Ellman'ın reaktifini ancak 16-20 saatlik inkübasyon süresi sona erdikten sonra hazırlayın.
2. Protokolün geri kalanını gerçekleştirmeden önce tüm numuneleri ve reaktifleri RT'ye çözün.

5. Tahlil prosedürü

1. Bloke plakadaki her bir kuyucuğu, kit tarafından sağlanan bir yıkama tamponu (300 μL / kuyu) ile beş kez durulayın. Her durulama için, yıkama tamponunu kuyucuklara yerleştirdikten sonra 30 s duraklatın, ardından sıvıyı dışarı atın veya çok kanallı bir pipet kullanarak aspire edin.
2. Son durulamadan sonra, ters çevirerek (kuyucukların içindeki sıvıyı dışarı atmak için plakayı ters çevirerek) veya çok kanallı bir pipet kullanarak aspirasyon yaparak tüm tamponu kuyucuklardan çıkarın. Son damlaları bir kağıt havluya yerleştirin ve tüm sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun.
3. "Boş" kuyular olarak bilinmesi için reaktifleri veya tamponları olmayan en az iki kuyucuğu bir kenara koyun. Ardından, spesifik olmayan bağlama (NSB) için en az iki kuyu daha ayırın.
4. Her NSB kuyucuğuna 100 μL ÇED tamponu dağıtın.
5. CGRP standartlarının 100 μL'sini uygun kuyucuklara çift olarak dağıtın.
6. 100 μL numuneyi (ÇED tamponunda yeniden yapılandırılmış) ve kalite kontrolünü uygun kuyucuklara çift olarak dağıtın.
7. NSB, CGRP standartları, numuneler ve kalite kontrol içeren her bir kuyucuğa 100 μL CGRP izleyici (asetilkolinesteraza bağlı anti-CGRP antikoru) dağıtın. İzleyiciyi "Boş" kuyucuklara dağıtmayın.
8. Plakayı şeffaf bir kapak tabakası kullanarak örtün, her bir kuyucuğu kapatın, böylece her bir kuyucuktaki numuneler ve reaktifler önemli ölçüde buharlaşmaz. Plakayı 4 ° C'de 16-20 saat inkübe edin.
9. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, Ellman'ın reaktifini kit talimatlarına göre yeniden oluşturun.
10. Tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı ters çevirin. Her bir kuyucuğu (yukarıda açıklandığı gibi) 300 μL yıkama tamponu ile üç kez durulayın.
11. Üçüncü durulamadan sonra, sıvıyı plakalardan çıkarın, plakayı bir çalkalayıcı plakaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca 120 rpm'de çalkalayın.
12. Plakayı üç kez daha yıkayın. Son durulamadan sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak ters çevirme veya aspirasyon yoluyla tüm tamponları kuyucuklardan çıkarın. Son damla sıvıyı bir kağıt havluya yerleştirin ve tüm sıvı kuyucuklardan gözle görülür şekilde çıkarılana kadar ters çevrilmiş plakaya dokunun.
    NOT: Bu adımda açıklanan ilave üç yıkama, bir ELISA mikroplaka yıkayıcı kullanılıyorsa gerekli olmayabilir.
13. Her bir kuyucuğa 200 μL Ellman reaktifi dağıtın ("Boş" kuyucuklar hariç).
14. Plakayı yeni bir kapak tabakasıyla örtün ve ışığa maruz kalmayı önlemek için alüminyum folyoya sarın. RT'de karanlıkta 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
15. Arka tarafı kuru bir kağıt havluyla silerek plakanın arka tarafında, spektrofotometre okumasını karıştırabilecek sıvı olmadığından emin olun.
16. 405 nm'de (sarı renk) absorbans için plakayı okuyun.

6. Veri analizi

1. Her "Boş", NSB, standart, kalite kontrol ve numuneler için ortalama absorbansı hesaplayın.
2. NSB ortalama absorbans değerlerini standart, kalite kontrol ve numune absorbans değerlerinden çıkarın.
3. Y eksenindeki absorbansı ve x eksenindeki konsantrasyonu çizin. Dört parametreli lojistik regresyon modeli kullanarak standart bir eğri oluşturun.
4. Eğri oluşturulduktan sonra, x ekseninde okunabilen kalite kontrol ve numuneler için enterpolasyonlu konsantrasyonları belirlemek için eğrinin denklemini kullanın.
   NOT: Standart eğri, yalnızca kalite kontrol için hesaplanan enterpolasyonlu konsantrasyon beklenen konsantrasyonun% 25'i içindeyse doğrulanır (genellikle 125 pg / mL, ancak kalite kontrol şişesinin etiketine bakın).

