Yöntem makalesi

Ağ Farmakolojisi Akciğer Adenokarsinomuna Karşı Trikosantiz-Fritillaria Thunbergii Etki Mekanizmasının Tahmini ve Deneysel Validasyonu

DOI:

10.3791/64847

⸱

3 Mart 2023

 ,  ,  , 
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulamaya dayanarak akciğer adenokarsinomunun tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin mekanizmasını ortaya koymaktadır. Çalışma ayrıca, PI3K / AKT sinyal yolunun Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin akciğer adenokarsinomunun tedavisinde etkisinde hayati bir rol oynadığını göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer adenokarsinomunun (LUAD) tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin mekanizmasını ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulamaya dayalı olarak incelemeyi amaçladık. Trichosanthis ve Fritillaria thunbergii'nin etkili bileşenleri ve potansiyel hedefleri, geleneksel Çin tıbbının yüksek verimli deney ve referans rehberliğinde (HERB) veritabanı ve benzerlik topluluğu yaklaşımı (SEA) veritabanı ile toplandı ve LUAD ile ilgili hedefler GeneCards ve İnsanda Çevrimiçi Mendel Kalıtım (OMIM) veritabanları tarafından sorgulandı. Cytoscape yazılımı tarafından bir ilaç-bileşen-hastalık-hedef ağı oluşturulmuştur. Protein-protein etkileşimi (PPI) ağı, gen ontolojisi (GO) fonksiyonu ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizleri, çekirdek hedefleri ve anahtar yolları elde etmek için yapılmıştır. Sonraki deneysel doğrulama için Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ve A549 hücrelerinin sulu bir ekstraktı kullanıldı. HERB veri tabanı ve literatür taraması yoluyla, 31 etkili bileşik ve Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin 157 potansiyel hedef geni tarandı, bunlardan 144'ü akciğer adenokarsinomunun tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin düzenleyici hedefleriydi. GO fonksiyonel zenginleştirme analizi, Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin akciğer adenokarsinomuna karşı etki mekanizmasının esas olarak protein fosforilasyonu olduğunu göstermiştir. KEGG yol zenginleştirme analizi, akciğer adenokarsinomunun Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ile tedavisinin esas olarak PI3K / AKT sinyal yolunu içerdiğini göstermiştir. Deneysel doğrulama, Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin sulu bir ekstraktının A549 hücrelerinin çoğalmasını ve AKT'nin fosforilasyonunu inhibe edebileceğini göstermiştir. Ağ farmakolojisi ve deneysel doğrulama yoluyla, PI3K / AKT sinyal yolunun akciğer adenokarsinomunun tedavisinde Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin etkisinde hayati bir rol oynadığı doğrulanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer kanseri, skuamöz hücreli karsinom, adenokarsinom, büyük hücreli karsinom ve küçük hücreli karsinom1 dahil olmak üzere akciğer bronşiyal mukozasından köken alan malign tümörleri ifade eder. Akciğer adenokarsinomu (LUAD) en sık görülen akciğer kanseri türüdür ve toplam akciğer kanseri vakalarının yaklaşık% 40'ını oluşturur2. Çoğu hastaya ileri evrede tanı konulur veya uzak metastazı vardır ve bu nedenle ameliyat fırsatını kaybeder3. Mevcut klinik tedavide, eşzamanlı kemoradyoterapi LUAD tedavisinde en yaygın stratejidir, ancak ciddi advers reaksiyonlar nedeniyle uygulaması sınırlıdır4.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), LUAD hastalarının klinik semptomlarını etkili bir şekilde hafifletebilir ve radyoterapi ve kemoterapinin neden olduğu advers reaksiyonları azaltabilir ve böylece bir araştırma noktası haline gelmiştir 5,6,7. Geleneksel Çin tıbbında, akciğer kanseri "akciğer birikimi" ve "pulmoner petroz" kategorisine aittir. Qi eksikliği ve balgam, staz ve zehir etkileşimi akciğer kanserinin patogenezinde önemlidir. Bu nedenle, Qi'yi tonlamak ve balgam ve kan stazını ortadan kaldırmak, TCM teorisi9'a göre akciğer kanseri için ana klinik tedavi8 yöntemidir. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) ve Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu), akciğer kanseri tedavisinde yaygın bir ilaç çiftini temsil eder ve bu kombinasyon, ısıyı temizleme ve balgam10,11,12'yi azaltma etkilerine sahiptir. Bununla birlikte, etki mekanizması hala belirsizdir ve daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.

