Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon

2.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64834

⸱

6 Ocak 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

Bu makalede

Özet

Burada, farelerde akut miyeloid lösemiyi (AML) oluşturmak ve yaymak için lösemi hücrelerinin intra-peritoneal enjeksiyonu kullanılır. Bu yeni yöntem, AML hücrelerinin seri transplantasyonunda etkilidir ve farelerde intravenöz enjeksiyon ile zorluk ve tutarsızlık yaşayabilecek kişiler için bir alternatif olarak hizmet edebilir.

Özet

Akut miyeloid lösemiyi (AML) ve kalıcı lösemi kök hücrelerini (LSC'ler) içeren ilişkili nüksleri tedavi etmek için yeni tedavilere karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Alıcı farelerde retro-orbital enjeksiyonlar yoluyla bu hücrelerin başarılı bir şekilde nakledilmesine dayanan terapileri test etmek için deneysel bir AML kemirgen modeli, zorluklarla doludur. Bu çalışmanın amacı, intraperitoneal bir yol kullanarak sağlam bir murin AML modeli oluşturmak için kolay, güvenilir ve tutarlı bir yöntem geliştirmektir. Mevcut protokolde, kemik iliği hücreleri, insan MLL-AF9 füzyon onkoproteinini eksprese eden bir retrovirüs ile dönüştürüldü. Primer AML gelişiminde donör LSC'ler olarak soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) popülasyonlarının etkinliği test edilmiş ve AML üretmek için yeni bir yöntem olarak intra-peritoneal enjeksiyon benimsenmiştir. Seri transplantasyonlarda intraperitoneal ve retro-orbital enjeksiyonlar arasında karşılaştırma yapılarak iki yöntemin karşılaştırılması ve karşılaştırılması sağlandı. İnsan MLL-AF9 virüsü ile transdübe edilen hem Lin- hem de LSK hücreleri, alıcıların kemik iliğine ve dalağına iyi aşılanmış ve tam gelişmiş bir AML'ye yol açmıştır. Donör hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu, seri transplantasyon üzerine alıcılarda AML oluşturdu ve akım sitometrisi, qPCR ve histolojik analizlerle AML hücrelerinin infiltrasyonu alıcıların kan, kemik iliği, dalak ve karaciğerinde tespit edildi. Bu nedenle, intraperitoneal enjeksiyon, donör lösemik hücrelerin seri transplantasyonu kullanılarak AML indüksiyonunun etkili bir yöntemidir.

Giriş

Akut miyeloid lösemi (AML), kötü prognozlu1 etiyolojisi olan çeşitli hematolojik malignitelerin bir türüdür. AML hayvan modellerinin oluşturulması, yeni tedavileri keşfetme çabasıyla karmaşık varyasyonlarının ve patobiyolojisinin anlaşılması için temel oluşturur2. Farelerde lösemigenez, insanlarda hastalığı taklit etmek için AML'yi güçlü bir şekilde indüklemek için karışık soy lösemi (MLL) genini içeren füzyonlar da dahil olmak üzere füzyon onkoproteinlerini eksprese eden donör hücrelerin transplantasyonunu içerir3. MLL geni ile ilişkili AML4'ün transplantasyonunda donör hücrelerin çeşitli hücresel kökenleri bildirilmiştir ve hastalığın kökeninden sorumlu hücreler hakkında çok az şey bilinmektedir.

Farelerde transplantasyon için birçok yol geliştirilmiştir; Mutant donör hücreleri doğrudan kemik iliği5'e sokan bir intra-femoral enjeksiyon yerine, venöz sinüs pleksus, kuyruk veni ve juguler veni kullanan intravenöz bir enjeksiyon, murin AML modelleri 6,7,8,9'u üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Retro-orbital (r.o.) enjeksiyon durumunda, hacim sınırlaması, yüksek teknik talep, tekrarlanan girişimler veya hatalar için az şans ve potansiyel oküler yaralanmalar gibi çeşitli doğal dezavantajlar, sınırlı veya hiç uygulanabilir alternatifi olmayan büyük tökezleyen bloklar olmuştur7. Kuyruk damarı enjeksiyonunda lokal yaralanmaların yanı sıra benzer sorunlar da olabilir; Prosedürü kolaylaştırmak için, farelerin kuyruk damarlarını genişletmek için genellikle ısıtılması gerekir10. Kuyruk damarını, özellikle C57BL / 6 fare suşunda, ek bir ışık kaynağı olmadan bulmak da zordur. Juguler ven enjeksiyonu için, araştırma personeli damarı bulmak ve olası komplikasyonları sınırlamak için yeterli eğitim gerektirir. Ek olarak, hem venöz sinüs hem de juguler ven enjeksiyonlarının anestezi altında yapılması gerekir, bu da başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bu nedenle, AML murin modellerinin oluşturulmasını kolaylaştırmak için transplantasyon için yeni yollar araştırmak caziptir.

