Decellularize Kıkırdak Hücre Dışı Matriks Hidrojellerinin Sentezi

Kıkırdak doku mühendisliği, hasarlı veya hastalıklı kıkırdak dokusunu yeniden oluşturmayı amaçlayan hızla gelişen bir alandır¹. Bu alandaki en önemli zorluklardan biri, kıkırdak² üretmekten sorumlu hücreler olan kondrositlerin büyümesini ve farklılaşmasını destekleyebilecek biyomimetik iskelelerin geliştirilmesidir. Kıkırdak dokusunun ECM'si, kondrositlerin davranışını düzenlemede kritik bir rol oynar. DC-ECM, doku mühendisliği uygulamaları için etkili bir iskeledir³.

Kıkırdak dokusundan DC-ECM üretmek için kimyasal, enzimatik ve fiziksel yöntemler dahil olmak üzere bir dizi teknik geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle yeterince biyomimetik olmayan ECM hidrojellerinin üretilmesine neden olur ve bu da doku mühendisliği uygulamalarında kullanım potansiyellerini sınırlar ^4,5. Bu nedenle, DC-ECM hidrojelleri üretmek için daha etkili bir yönteme ihtiyaç vardır.

Bu tekniğin geliştirilmesi önemlidir, çünkü doku yenilenmesini ve onarımını destekleyebilecek biyomimetik iskeleler oluşturmak için yeni bir yaklaşım sağlayarak doku mühendisliği alanını ilerletebilir. Ayrıca, bu teknik, diğer dokulardan ECM hidrojelleri üretmek için kolayca uyarlanabilir ve böylece potansiyel uygulamalarını genişletebilir.

Daha geniş literatürde, DC-ECM'nin doku mühendisliği uygulamaları için bir iskele olarak kullanılmasına artan bir ilgi vardır⁶. Çok sayıda çalışma, DC-ECM hidrojellerinin kıkırdak ^7,8 dahil olmak üzere çeşitli dokularda hücre büyümesini ve farklılaşmasını teşvik etmedeki etkinliğini göstermiştir. Bu nedenle, kıkırdak dokusunun doğal ECM'sini yakından taklit eden DC-ECM hidrojellerinin üretilmesi için bir protokolün geliştirilmesi, alana önemli bir katkıdır.

Bu yazıda sunulan protokol, kıkırdak dokusunun doğal ECM'sini yakından taklit eden DC-ECM hidrojellerinin üretilmesi için yeni bir yöntem sağlayarak bu ihtiyacı karşılamaktadır. Protokol, kıkırdak dokusunun hücrelerden arındırılmasını, elde edilen ECM'nin izole edilmesini ve ECM'nin biyouyumlu bir polimerle çapraz bağlanmasıyla bir hidrojel oluşturulmasını içerir. Elde edilen hidrojel, kondrositlerin büyümesini ve farklılaşmasını desteklemede umut verici sonuçlar göstermiştir.

Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Tongde Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. DC-ECM hidrojelin hazırlanması

NOT: Bu çalışmada kıkırdak, 12 aylık Bama minyatür domuzların diz eklemlerinden, kemik dokusu toplanmasından kaçınılarak elde edilmiştir.