Ağ farmakolojisi, çoklu ilaçlar ve hastalıklar arasındaki karmaşık ağ ilişkilerini ortaya çıkarmayı amaçlayan sistem biyolojisi ve çok yönlü farmakoloji teorisine dayanan kapsamlı bir yöntemdir13. Geleneksel Çin reçeteleri çok bileşenli ve çok hedefli olma özelliklerine sahiptir, yani ağ farmakolojisi çalışması için çok uygundurlar14,15. Son zamanlarda, ağ farmakolojisi TCM formüllerinin çalışmasında güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmış ve bir araştırma noktası haline gelmiştir16,17.

Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, ağ farmakolojisi ile ilgili tüm araştırmalar metin olarak sunulmaktadır. Bu teknolojiyi video yoluyla sunmak, öğrenme eşiğini büyük ölçüde azaltacak ve bu makalenin avantajlarından biri olan bu teknolojinin tanıtımını kolaylaştıracaktır. Bu çalışmada, ağ farmakolojisi tahmini ve deneysel validasyonu gerçekleştirmek için akciğer adenokarsinomuna karşı Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'yi örnek olarak aldık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm ağ farmakolojisi prosedürleri, Ağ Farmakolojisi Değerlendirme Yöntemleri Kılavuzu18'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm deneysel prosedürler Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nin laboratuvar yönetimi yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Ağ farmakolojik tahmini