İntra-peritoneal (i.p.) enjeksiyon yaygın olarak ilaçları, boyaları ve anestezikleri uygulamak için kullanılır 11,12,13,14,15; Ayrıca ektopik hematopoez16 için hematopoetik hücreleri tanıtmak ve çeşitli fare modellerinde kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri nakletmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21. Bununla birlikte, farelerde hematopoetik maligniteler oluşturmak için, özellikle AML hastalığının ilerlemesini incelemek için nadiren kullanılmıştır.

Bu çalışma, AML fare modellerinin üretiminde i.p. enjeksiyonunun fizibilitesini açıklamanın yanı sıra, soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) popülasyonlarının donör hücreler olarak transplantasyon verimliliğini karşılaştırmaktadır. Bu bulgular, AML ve ilişkili miyeloid lösemilerin deneysel modellerini oluşturmak için basit ve etkili bir yol sağlar. Böyle bir yöntem, hastalık mekanizmalarını daha iyi anlamamızın yanı sıra deneysel tedavileri test etmek için nispeten kolay bir model sağlama potansiyeline sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından önceden onaylanmıştır.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Ampisilin takviyeli (AP) LB agar plakaları (steril 10 cm plakalar) hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 g LB suyunu agar ile 400 mL damıtılmış suda çözün, karıştırın ve hacmi 500 mL'ye çıkarın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, ardından çözeltinin soğumasını bekleyin, çözeltiye 0,5 mL ampisilin (stok: 150 mg / mL) ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın. Hemen bir alkol lambasının yakınındaki steril 10 cm'lik bir plakaya 18 mL çözelti ekleyin, oda sıcaklığında katılaşmaya bırakın ve plakaları daha sonraki kullanıma kadar 4 ° C'de baş aşağı saklayın.
  2. 10 g LB'yi agarsız olarak 500 mL damıtılmış suda çözerek LB ortamını hazırlayın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, çözeltinin soğumasını bekleyin, çözeltiye 0.5 mL ampisilin (stok: 150 mg / mL) ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın.
  3. 485 mL 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinine (DPBS) 5 mL penisilin/streptomisin ve 10 mL ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (hiFBS) ekleyerek akış tamponunu hazırlayın.
    NOT: FBS'yi ısıtarak devre dışı bırakmak için, çözülmüş FBS şişelerini 56 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Şişelerin devrilmediğinden veya başka bir şekilde su banyosuna batırılmadığından emin olun. Sıcaklık, tam bozulma için kritik öneme sahiptir; Bunu sağlamak için, şişeleri su banyosuna koyduktan sonra sıcaklık 56 ° C'de sabitlenene kadar bekleyin. Şişeleri her 10 dakikada bir üç kez yavaşça döndürün. Serumun 30 dakikadan fazla kuluçkaya yatmasına izin vermeyin.
  4. 440 mL Dulbecco'nun modifiye kartal ortamına (DMEM) 50 mL hiFBS, 5 mL L-glutamin ve 5 mL penisilin/streptomisin ekleyerek bakım ortamı hazırlayın. 445 mL DMEM ortamına 50 mL hiFBS ve 5 mL L-glutamin ekleyerek transfeksiyon ortamı hazırlayın.
  5. 500 mL damıtılmış suya 4.145 g NH4Cl, 0.504 g NaHCO3 ve 16.81 mg etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu hazırlayın. 416,5 mL IMDM ortamına 75 mL hiFBS, 5 g sığır serum albümini (BSA), 0,5 mL 10 mg/mL insülin, 2,5 mL 4 mg/mL holo-transferrin, 3,5 μL β-merkaptoetanol, 5 mL L-glutamin ve 0,5 mL siprofloksasin ekleyerek eksik Iscove'un modifiye Dulbecco'nun besiyeri (IMDM) ortamını hazırlayın.
  6. 10 μL 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μL 10 mg/mL insülin ekleyerek sitokinlerin konsantrasyonunun 1x IMDM ortamındaki miktarın iki katı olduğu 10 mL 2x IMDM ortamı hazırlayın, ve 50 μL 4 mg/mL holo-transferrin, 9.87 mL tamamlanmamış IMDM ortamına dönüşür.
    NOT: Kullanmadan önce akış tamponunun, RBC lizis tamponunun, bakım ortamının, transfeksiyon ortamının ve tamamlanmamış IMDM ortamının filtre sterilize edildiğinden emin olun.