1. Toplanan kıkırdağı alın ve bir neşter ile 1-2 mm³ parçaya bölün ve kesin.
2. 20 g kıyılmış kıkırdağı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve dokuyu tamamen batırmak için 20 mL hipotonik Tris-HCl tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) ekleyin. Santrifüj tüpünü −80 °C'lik bir dondurucuda 3 saat ve ardından 37 °C'lik bir fırında 3 saat bekletin. Dondurma ve ısıtma adımını altı kez tekrarlayın. Bu adımda, hipotonik Tris-HCl tamponunun değiştirilmesine gerek yoktur.
3. Santrifüj tüpünü 1.000 rpm hızında bir vorteks karıştırıcı kullanarak 30 saniye çalkalayın. Yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne paslanmaz çelik bir elek (gözenek boyutu: ~250 μm) yerleştirin.
4. Hücrelerden arındırılmış kıkırdağı paslanmaz çelik eleğe yavaşça boşaltın, dokuyu steril PBS ile üç kez yıkayın ve kıkırdağı toplayın.
5. 10 mL tripsin çözeltisi (PBS'de% 0.25 tripsin) ekleyin ve tüpü 24 saat boyunca 37 ° C'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Bu süre zarfında, tripsini her 4 saatte bir değiştirin. Paslanmaz çelik elek kullanarak süspansiyonu süzün ve dokuyu koruyun. Tripsin, sindirim işlemlerinden biri sırasında gece boyunca tedavi edilebilir ve bu, nihai sindirimi etkilemeyecektir.
6. Tripsinizli dokuyu hipertonik tampon (1.5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6) ile yıkayın.
7. 10 mL nükleaz çözeltisi (10 mM Tris-HCl, pH 7.5'te 50 U/mL deoksiribonükleaz ve 1 U/mL ribonükleaz) ekleyin ve tüpü 4 saat boyunca 37 °C'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
8. Nükleaz solüsyonunu çıkarın, kıkırdağı steril PBS ile üç kez yıkayın ve hipotonik Tris-HCl solüsyonu ekleyin. Santrifüj tüpünü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 20 saat durulayın.
9. Hipotonik Tris-HCl çözeltisini çıkarın, kıkırdağı steril PBS ile üç kez yıkayın ve dokuyu 24 saat daldırmak için% 1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin.
10. Triton X-100 çözeltisini çıkarın ve hücrelerden arındırılmış kıkırdağı 3 gün boyunca damıtılmış suyla iyice durulayın, damıtılmış suyu her 12 saatte bir değiştirin.
11. Kıkırdağı perasetik asit çözeltisinde (%4 etanol içinde %0.1 PAA) 4 saat bekletin. Perasetik asit çözeltisini çıkarın ve kıkırdağı üç kez steril damıtılmış suyla yıkayın.
12. Paslanmaz çelik eleği (gözenek boyutu: ~250 μm) 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Hücreleri kesilmiş kıkırdağı paslanmaz çelik eleğe yavaşça boşaltın ve kıkırdağı toplayın. DNA, kollajen ve glikozaminoglikan (GAG) içeriğini tahmin ederek kıkırdağın hücresellikten arındırma derecesini ve matris retansiyonunu test edin.
13. Hücreden arındırılmış kıkırdağı bir öğütme kabına koyun, sıvı nitrojen ekleyin ve hücreden arındırılmış kıkırdağı bir toz oluşturmak için öğütün. 2 g hücreden arındırılmış kıkırdak tozu alın, 80 mL 0.5 M asetik asit ve 20 mg pepsin ekleyin ve 24 saat sindirin. 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin; tortuyu atın ve süpernatan çözeltiyi (DC-ECM çözeltisi) toplayın.
14. Kuyucuk başına 1 mL DC-ECM çözeltisini 6 oyuklu plakalara boşaltın. 6 oyuklu plakaları bir liyofilizatöre yerleştirin. DC-ECM çözeltisini dondurun. Dondurarak kurutucudaki sıcaklık −40 °C'ye düştüğünde, vakum pompasını açın ve vakum derecesini 22 saat boyunca 10 Pa'da tutun.
15. Dondurularak kurutulmuş DC-ECM çözeltisini çıkarın, santrifüj tüplerine koyun ve −20 °C'de saklayın. Dondurularak kurutulmuş DC-ECM çözeltisinin minimum saklama süresi yarım yılı aşıyor.
16. Santrifüj tüpünde 20 mg dondurularak kurutulmuş DC-ECM çözeltisini çözmek için 1 mL steril damıtılmış su ekleyin. RT'de 1.000 rpm hızında bir vorteks karıştırıcı kullanarak 1 dakika çalkalayın. DC-ECM çözeltisine 1 mg B2 vitamini (%0,1 a/h) ekleyin, 37 °C'de 60 dakika inkübe edin ve bir hidrojel (DC-ECM hidrojel) oluşturmak için 3 dakika boyunca UV ışığı (370 nm, 3,5 mW/^cm2) ile ışınlayın.