  1. Aktif bileşenlerin seçimi
    1. HERB veritabanını (http://herb.ac.cn)19 açın ve iki ilacın bileşenlerini elde etmek için anahtar kelimeler olarak "Gualou" ( Trichosanthes kirilowii Maxim'in Çince adı) ve "Zhebeimu" (Bulbus Fritillariae thunbergii'nin Çince adı) kullanın. İki ilacın ilgili bileşenlerinin listesini ve kanonik SMILES yapılarını indirin.
    2. Elde edilen bileşenin etkin bileşen olup olmadığını belirleyin.
      1. HERB grup veritabanında oral biyoyararlanım (OB) ve ilaç benzeri (DL) değerlere sahip olanları aktif bileşenler olarak dahil edin (yani, OB ≥% 30 ve DL ≥ 0.18 olan bileşenler)20,21.
      2. Bileşenin OB ve DL değerleri yoksa, her bileşenle ilgili bilgileri edinmek için bileşeni İsviçre ADME veritabanına (http://www.swissadme.ch/index.php)22 girin. "Yüksek" GI emilimine sahip bileşenleri ve en az iki "Evet" DL değerini etkin bileşenler olarak dahil edin.
  2. Aktif bileşenlerin hedef tahmini
    1. HERB veritabanını (http://herb.ac.cn) açın. Etkin bileşenlerin kurallı SMILES yapılarını arayın ve kopyalayın.
    2. SEA (Benzerlik topluluğu yaklaşımı, http://sea.bkslab.org) veritabanı23'ü açın. Etkin bileşenlerin kurallı SMILES yapılarını arama kutusuna yapıştırın ve her etkin bileşenin Hedef anahtarını, Hedef adını, P-Değerini ve MaxTC'sini almak için SEA'yı Dene'ye tıklayın.
    3. Verileri bir elektronik tabloya kopyalayın ve etkin bileşenlerin hedeflerini Hedef anahtarına (İnsan, P < 0,05 ve MaxTC > 0,5) göre filtrelemek için elektronik tablo dosyasının filtreleme işlevini kullanın.
    4. Tüm hedefleri bir elektronik tabloya kopyalayın ve ilaç hedeflerini elde etmek için yinelenenleri kaldırın.
  3. Hastalık hedeflerinin tahmini
    1. GeneCards veritabanını (https://www.genecards.org)24 ve Online Mendel Inheritance in Man veritabanını (OMIM, https://www.omim.org)25 açın ve akciğer adenokarsinomunun hastalık hedeflerini elde etmek için anahtar kelime olarak Akciğer Adenokarsinomunu kullanın.
    2. Hastalık hedeflerinin elektronik tablolarını indirin. LUAD hedeflerini elde etmek için yinelenen hedefleri silin.
  4. İlaç-bileşen-hastalık-hedef ağının oluşturulması
    1. LUAD ile ilgili hedefleri ve ilaç hedeflerini yeni bir elektronik tabloda aynı sütuna kopyalayın. LUAD ile ilgili hedeflerin ve Trichosanthes-Fritillaria thunbergii etkin bileşenle ilgili hedeflerin kesişim hedeflerini elde etmek için araç çubuğundaki Veri - Yinelenenleri Tanımla işlevini kullanın.
    2. Cytoscape 3.8.0'ı açın. Menü çubuğunda Dosya'ya tıklayın ve ardından elektronik tablo dosyasını içe aktarmak için Dosyadan > Ağı İçe Aktar'ı seçin. Sol kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin boyutunu ve rengini optimize edin.
    3. Ağ topolojisi analizi için Ağı Analiz Et işlevini kullanın. Menü çubuğunda Araçlar'a tıklayın ve ardından Ağı Analiz Et'i seçin. Tablo panelinde, bileşenleri azalan düzende dereceye göre düzenlemek için başlık çubuğundaki Derece'yi tıklatın. İlk on bileşeni ve hedefi ana aktif bileşenler ve temel hedefler olarak alın.
  5. PPI ağının inşası ve çekirdek proteinlerin taranması
    1. STRING veritabanı (https://cn.string-db.org/)26'yı açın. Trichosanthes-Fritillaria thunbergii'nin LUAD'a karşı olası hedeflerinin metin biçimindeki listesini İsim Listesi iletişim kutusuna yapıştırın. Organizmalarda Homo sapiens'i seçin ve ARA > DEVAM ET düğmelerine tıklayın.
    2. Sonuçlar mevcut olduğunda, Ayarlar'a tıklayın ve Temel Ayarlar'da Yüksek Güvenilirlik (0,700) seçeneğini > Minimum Gerekli Etkileşim Puanı'nı işaretleyin. Gelişmiş Ayarlar'da Ağdaki Bağlantısı Kesilmiş Düğümleri Gizle'yi işaretleyin ve ardından GÜNCELLE düğmesine tıklayın.
    3. Başlık çubuğunda Dışa Aktarımlar'a tıklayın ve PPI ilişkisinin kısa tablo metnini TSV formatında indirin.
    4. Cytoscape 3.8.0'ı açın. TSV formatındaki dosyayı görsel analiz için içe aktarmak üzere Dosya'ya tıklayın > Dosyadan > Ağı İçe Aktar'a tıklayın.
    5. Topolojik analizi gerçekleştirmek için Ağ Çözümleyicisi işlevini kullanın. Sol kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin boyutunu ve rengini optimize edin.
  6. KEGG zenginleştirme analizi
    1. Metascape (https://metascape.org/)27 platformunu açın. Potansiyel terapötik hedeflerin metin biçimindeki listesini iletişim kutusuna yapıştırın ve ardından Gönder düğmesine tıklayın. Hem Tür Olarak Giriş hem de Tür Olarak Analiz'de H. sapiens'i işaretleyin ve ardından Özel Analiz düğmesine tıklayın. Zenginleştirme'yi seçin, yalnızca KEGG Yolu'nu işaretleyin ve ardından Zenginleştirme Analizi'ne tıklayın. İlerleme çubuğu %100'e ulaştıktan sonra, zenginleştirme sonuçları için Analiz Raporu Sayfası turuncu düğmesine tıklayın.
    2. Zenginleştirme sonucunu indirmek için All in One Zip File (Bir Zip Dosyasında Tümü) öğesine tıklayın ve ardından sonucu elde etmek için Enrichment_GO klasöründeki _ FINAL_GO.csv dosyasını açın.
    3. R yazılımını açın (https://cran.r-project.org/). ggplot2 R paketinin kurulumu için R içine install.package ("ggplot2") ve kitaplık (ggplot2) yazın. KEGG görselleştirme programını çalıştırmak için Enter tuşuna basın.