2. Plazmid dönüşümü

  1. 20 μL α-Select yetkin hücrelerini buz üzerinde çözün. Çözülmüş yetkin hücrelere 1 μL (~2 ng) MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plazmid22 ekleyin ve tüpe dokunarak hafifçe karıştırın. Reaksiyonu buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Karışımı 42 °C'lik bir ısıtma bloğunda 40 s inkübasyonla ısındırın. Tüpü hemen 2 dakika boyunca buz üzerinde aktarın.
  3. Tüpe 1 mL LB ortamı (ampisilin olmadan) ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C ve 200 rpm'de çalkalayın.
  4. Tüpü oda sıcaklığında 500 x g'de 4 dakika boyunca santrifüj edin ve 0.9 mL süpernatan atın. Çökeltiyi kalan 0,1 mL LB ortamında yeniden askıya alın.
  5. Dönüştürülmüş yetkin hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) AP LB agar plakalarına yayın. Plakayı 12-16 saat boyunca 37 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
  6. Tek bir koloni seçin ve dönüştürülmüş hücreleri 37 °C ve 200 rpm'de bir gecede 10 mL AP LB ortamında harcayın.
  7. Bir şişede 500 mL AP LB ortamına 5 mL harcanmış dönüştürülmüş yetkin hücre ekleyin ve şişeyi gece boyunca 37 ° C ve 200 rpm'de inkübe edin.
  8. Üreticinin talimatlarına göre bir plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak plazmidi ekstrakte edin ve 0,5 mL otoklavlanmış ultra saf suda yeniden askıya alın. Bir spektrofotometre kullanarak plazmidi sayısallaştırın.

3. Phoenix Ecotropic (pECO) hücrelerinin transfeksiyonu

  1. Kültür 2 x 106 pECO hücreleri/plakası, 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörde 10 cm'lik plakalarda bakım ortamında. pECO hücrelerinin üstel büyüme fazında tutulduğundan ve geçişten önce aktif olarak bölündüğünden emin olun.
  2. Hücreler% 80 birleşdiğinde, plakaları iki kez 5 mL DPBS ile yıkayın, plakaya 1 mL tripsin ekleyin ve 2 dakika boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Hücreleri steril 15 mL'lik bir tüpte 5 mL bakım ortamı ile toplayın ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de ve 400 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini 5 mL bakım ortamında yeniden askıya alın.
  3. 10 μL hücre süspansiyonu ve 10 μL tripan mavisini karıştırın ve hücreleri saymak için bir hemositometreye 10 μL yükleyin.
    Toplam hücre/mL = (Sayılan toplam hücre sayısı x Seyreltme faktörü x 104 hücre/mL)/ Sayılan kare sayısı)
    2 x 106 hücre/tabağı 37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörde transfeksiyon ve kültür için 5 mL bakım ortamı kullanarak 6 cm'lik kaplara tohumlayın.
  4. Bakım ortamını, hücreler 18 saatlik kültürden sonra% 50-60 oranında birleştiğinde 5 mL transfeksiyon ortamı ile değiştirin.
  5. Transfeksiyon reaktifini transfeksiyondan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
  6. Steril 1,5 mL'lik bir tüpe 5,5 μg MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plazmid22 ila 0,5 mL düz DMEM ortamı ekleyin. Tüpe dokunarak hafifçe karıştırın ve 10 dakika oturmasına izin verin.
  7. Tüpe 14.6 μL (plazmid miktarının 3 katı; v / w) transfeksiyon reaktifi ekleyin ve tüpe her 10 dakikada bir üç kez hafifçe dokunun.
  8. Karışımı, transfeksiyon ortamındaki pECO hücreleri ile bulaşıkların tüm alanlarına damla damla ekleyin. Bulaşıkları nazikçe 10 kez ileri ve geri ve 10 kez yana doğru hareket ettirin. Bulaşıkları nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
  9. Transfeksiyon verimliliğini,22'de açıklandığı gibi yeşil floresan protein (GFP) için floresan mikroskobu ve akış sitometrisi ile ölçün. Hücreler ilk önce FSC-A / FSC-H ve FSC-A ve SSC-A üzerine kapılıdır ve singlet elde edilir. GFP + popülasyonu, transfekte olmayan hücrelerle karşılaştırılarak FL1 grafiği üzerinde geçitlenir.
  10. Süpernatantları 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden toplayın ve steril 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin. Süpernatantları iletim için hemen kullanın veya sıvı azotta dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
    NOT: pECO hücreleri uygun şekilde karıştırılmalı ve yemeklere eşit şekilde tohumlanmalıdır. Tohumlama sırasında bulaşıkları 10 kez ileri ve geri ve 10 kez yana doğru hareket ettirerek hücrelerin yayılmasına izin verin. Tohumlanacak hücre sayısı, sayımdaki değişikliklere bağlı olarak değişebilir. 18 saatlik kültürden sonra% 50-60 birleşme sağlayabilen en uygun tohumlama hücresi sayısını bulmak için, seri seyreltmeli hücrelerin tohumlanması yararlıdır.