2. Decellularize kıkırdak tespiti

1. Decellularize kıkırdağın DNA içeriği tespiti
   NOT: DNEasy Kan ve Doku Kitini kullanarak DNA'yı çıkarın.
   1. İlk olarak, bir santrifüj tüpüne 20 mg DC-ECM kıkırdağı alın. Vorteks salınımı ile 180 μL Tampon GTL ve 20 μL Proteinaz K ekleyin ve kıkırdağı tamamen eriyene kadar 56 ° C'de 4 saat inkübe edin.
   2. RT'de 1.000 rpm hızında bir vorteks karıştırıcı kullanarak santrifüj tüpünü 15 saniye çalkalayın. Ardından, 200 μL Buffer GL ve susuz etanol ekleyin ve girdap titreşimi ile iyice karıştırın. Numuneleri 4 °C'de 6.000 x g hızında 1 dakika santrifüjleyin.
   3. Adsorpsiyon kolonuna 500 μL Tampon GW1 ekleyin ve numuneleri 4 °C'de 12.000 x g hızında 1 dakika santrifüjleyin. Adsorpsiyon kolonuna 500 μL Tampon GW2 ekleyin ve 1 dakika boyunca 4 ° C'de 20.000 x g'de santrifüjleyin. Son olarak, adsorpsiyon kolonuna 50 μL sterilize su ekleyin ve DNA çözeltisini toplamak için 4 ° C'de 6.000 x g hızında 1 dakika santrifüjleyin. Bir spektrofotometre kullanarak DNA içeriğini belirleyin.
2. Decellularize kıkırdakta kollajen içeriği tespiti
   1. Hücresi kesilmiş kıkırdaktaki kollajen içeriğini tespit etmek için, kollajen amino asit belirteci olarak hidroksiprolin kullanın. 5 mg hücreden arındırılmış kıkırdağı 5 mL 6 M hidroklorik asit ile 100 ° C'de 20 dakika asitleştirin ve ardından 5 mL 6 M sodyum hidroksit çözeltisi ile nötralize edin.
   2. Bir spektrofotometre ile 570 nm'de numunenin absorbansını ölçerek hidroksiprolin içeriğini hesaplayın. Standart hidroksiprolin örneğini kullanarak bir konsantrasyon-absorpsiyon doğrusal regresyonu elde edin.
3. Decellularize kıkırdakta GAG içeriği tespiti
   NOT: DC-ECM kıkırdağındaki GAG içeriği, bir doku GAG kolorimetrik kantitatif tespit kiti kullanılarak tespit edildi. Aşağıdaki tüm reaktifler kitte mevcuttur.
   1. 200 mg DC-ECM kıkırdak tozu alın ve girdap salınımı ile 500 μL Reaktif A ekleyin. Numuneyi 4 °C'de 16 saat inkübe edin ve ardından 14.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   2. 50 mL numune çözeltisi alın ve girdap salınımı ile 50 μL yüksek tuzlu çözelti (Reaktif B) ve 50 μL asit çözeltisi (Reaktif C) ekleyin. Numuneyi 10 dakika inkübe edin.
   3. Girdap salınımı ile 750 μL boya çözeltisi (Reaktif D) ekleyin ve numuneyi karanlık koşullarda 30 dakika inkübe edin. Numuneyi 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.
   4. 1 μL temizleme solüsyonu (Reaktif E) ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneyi 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
   5. Numuneye 1 μL ayrışma çözeltisi (Reaktif F) ekleyin ve iyice karıştırın. Numuneyi karanlık koşullar altında 30 dakika inkübe edin. Son olarak, 600 nm'de bir spektrofotometre kullanarak GAG içeriğini belirleyin.
4. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) hücresinden arındırılmış kıkırdak analizi
   1. Decellularize kıkırdak ve normal kıkırdak dokusunu karşılaştırın. Numuneyi %2,5'lik bir glutaraldehit çözeltisine yerleştirin, gece boyunca 4 °C'de inkübe edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.
   2. Numuneyi 1 saat boyunca% 1 OsO4'e sabitleyin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.
   3. Numuneyi %50, %70, %90 ve %100 etanolün yanı sıra her biri 15 dakika boyunca %100 asetona sırayla daldırarak kurutun. Numuneyi 15 dakika boyunca karışık bir heksametildisilazan ve etanol (1:1) çözeltisine yerleştirin, ardından 15 dakika boyunca saf heksametildisilazan'a daldırın.
   4. Numuneyi bir HCP-2 kurutucuya yerleştirin ve ardından sıvı nitrojen kullanarak kurutun. Ardından, tamamen kurutulmuş numuneyi püskürtme kaplaması kullanarak ince bir altın-paladyum tabakası ile kaplayın ve SEM kullanarak görüntüleyin. Püskürtme kaplaması 5 dakika boyunca 120 W gücünde gerçekleştirildi. Deney aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirildi: 15 kV'luk bir çalışma voltajı ve 5 x 10⁻⁵ Pa'dan daha düşük bir vakum derecesi.
   5. TEM analizi için, numuneyi 1 saat boyunca susuz aseton ve reçine (1:1) karışımına, ardından 3 saat boyunca susuz aseton ve reçine (1:3) karışımına yerleştirin. Ardından, numuneyi gece boyunca reçineye yerleştirin.
      1. Numuneyi gömülü ortam dolu kapsüllere yerleştirin ve 70 °C'de 9 saat ısıtın.
      2. Gömdükten sonra, numuneyi ultra ince bir mikrotom kullanarak 70 nm ince dilimler halinde kesin ve bakır bir ağ üzerine yerleştirin.
      3. Bakır ağ üzerine 20 μL uranil asetat boyama solüsyonu pipetleyin ve RT'de 15 dakika boyayın. Ağı damıtılmış suyla iki kez nazikçe yıkayarak boyama solüsyonunu çıkarın.
      4. Daha sonra, bakır ağ üzerine 20 μL kurşun sitrat boyama solüsyonu pipetleyin ve RT'de 15 dakika boyayın. Ağı damıtılmış suyla üç kez yıkayın.
      5. Bakır ağı, filtre kağıdıyla kaplı temiz bir Petri kabına yerleştirin. Havayla kuruduktan sonra, TEM kullanarak bölümlerin fotoğrafını çekin. Prob, 500 nN'lik aşağı doğru bir kuvvetle uygulandı, 1 Hz hızında tarandı ve 40 Nm-1'lik bir elastik sabite (^k-değeri) sahipti. Prob ucunun yarıçapı 8 nm olarak ölçüldü.

