Yöntem makalesi

Protein Arginin Metilasyonunun İncelenmesi: Yaklaşımlar ve Yöntemler

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 Ocak 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TARTIŞILAN MAKALELER:

Hutchinson, A., Seitova, A. Baculovirus ekspresyon vektör sistemi kullanılarak rekombinant PRMT proteinlerinin üretimi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Küresel ve yüksek güvenilirlikli protein R-Metilasyon analizi için kütle spektrometresi tabanlı proteomik bir yaklaşım. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile arginin metilomunun araştırılması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Hücrelerde protein arginin metiltransferaz 1-9 aktivitesini incelemek için kantitatif yöntemler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Yakınlık ligasyon testi, sabit dokuda protein arginin metilasyonunun saptanmasına, lokalizasyonuna ve miktar tayinine izin verir. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

Editöryal

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein arginin metilasyonu, geniş bir biyolojik süreç yelpazesinindüzenlenmesinde yer alan translasyon sonrası bir modifikasyondur 1,2,3. Protein arginin metiltransferazlar (PRMT'ler) ailesinin dokuz üyesi, argininleri monometil ve di-metil simetrik veya asimetrik bir şekilde metilleyebilir. Fonksiyonel sonuçların anlaşılması ve PRMT'lerin metillenmiş substratlarının kataloglanması, PRMT enzimlerinin anlaşılmasını önemli ölçüde ilerletmiş ve hastalık2 ile bağlantılarını kolaylaştırmıştır. Ek olarak, güçlü ve seçici inhibitörlerin geliştirilmesi, PRMT'leri incelemek için kimyasal biyoloji temelli yaklaşımları mümkün kılmış ve PRMT hedefleme ajanlarının klinik gelişimini hızlandırmıştır3. PRMT'ler alanı ilerledikçe, yeni yöntemler ve uygulamaları bu enzimlerin düzenlenmesinin ve biyolojisinin aydınlatılmasını sağlayacaktır.

Bu yöntem koleksiyonunda, PRMT proteinlerinin rekombinant üretimi üzerine bir makale, bakulovirüs bazlı bir ekspresyon sistemi4'ün ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bakteri ekspresyonu kullanılarak birkaç PRMT üretilebilir; bununla birlikte, PRMT7 veya PRMT5 gibi daha büyük veya karmaşık bağımlı PRMT'ler, bir böcek hücresi ekspresyon sistemi gerektirir. Bu yöntem, PRMT'lerin substratlarını belirlemek için çok sayıda in vitro çabaya zaten fayda sağlamıştır.

PRMT substratlarının hücresel ortamda incelenmesi sofistike tespit yaklaşımları gerektirir. Bu koleksiyondaki iki makale, metillenmiş argininlerin antikor zenginleştirilmesine, ardından kütle spektrometrisi nicelemesine veya nükleer manyetik rezonans (NMR) kullanılarak antikordan bağımsız nicelemeye dayanan farklı metodolojiler sunmaktadır. Farklı metilasyon durumlarını tanıyan birkaç antikor geliştirilmiş ve PRMT substratlarını tanımlayan çalışmalarda kullanılmıştır5. Kütle spektrometrisi yöntemi, metabolik etiketleme, müteakip karmaşık ayırma teknikleri ve antikor bazlı zenginleştirme6 kullanarak hücresel protein arginin metilasyonunun kantitatif değerlendirmesini sağlar. PRMT ailesinin birkaç üyesi, proteinlerin7 özünde düzensiz bölgelerinde bulunan tekrarlayan RGG motiflerinde bulunan metilasyon argininlerini tercih eder. NMR spektroskopisine dayalı yöntem, karmaşık biyolojik numuneler8 içinde güvenilir bir şekilde ölçülebildikleri tüm arginin türevlerinin (mono ve di, simetrik ve asimetrik) metilasyon durumunun ve konumunun belirlenmesini sağlar.

Son olarak, spesifik proteinlerdeki metillenmiş arginin kalıntılarını tanımlamak için iki makale, western blotlama ve yakınlık ligasyon testine (PLA) dayalı yaklaşımlar sunmaktadır. Bu yöntemlerin her ikisi de antikor bazlı tespiti kullanır ancak tespit yöntemi ve sağlanan bilgiler açısından farklılık gösterir. Western blot yöntemi niceldir ve kimyasal problarıkarakterize etmede değerli olmuştur 9. PLA, hedef protein antikorunu ve mono veya di-metil arginin için jenerik antikoru kullandığından, metillenmiş argininin uzamsal konumu hakkında bilgi sağlar, böylece spesifik antikorlar üretme ihtiyacını ortadan kaldırır ve sabit dokularda önemli ölçüde kullanılabilir10.

Birlikte, bu çeşitli metodolojiler, çeşitli hücre sistemlerinde ve hastalık durumlarında metillenmiş argininlerin sağlam bir şekilde keşfedilmesini sağlayacak ve PRMT enzimlerinin biyolojik işlevine ilişkin temel bilgileri daha da ilerletecektir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L., Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) tarafından desteklenmektedir. Yapısal Genomik Konsorsiyumu, Ontario Genomik Enstitüsü [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Yenilikçi İlaçlar Girişimi 2 Ortak Girişimi [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (Kanada ve ABD'de EMD olarak da bilinir), Pfizer ve Takeda aracılığıyla Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada'dan fon alan kayıtlı bir hayır kurumudur (no: 1097737).

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

İlgili makaleler