4. Lentiviral transdüksiyon

  1. Bir CO2 odasında 8-10 haftalık CD45.1 dişi C57BL6 / J fareleri (alıcı fare başına iki ila üç donör fare) ötenazi yapın.
  2. Farelerin tüm vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin. Fareleri strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin.
  3. Cildi orta hatta karın boşluğunun üzerinde kesin ve deri altı boşluğunu keskin uçlu steril makasla arka bacaklara doğru genişletin.
  4. Kesi karın orta hattından ayak bileklerine kadar uzatın. Arka ayakların altındaki deri altı boşluğunu keskin uçlu steril makas bıçaklarıyla genişletin.
  5. Aşil tendonunu keskin uçlu steril makasla kesin. Tendonu dişlerle forseps kullanarak tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı diğer ucu kesin.
  6. Diz üzerine tutturulmuş kuadriseps tendonunu keskin uçlu steril makasla kesin. Tendonu dişlerle forseps kullanarak tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı kas kafalarını kesin.
  7. Tibiaya tutturulmuş femuru çevreleyen diğer kasları keskin uçlu steril makasla kesin.
  8. Ayak bileğini keskin uçlu steril makasla kesin ve tibianın bozulmadan kalmasını sağlayın. Forseps kullanarak femurun distal ucunu dişlerle tutun ve kalça eklemini keskin uçlu steril makasla kesin, femur başının sağlam kalmasını sağlayın.
  9. Tibias ve femurları steril 15 mL'lik bir tüp içinde akış tamponuna aktarın.
  10. Tibia ve femuru diz elle kırarak ayırın. Tibial platoyu ve distal femuru elle ortaya çıkarmak için patella, kıkırdak ve femoral kondilleri çıkarın. Steril bir gazlı bez kullanarak kasları çıkarın ve ardından kemikleri akış tamponuna batırın.
  11. Femur boynunu kesin ve kemik iliği hücrelerini 23 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak femurun her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın.
  12. Tibial malleolusu kesin ve kemik iliği hücrelerini 23 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak tibianın her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın.
  13. 18 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri dağıtın. Tek hücreli süspansiyonu 4 °C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
  14. Süpernatantı atın ve RBC'leri 3 dakika boyunca lize etmek için hücreleri 5 mL RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın.
  15. Lizisi durdurmak için 5 mL akış tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
  16. Steril 50 mL'lik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Peletleri 5 mL akış tamponu ile askıya alın, karıştırın ve hücreleri toplamak için hücre süzgecinden geçirin.
  17. Akış tamponu ile hücre konsantrasyonunu yuvarlak tabanlı polipropilen tüplerde 1 x 108/mL'ye ayarlayın.
  18. Üreticinin talimatına göre bir fare hematopoetik hücre izolasyon kiti kullanarak Lin- hücrelerini seçin.
  19. Bir lekesiz kontrol için 100 μL tamponda 1 x 104 hücreden oluşan üç tüpü ve APC konjuge fare karşıtı CD117 (c-Kit) ve PE-Cy7 konjuge fare karşıtı Ly-6A/E (Sca-1) için iki tek antikor lekeli kontrolü bir kenara bırakın. Tek bir antikor boyalı kontrol için 1 μL antikor (0.2 mg / mL stoktan) kullanın.
  20. Hücrelerin geri kalanını her iki antikorla (her biri 0.2 mg / mL stoklardan 4 μL) 400 μL'de bir tüpte lekeleyin.
  21. Boyama işleminden sonra, 1 mL akış tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 3 dakika boyunca 4 ° C'de ve 400 x g'de santrifüj yapın.
  22. Lekesiz kontrol ve tek antikor boyalı kontroller için hücreleri 100 μL akış tamponunda yeniden askıya alın. Çift antikor boyalı hücreleri sıralama için 1 mL akış tamponunda yeniden askıya alın.
  23. Hematopoetik kök hücreleri (HSC'ler),23,24'te açıklandığı gibi bir hücre sıralayıcı kullanarak bir LSK popülasyonu olarak sıralayın.
  24. Boyama yaparken, steril 6 cm'lik bir kabı aşağıdaki gibi retronektin ile kaplayın: PBS'de 100 μg / mL retronektin stoğu hazırlayın ve 6 cm'lik bir kaba 0.9 mL PBS ve 0.1 mL retronektin ekleyin. Çanağı 2 saat boyunca oda sıcaklığında steril bir başlıkta kaplayın. Daha sonra, retronektini çıkarın ve kabı 30 dakika boyunca 0.5 mL filtrelenmiş% 2 BSA (PBS'de) ile bloke edin. Çanağı iki kez 5 mL PBS ile yıkayın ve çanak iletim için hazırdır.
  25. Sıralanmış HSC'leri veya sıralanmamış Lin- hücrelerini 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve retronektin kaplı bir kapta 3 mL 2x (sitokin) IMDM ortamı ve 3 mL viral süpernatant (adım 3.10'dan üretilen) içinde yeniden askıya alın. Çanağı nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 6 veya 24 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Bu çalışmada, Lin- hücreleri deneysel tasarıma bağlı olarak ya sıralanmış ya da sıralanmamıştır.