Protokolde vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, bir serin proteaz inhibitörü olan aprotinin, CGRP'nin daha fazla enzimatik bozulmasını önlemek için toplandıktan hemen sonra tam kan örneklerine eklenmelidir. Serin proteazların CGRP metabolizmasında rol oynadığı gösterilmiştir ve önceki bir çalışmada da insanlarda CGRP'nin ölçülmesinde aprotinin kullanılmıştır21,35. Proteaz inhibitörleri kullanılmazsa ve numune hazırlama 60 dakikadan uzun sürerse, ELISA uygulandığında CGRP seviyelerinin düşmesi beklenebilir. İkincisi, ELISA'dan önce katı faz ekstraksiyonu, CGRP'yi elüentte yoğunlaştırır ve plazma matrisinden potansiyel olarak müdahale eden molekülleri ortadan kaldırır. Bu ekstraksiyon adımı, spike ve geri kazanım deneylerinde CGRP verimini arttırır (bir sonraki bölümde daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır). Ekstraksiyondan sonra soğuk bir odada vakumlu santrifüjleme, CGRP kaybını daha da sınırlar. Üçüncü olarak, ELISA'dan önce, mikrotitre plakaları bir bloke tampon kullanılarak bloke edilmelidir. Bu, tampondaki spesifik olmayan proteinlerin plakalardaki kalan bağlanma bölgelerine pasif adsorpsiyonuna izin verir, böylece arka plan sinyalini azaltır. Engelleme, gerçekçi olmayan yüksek CGRP verimini azaltmaya yardımcı olur.

Ani artış ve geri kazanım deneyleri, CGRP tespitinin standart eğri seyreltici (burada, ÇED tamponu) ile deneysel numune matrisi (burada, plazma) arasındaki farklardan etkilenip etkilenmediğini belirler. Plazma ve / veya serum, CGRP'ye antikor bağlanmasını bloke eden veya peptidi parçalayan moleküller içerebilir, böylece tahlilin CGRP'nin başlangıç konsantrasyonunu doğru bir şekilde tespit etme ve ölçme kabiliyetine müdahale eder. Bu amaçla, plazma örneklerine bilinen miktarlarda CGRP ekledik - "spiking" adımı - ve ekstraksiyon ve ELISA'dan sonra ne kadar CGRP'nin "geri kazanıldığını" hesapladık. CGRP stoğu üreticiden alınmış ve kullanıma kadar -20 °C dondurucuda saklanmıştır.

Seyreltme testinin doğrusallığında, bir numune seri olarak seyreltilir ve her seyreltme için CGRP konsantrasyonları hesaplanır. Seyreltilmiş numuneler CGRP konsantrasyonunda uygun doğrusal düşüşler göstermiyorsa, bu, ÇED tamponunun veya plazmasının bazı konsantrasyonlarda CGRP'nin tespitine müdahale ettiğini veya standart eğrinin etkilenen aralıkta doğru olmadığını gösterir. Yukarıda açıklanan başak ve geri kazanım deneyini gerçekleştirirken, "çivili" örnekleri seri olarak seyrelttik; 200 pg / mL'lik bir CGRP konsantrasyonu vermek için bir plazma numunesini çiviledik ve daha sonra numuneyi 100 pg / mL'ye ve daha sonra 50 pg / mL'ye seyrelttik.