Daha iyi bir DC-ECM kıkırdak hidrojeli hazırlamak için önceki literatürü inceledik ve gözden geçirdik ve çeşitli hücreden arındırma protokollerini hücreden arındırma oranı, immünojenisite ve mekanik işlevsellik açısından karşılaştırdık9.

Bu temelde, DC-ECM kıkırdak hidrojelini hazırladık ve radyal yönelimli ekstraktif matriks/mezenkimal kök hücre eksozom biyo-mürekkebinin osteokondral defektlerin tedavisinde etkisini araştırdık. Sonuçlar, DC-ECM kıkırdak hidrojelinin düşük immünojenisiteye sahip olduğunu ve hücre göçünü artırabileceğini ve kıkırdak onarımını destekleyebileceğinigösterdi 10.

Son yıllarda, DC-ECM kıkırdağının hazırlanmasını optimize ettik. Yukarıdaki deneysel adımları kullanarak hücrelerden arındırılmış kıkırdağı hazırladık. Sonuçlar, hücresi bozulmuş kıkırdakta DNA içeriğinin, doğal kıkırdaktakine kıyasla elimine edildiğini gösterdi (p < 0.001, Şekil 1A). Hidroksiprolin testi, kollajen içeriğinin doğal ve hücresiz kıkırdaklar arasında benzer olduğunu gösterdi (p = 0.48, Şekil 1B). DMMB testi, glikozaminoglikanın, doğal kıkırdak ile karşılaştırıldığında hücreden arındırılmış kıkırdakta iyi tutulduğunu gösterdi (p = 0.68, Şekil 1C). Ayrıca, DC-ECM'nin üst yapısını gözlemlemek için SEM ve TEM kullanılmıştır (Şekil 1D).