5. Seri transplantasyon (Şekil 1)

NOT: Primer alıcı fareler 8-10 haftalık erkek C57BL6/J farelerdi (CD45.2). Fırsatçı sindirim enfeksiyonlarını önlemek için transplantasyondan 3 gün öncesinden transplantasyondan 7 gün sonrasına kadar antibiyotik içeren su ad libitum sağlandı. Primer alıcı fareler transplantasyondan 3 saat önce sublethally ışınlandı (4.75 Gy)25. İzofluran intraperitoneal enjeksiyonlu farelere uygulanmadı.

  1. 6 veya 24 saat boyunca transdüksiyondan sonra, hücreleri oda sıcaklığında santrifüjleme ve 3 dakika boyunca 400 x g ile toplayın. Gerekirse çanak tabanına bağlı hücreleri toplamak için tripsin kullanın. Süpernatantı atın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS'de yeniden askıya alın. Alıcı sayısına bağlı olarak PBS'nin hacmini belirleyin (yani, retro-orbital ve intra-peritoneal enjeksiyonları olan alıcılar için sırasıyla 0.1 mL / fare ve 0.5 mL / fare).
  2. Sublethally ışınlanmış alıcı fareleri bir izofluran odasına yerleştirin (oksijen akış hızı 1.0 L / dak olarak ayarlanır ve izoflurane buharlaştırıcısı% 5 olarak ayarlanır). Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere ıslak merhem sürün. Fareler, kalp atışı dakikada 60 atıma düştüğünde daha ileri prosedürler için hazırdır.
  3. Hücreleri birincil alıcı farelere retro-orbital olarak (0,1 mL/fare)7 veya intraperitoneal olarak (0,5 mL/fare)26 27 G1/2 iğne ile enjekte edin. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinç kazanana kadar fareleri sürekli olarak gözlemleyin. Transplantasyon sonrası refahları için fareleri günlük olarak izleyin.
  4. 1 ay sonra, aşağıda tarif edildiği gibi bir hemavet üzerinde tam kan sayımını (CBC) değerlendirerek lökositozu izlemek için retro-orbital kanama ile haftalık kan toplayın.
    1. İzofluran ile anesteziden sonra fareyi yanal olarak yerleştirin (oksijen akış hızı 1,0 L/dak ve izoflurance buharlaştırıcısı %5 olarak ayarlanır). Fareler, kalp atışı dakikada 60 atıma düştüğünde daha ileri prosedürler için hazırdır.
    2. Gözü başparmak ve işaret parmağı ile proptoz. Venöz sinüs pleksusuna asteril hemacrit kılcal tüp ile iç kanthustan nüfuz edin.
    3. Bir EDTA kan toplama tüpüne 20-25 μL kan toplayın ve kanamayı durdurmak için göz kapaklarını kapatın. Göze bir damla gentamisin sülfat oftalmik çözeltisi uygulayın.
  5. Son noktada, beyaz kan hücreleri (WBC'ler) 4 x 10 4 hücre / μL'ye ulaştığında, fareyi bir CO2 odasında ötenazi yapın ve femurları ve tibiaları akış tamponu ile yıkayarak kemik iliği hücrelerini izole edin, ardından adım4'te belirtildiği gibi RBC lizisi izleyin.
  6. Son noktada, splenositleri aşağıda belirtildiği gibi hasat edin.
    1. Fareyi bir CO2 odasında ötenazi yapın. Fareleri strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi ped üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin. Farelerin tüm vücudunu% 70 etanol ile sterilize edin.