2. Deneysel doğrulama

  1. İlaç hazırlama
    NOT: Fritillaria thunbergii Miq ve Trichosanthes kirilowii Maxim, Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ne bağlı Dongzhimen Hastanesi'nden satın alınmıştır.
    1. 50 g Fritillaria thunbergii Miq ve 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim'i karıştırın. Karışımı 20 dakika boyunca 1 L damıtılmış suya batırın ve ardından karışımı 1 saat boyunca normal basınç altında 100 ° C'de kaynatın.
    2. Çift kat steril tıbbi gazlı bez içeren bir filtrat elde etmek için kaynatma işlemini filtreleyin ve ardından ekstraktı daha fazla filtrelemek için 80 μm filtre kağıdı kullanın. Yukarıdaki işlemi üç kez tekrarlayın.
    3. Yaklaşık 1.2 L'lik bir kaynatma elde etmek için filtratı karıştırın. Çözeltiyi döner bir evaporatörün şişesine yerleştirin. Dönüş hızını 37 °C sıcaklıkta 50 rpm'ye ayarlayın. Kaynatma maddelerini karıştırın ve viskoz bir sıvı elde etmek için 6 saat boyunca döner evaporatördeki bir ekstrakt halinde yoğunlaştırın.
    4. Sıcaklığı -40 °C'ye soğutmak için vakumlu dondurarak kurutma mekanizmasını açın. Elde edilen ekstraktı malzeme tepsisine koyun ve dondurmak için soğuk tuzağa yerleştirin.
    5. Soğuk tuzak sıcaklığı −50 ° C'ye ulaştığında ve malzeme 2 saat boyunca dondurulduğunda, dondurulmuş malzemeleri soğuk tuzağa yerleştirilmiş bir kurutma rafına aktarın. Liyofilizasyon işlemini başlatmak için vakum pompasını açın. Dondurularak kurutulmuş tozu çıkarın ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında -20 ° C'de saklayın.
  2. Hücre yetiştiriciliği
    1. DMEM komple ortamını %89 DMEM temel ortamı, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile yapılandırın.
    2. A549 hücrelerini sıvı azottan çıkardıktan sonra, hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin ve şişedeki ortam eriyene kadar karıştırın.
    3. Erimiş hücrelere dört kat hacimli DMEM tam ortamı ekleyin. Hücreleri santrifüj edin (4 °C, 679 x g, 5 dakika) ve süpernatanı atın.
    4. Çökeltilmiş hücreleri 6 mL DMEM tam ortamı ile yeniden askıya alın, bir T25 kültür şişesinde kaplayın ve şişeyi 37 ° C,% 5 CO2'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin.
  3. Hücre canlılığının tespiti
    1. Logaritmik büyüme fazı A549 hücrelerini 37 ° C'de 1 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin ile sindirin. Tripsini nötralize etmek için 1 mL DMEM tam ortam ekleyin ve hücre dökülmesini teşvik etmek için hafifçe üfleyin. Hücre peletini elde etmek için karışımı santrifüj edin (4 °C, 192 x g, 5 dk). DMEM tam ortamını kullanarak elde edilen hücreleri yeniden askıya alın.
    2. Hücre süspansiyonunu bir hemositometreye ekleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın. DMEM komple ortamını kullanarak 5 x 104 hücre/mL'ye seyreltin.
    3. 1 g Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktını 10 mL PBS çözeltisinde çözün ve 0.22 μm'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin-sterilize edin. PBS kullanarak karışımı 90 mg/mL, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL ve 10 mg/mL'ye seyreltin.