Bir DC-ECM hidrojeli hazırlamak için, dondurularak kurutulmuş DC-ECM çözeltisi ağırlıkça %2'lik bir nihai konsantrasyon için çözündürüldü. Ayrıca, DC-ECM çözeltisi VB2 ile karıştırıldı, ardından UVA (370 nm) ile indüklenen çapraz bağlama yapıldı (Şekil 2A). DC-ECM solüsyonunu ve DC-ECM hidrojeli mikrosantrifüj tüplerine yerleştirdik (Şekil 2B). Tüpler ters çevrildiğinde, tüplerdeki hidrojel dibe akmadı, bu da jelleşmenin bir işaretiydi. Çapraz bağlama maddesi olmadan 37 ° C'de kollajen kendi kendine birleşmeye dayalı DC-ECM çözeltisi için jelleşme süresi yaklaşık 15 dakikaydı (Şekil 2C). DC-ECM çözeltisinin ve hidrojelin viskozitesi ve dinamik modülü test edildi. DC-ECM hidrojelin çözelti viskozitesinin DC-ECM çözeltisininkinden daha yüksek olduğunu ve daha yüksek kesme hızlarının daha düşük çözelti viskozitesi ile ilişkili olduğunu bulduk (Şekil 2D). Ek olarak, hem DC-ECM çözeltisinin hem de hidrojelin depolama modülü, kayıp modülünden çok daha yüksekti, bu da her ikisinin de bir sıvıdan ziyade bir jel özelliklerine sahip olduğunu gösteriyordu (Şekil 2E). Özellikle, çapraz bağlama ve dondurarak kurutmadan sonra, SEM ile ölçülen DC-ECM çözeltisinin ve DC-ECM hidrojelinin gözenek boyutları 137.672 μm'den 37.936 μm'ye düşmüştür (p < 0.00195, Şekil 2F,G).

Şekil 1: Decellularized kıkırdağın hazırlanması ve karakterizasyonu. Decellularize kıkırdak, doğal kıkırdak ile karşılaştırıldı. (A-C) DNA, kollajen ve glikozaminoglikan (GAG) içeriğinin miktarının belirlenmesi. n = 5, ***p < 0.001 (Öğrenci t-testi). Tüm deneyler en az üç kez yapıldı. (D) SEM ve TEM ile fotoğraflanan doğal kıkırdak ve decellularize kıkırdağın mikroskobik yapıları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: DC-ECM hidrojelin hazırlanması ve karakterizasyonu. Ultraviyole ışık altında, DC-ECM çözeltisi ve VB2 çapraz bağlandı ve bir DC-ECM hidrojeli oluşturdu. (A) DC-ECM hidrojelinin molekül yapıları ve sentezi. Görünüm, karakterizasyon ve mekanik özellikler DC-ECM çözeltisi ve DC-ECM hidrojel arasında karşılaştırıldı. (B) Mikrosantrifüj tüplerindeki DC-ECM çözeltisinin ve DC-ECM hidrojelinin görüntüleri. (C) DC-ECM hidrojel ve DC-ECM/VB2 hidrojelin jelleşme süresi. n = 3, ***p < 0.001 (Öğrenci t-testi). (D) DC-ECM çözeltisinin ve DC-ECM hidrojelin viskozitesi ve (E) dinamik modülü. (F) DC-ECM çözeltisinin ve hidrojelin mikroskobik yapıları (düşük ve yüksek büyütme). Ölçek çubukları = 100 μm. (G) DC-ECM çözeltisinin ve hidrojelin gözenek boyutları. n = 5, ***p < 0.001 (Öğrencinin t-testi). Tüm deneyler en az üç kez yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.