    2. Karın boşluğunu keskin uçlu steril makasla ortaya çıkarmak için orta hattaki cildi ve kası kesin. Dalağı keskin uçlu steril makasla izole edin ve steril 15 mL'lik bir tüp içinde akış tamponuna koyun.
    3. Dalağı, 3 mL akış tamponuna sahip 6 cm'lik bir tabakta 70 μm steril bir süzgeçten geçirin. Hücreleri çanaktan steril bir 15 mL tüpe aktarın ve tek hücreli süspansiyonu 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
    4. Süpernatantı atın ve RBC'leri 3 dakika boyunca lize etmek için hücreleri 5 mL RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Lizisi durdurmak için 5 mL akış tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de ve 400 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin.
    5. Steril 50 mL'lik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin. Peletleri 5 mL akış tamponu ile askıya alın, karıştırın ve hücreleri toplamak için hücre süzgecinden geçirin.
  7. Splenositleri ve kemik iliği hücrelerini FITC-konjuge anti-fare CD45.1 antikoru ile boyayarak ve bir akış sitometresinde tespit ederek primer (1°) AML hücrelerini tanımlayın. Hücreler ilk önce FSC-A / FSC-H ve FSC-A ve SSC-A üzerine kapılıdır ve singlet elde edilir. CD45.1+ popülasyonu, lekelenmemiş hücrelerle karşılaştırılarak FL1 grafiği üzerinde geçitlenir.
  8. Sekonder (2°) transplantasyon için, PBS'deki (0.1 mL/fare) 1° r.o. alıcılarından CD45.1 AML dalak hücrelerini yeniden askıya alın ve CD45.2 erkek C57BL6/J farelere retro-orbital olarak enjekte edin. Buna paralel olarak, PBS'deki (0.5 mL / fare) 1 ° i.p. alıcılarından AML splenik hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları 8-12 haftalık kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden Ai14TdDomates erkek farelere intraperiton olarak enjekte edin27.
  9. Üçüncül (3°) transplantasyon için, 2° i.p. alıcılarının kemik iliğinden veya periton boşluğundan izole edilen AML hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları sırasıyla Ai14TdDomates (RFP +) veya CD45.2 farelerine intraperiton olarak enjekte edin. 2° r.o. alıcılarının periton boşluğundan izole edilen AML hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları Ai14Tddomates (RFP +) farelerine r.o. enjeksiyonu ile nakledin.
    NOT: 2° transplantasyon için, periferik kandaki CBC'yi izleyerek 2° alıcılarda hastalığın ilerlemesini belirledik. AML'nin kuruluşunu daha da doğrulamak için, kalp delinmesi, kemik iliği, dalak ve karaciğer ile tüm periferik kanı topladık. Ayrıca, i.p. hücrelerini toplamak için i.p. lavajı yaptık. Tek hücreli süspansiyonlar, yukarıda tarif edildiği gibi kemik iliği, dalak ve i.p. lavajından elde edildi. Bu bölgelerden gelen hücreler, RBC lizizini takiben bir akış sitometresinde analiz edildi. AML hücreleri RFP negatif (RFP-) hücreler olarak tanındı. 3° transplantasyon için uç noktada kan, kemik iliği, dalak, karaciğer ve i.p. hücrelerini örnekledik; RFP veya CD45.1+ hücreleri AML hücreleri olarak tanımlandı ve akım sitometrisi ile incelendi. 2° ve 3° alıcı farelere ışınlama veya antibiyotik su verilmedi.