Kardiyovasküler, solunum veya yakın zamanda baş ağrısı veya nörolojik semptomlar öyküsü olmayan üç katılımcıdan alınan plazma örnekleri, farklı CGRP konsantrasyonları ile çivilendi. Protokol, çivili olmayan kontrol örneklerine ek olarak bu örnekler için de çalıştırılmıştır. Şekil 1 , seyreltme deneylerinin başak ve geri kazanımı ve doğrusallığı için bir plaka haritası örneği göstermektedir. Doğrusal aralığın ötesine geçmeye izin veren standart bir eğri oluşturmak için dört parametreli bir lojistik uyum gerçekleştirildi (Tablo 1 ve Şekil 2). İyileşme oranları her bir çivili örneklem için hesaplandı ve kabul edilebilir aralıkta idi (Tablo 2). Seyreltmenin doğrusallığı çivili örneklerde gösterilmiştir (Şekil 3). Tablo 3 , üreticinin talimatlarını izleyerek ve spesifik olmayan bağlamayı engellemek için eklenen adımların dahil edilmesinden önce gerçekleştirilen başarısız bir ani artış ve kurtarma deneyinden elde edilen sonuçları göstermektedir. Bu veriler, spesifik olmayan bağlamanın varlığını gösteren 5'lik üst sınırı aşan kurtarma oranlarını göstermektedir. Bir blokaj tamponu kullanarak plakayı bloke etmek için protokoldeki adımları ekledikten sonra (adım 3.1-3.5), bu etkiyi azaltabildik ve kabul edilebilir geri kazanım değerlerine ulaşabildik (Tablo 2). Migren veya vestibüler semptomları olmayan üç hastada, plazmadaki ortalama CGRP konsantrasyonunun 1.68 ± 0.13 pg / mL olduğunu bulduk. Gelecekteki deneyler, mevcut metodolojiyi daha geniş bir kontrol hastası ölçeğinde kullanmayı amaçlamalıdır.

Şekil 1: Örnek plaka haritası. Her plaka, hepsi çift veya üçlü olarak standartlar, numuneler, boşluklar ve NSB kuyuları içermelidir. Boş kuyucuklar sıvı içermemelidir ve NSB kuyuları tescilli enzim immünoassay tamponu, enzime bağlı ikincil antikor ve Ellman reaktifi içermelidir. NSB kuyucukları için ortalama absorbans değerleri, standart eğri oluşturulmadan önce standardın absorbans değerlerinden çıkarılmalıdır. NSB kuyuları için ortalama absorbans değerleri, geri kazanım yüzdesi hesaplanmadan önce numunelerin absorbans değerlerinden de çıkarılmalıdır. Plaka pozisyonunun bir etkisi yoktur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Dört parametreli lojistik (4PL) regresyon standart eğrisi örneği. Bu standart eğri, Tablo 1'de görülene benzer bir biçimde bir denklemle matematiksel olarak tanımlanmıştır. 4PL regresyon eğrisi, doğrusal eğrilere kıyasla biyolojik sistemlere daha uygundur. Bu eğri ve denklem, kalite kontrollerini ve numuneleri standardın oluşturulduğu aynı plaka üzerinde interpolasyon yapmak için kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 200 pg/mL'de çivilenmiş, daha sonra seri olarak 1:2 ve 1:4 oranında seyreltilmiş örnekleri gösteren seyreltme çizgisi grafiğinin doğrusallığı. Bu veriler, çok çeşitli seyreltmeler üzerinde doğrusallığı gösterir ve bu da tahlil yönteminin çok çeşitli CGRP konsantrasyonlarında doğru olduğunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Parametre	Değer
X50	294.75
Denklem
Denklem formu

Tablo 1: X50 titreli afour-parametreli lojistik (4PL) regresyon standart eğri denklemi örneği. Bir 4PL regresyon eğrisi, biyolojik sistemlerde görülen karmaşıklığı barındırır. Bu eğri, doğrusal regresyondan daha uygun olduğu için ELISA'nın sonuçlarını analiz etmek için kullanılmıştır.

Tablo 2: Katı faz ekstraksiyonu ve plaka blokajı eksikliği nedeniyle üç kontrol katılımcısının başarılı bir başak ve iyileşme deneyinin sonuçları. Çivili numuneler için verim yüzdesi, ideal 0 verimin% 20'sine düştü, bu da CGRP tespitinin plazmanın deneysel numune matrisinden etkilenmediğini gösteriyor.

Tablo 3: Plaka blokajı eksikliği nedeniyle üç kontrol katılımcısının başarısız bir başak ve iyileşme deneyinin sonuçları. Çivili numuneler için verim yüzdesi,% 120 verimin üst sınırının çok üzerine düştü ve bu da tahlilin NSB tarafından bozulabileceğini gösteriyor. Bu sonuçları elde ettikten sonra, testten önce plakadaki NSB'yi bloke etmek için protokole 3.1-3.5 adımlarını ekledik.

Tablo 4: Üç kontrol katılımcısının başarısız bir başak ve iyileşme deneyinin sonuçları.

Yazarların ekleyeceği başka bir açıklama yoktur.