figure-protocol-1
Şekil 1: Kemik iliği HSC'lerinde MLL-AF9 viral transdüksiyonunun şeması ve seri transplantasyon (1°, 2° ve 3°). Sca-1 ve c-Kit çift pozitif popülasyonunun, kaynakların izin vermesi durumunda, noktalı gölge kutusunda gösterilen bir hücre sıralayıcısı kullanılarak sıralanması isteğe bağlı olarak kabul edilir. Şekil BioRender (https://biorender.com/) kullanılarak oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. İntra-peritoneal lavaj

  1. Hücreleri 15 mL'lik steril bir tüpte toplamak için periton boşluğuna iki kez 5 mL tamamlanmamış IMDM ortamı enjekte edin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında ve 400 x g'da 3 dakika boyunca santrifüj edin. 2° alıcıların periton boşluğundan AML hücrelerini (4 x 105 hücre/fare) 3° CD45.2 alıcı farelere i.p. enjeksiyonu yoluyla nakledin (n = 3).

7. Histolojik analiz 28

  1. Dalakları, karaciğerleri ve femurları ötenazi üzerine farelerden izole edin. Bunları 5 mL'lik (v/v) tamponlu formalin içinde sabitleyin. Karşılaştırmalar için dalakları ve karaciğerleri sağlıklı meslektaşlarından örnekleyin.
  2. Sabit dokuları parafine gömün ve bölümlere ayırın. Kesitleri hematoksilin ve eozin (H&E) boyaları ile lekeleyin.
  3. Görüntüleri mikroskop altında, histolojik analiz için uyumlu bir yazılımla yüklenmiş 20x büyütmede elde edin.

8. Yarı kantitatif PCR (qPCR) uygulanması

  1. RNA reaktifindeki RNA'ları üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
  2. Üreticinin talimatlarına göre bir cDNA ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'yı sentezlemek için 0.5-1.0 μg RNA'ları kullanın.
  3. Bir qPCR kiti kullanarak qPCR gerçekleştirmek ve örnekleri bir qPCR sisteminde çalıştırmak için cDNA'yı kullanın. Aşağıdaki önceden doğrulanmış TaqMan problarını kullanın: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 ve 18S ribozomal RNA (Hs99999901_s1).
  4. İfadeyi görselleştirmek için KMT2A ve 18S amplikonlarını% 2'lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin. Uyumlu yazılım programıyla birlikte yüklenen bir görüntüleyicide görüntü alın.

9. Veri işleme

  1. İstatistiksel analiz yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin ve sonuçları SEM'± ortalama olarak sunun. ticari bir illustrator aracı kullanarak rakamlar oluşturun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Murin AML hücrelerinin transplantasyon etkinliğinin r.o. ve i.p. transplantasyon yolları kullanılarak karşılaştırılması
Daha önce, MLL-AF9-transdüse LSK hücreleri ile retro-orbital olarak nakledilen alıcı farelerde 1° AML oluşumu bildirilmiş ve 1° AML hücrelerinin nakledilebilirliği seri transplantasyon30 ile gösterilmiştir. Bu çalışma, transplantasyon gerçekleştirmek için kemik iliği Lin-hücrelerinin kullanılma olasılığını değerlendiren ilk çalışmadır. Anormal lökos...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıda tarif edilen bu çalışmalar, Lin- hücrelerinin transplantasyonunun 1 ° murin AML oluşumundaki LSK hücreleri ile karşılaştırılabilir olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ek olarak, mevcut veriler ayrıca i.p. enjeksiyonunun, intravenöz (veya ro) enjeksiyona kıyasla murin AML'yi oluşturmak için etkili ve uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.

LSK hücrelerine ek olarak, granülosit-monosit progenitör (GMP), ortak lenfoid progenitör (CLP) ve ortak miyeloid progenitö...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, Huck Enstitüsü'nün Akış Sitometri Çekirdek Tesisi'ne ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi, Veterinerlik ve Biyomedikal Bilimler Bölümü, Hayvan Teşhis Laboratuvarı'nın Histopatoloji Çekirdek Tesisi'ne zamanında teknik destek sağladıkları için teşekkür eder. Bu çalışma, Amerikan Kanser Araştırmaları Enstitüsü (KSP), Penn State Tarım Bilimleri Koleji, Penn State Kanser Enstitüsü, USDA-NIFA projesi 4771, K.S.P. ve R.F.P.'ye 00000005 katılım numarası ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
a-Yetkili hücreleri seçin BiolineBIO-85027
Amonyum klorür (NH4< / sub>Cl)Sigma AldrichCat # A-9434
AmpisilinSigma Aldrich Cat# A0797
Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V & mdash; Düşük Endotoksin Sınıfıİkizler biyo-ürünleriKedi # 700-102P
Siprofloksasin HClGoldBio.comKedi # C-861-100
DMEM, yüksek glikoz, glutamin yokGibcoKedi # 11960-044
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)CorningCat # 21-031-CV
EDTA, Disodyum Tuzu (EDTA-2Na), Dihidrat, Moleküler Biyoloji SınıfıCalbiochemCat # 324503
Fetal Sığır Serumu - Premium SelectAtlanta BiologicalsCat # S11550
Holo-transferrin, sığırSigma AldrichCat # T1283
İnsülin çözeltisi insanSigmaCat# I-9278
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Orta (IMDM)GibcoCat# 12440-053
L-glutamin 200 mM (100&kez;) çözümüHyClone, GelifesciencesCat# SH30034.01
LB et suyu, LennoxNEOGENCat #: 7290A
Agarlı LB Suyu (Miller)Sigma AldrichCat# L-3147
Fare anti-fare CD45.1 (FITC)Miltenyi BiotecKedi # 130-124-211
Fare İnterlökin-3 (IL-3)İkizler biyo-ürünleriKedi # 300-324P
Fare İnterlökin-6 (IL-6)İkizler biyo-ürünleriKedi # 300-327P
Fare Kök Hücre Faktörü (SCF)İkizler biyo-ürünleriKedi # 300-348P
Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100xCorningCat# 30-002-CI
Phoenix-Eco (pECO) hücreleriATCCCRL-3214
Potasyum Bikarbonat (KHCO3), GranülJT. FırıncıKedi # 2940-01
Sıçan anti-fare CD117 (c-kit) (APC)BioLegend Kedi # 105812
Sıçan anti-fare Ly-6A / E (Sca-1) (PE-Cy7)BD PharmingenKedi # 558162
Rekombinant Murin Flt3-LigandPepro Tech, INC.Kedi # 250-31L
RetroNectin Rekombinant İnsan Fibronektin FragmanıTaKaRaCat # T100A
Trans< / em > IT-293 ReaktifMirusBioCat # MIR 2705
TRI ReaktifSigma AldrichCat # T9424
Tripan Mavisi Çözeltisi,% 0.4GibcoCat # 15250061
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısıGibcoCat # 25200-056
& beta ; -Merkaptoetanol (BME)Sigma AldrichCat # M3148
< güçlü> Ticari Tahliller 
EasySep Fare Hematopoietik Progenitör Hücre İzolasyon Kiti Kök Hücre teknolojileriCat# 19856A
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti Termo Balıkçı Kedi # 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMixQuanta BioKedi # 95051-500
Plazmid Maxi Kiti (25)QiagenKedi #: 12163
< güçlü > Hayvanlar < / güçlü >
>< Ai14 < sup> TdTomato< > < / em > FarelerJackson LaboratuvarSuşu # 007914
CD45.1 C57BL6 / J fareler ve nbsp;Jackson LaboratuvarSuşu # 002014
CD45.2 C57BL6 / J fareler Jackson LaboratuvarZorlanması # 000664
Aletler ve Yazılımlar
Adobe illustrator Sürüm 25.2.3
BD accuri C6 akış sitometresiBD Biosciences
FlowJo 10.8.0BD
GeneSys yazılım programı Sürüm 1.5.7.0
GraphPad Prism sürüm 6 GraphPad
Hemavet 950FS Drew Scientific
7300 Gerçek zamanlı PCR sistemiUygulamalı Biyosistemler
Syngene G:BOX Chemi XR5 Kemilüminesans Floresan GörüntülemeG:Box Chemi

Kaynaklar

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152(2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360(2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

AML Fare ModeliL semi K k H creleriRetro Orbital EnjeksiyonKemik li i Transd ksiyonuMLL AF9 F zyonuLineaj Negatif H crelerAk SitometrisiSeri Transplantasyon
Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.