    4. Seyreltilmiş hücreleri 96 delikli plakalar üzerinde kuyucuk başına 100 μL ile plakalayın. Hücre yapışmasından sonra, her bir kuyucuğun konsantrasyonunu 900 μg / mL, 800 μg / mL, 700 μg / mL, 600 μg / mL, 500 μg / mL, 400 μg / mL, 300 μg / mL, 200 μg / mL ve 100 μg / mL'ye ayarlamak için farklı konsantrasyonlarda 1 μL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktları ekleyin.
    5. 24 saatlik kültürden sonra orijinal ortamı atın ve 37 ° C'de 2 saat daha fazla inkübasyon için 100 μL DMEM bazik ortamı,% 5 CO2 ekleyin.
    6. Yukarıdaki işlemden sonra, 20 μL MTS çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 1 saat daha inkübe edin.
    7. İnkübe edilen karışımı farklı bir plakaya aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı (OD) 490 nm dalga boyunda ölçün. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre canlılığını hesaplayın:
      Canlılık (%) = 100 × (işlem görmüş numunenin OD'si -ortamın OD'si)/(kontrol numunesinin OD'si -ortamın OD'si).
      NOT: IC50'ye yakın minimum konsantrasyon, yüksek doz olarak tanımlanır. Hücre proliferasyonunun inhibe edilmeye başlandığı konsantrasyon düşük doz konsantrasyon olarak tanımlanır ve ara değer, sonraki deneysel çalışmalar için orta doz konsantrasyon olarak tanımlanır. Bu çalışmada düşük, orta ve yüksek doz olarak 400 μg/mL, 600 μg/mL ve 800 μg/mL kullanılmıştır.
  4. İlaç müdahalesi ve numune toplama
    NOT: Günlük fazını belirlemek için hücre büyümesi zamana karşı çizilmiştir.
    1. Logaritmik büyüme fazı A549 hücrelerini 5 x 105 hücre/mL ile seyreltin. 6 delikli bir plakaya 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 12 saat boyunca büyüyün.
    2. Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 80 mg / mL, 60 mg / mL ve 40 mg / mL PBS seyreltmelerini elde etmek için adım 2.3.3'ü tekrarlayın. PBS çözeltisinin 20 μL'sini, 40 mg / mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 20 μL'sini, 60 mg / mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 20 μL'sini ve 80 mg / mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının 20 μL'sini boş kontrol grubuna, düşük konsantrasyon grubuna, orta konsantrasyon grubuna ve yüksek konsantrasyon grubuna ekleyin, sırasıyla. 24 saatlik müdahaleden sonra süpernatantı atın ve hücreleri PBS ile üç kez temizleyin.
      NOT: Trichosanthes-Fritillaria thunbergii su ekstraktının boş kontrol grubu, düşük konsantrasyon grubu, orta konsantrasyon grubu ve yüksek konsantrasyon grubunun konsantrasyonları sırasıyla 0 μg / mL, 400 μg / mL, 600 μg / mL ve 800 μg / mL idi.
    3. Her bir oyuğa 250 μL RIPA tamponu (% 1 PMSF ve% 1 fosfataz inhibitörü içeren) ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca lize edin. Santrifüjleme için lizatı toplayın (4 ° C, 6.714 x g, 10 dakika) ve süpernatanı elde edin.
  5. Batı lekelenmesi
    1. Numunelerin protein konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarına göre BCA yöntemiyle tespit edin. Her numunenin konsantrasyonunu tutarlı olacak şekilde ayarlamak için RIPA arabelleğini kullanın.
    2. 40 μL protein numunesini 10 μL 5x yükleme tamponu ile karıştırın ve 100 °C'de 5 dakika kaynatın. Santrifüj (4 °C, 6,714 x g, 10 dk) sonraki deneyler için süpernatant elde etmek için karışımı.
    3. 120 V dikey elektroforez kullanarak proteinleri jel elektroforezi ile izole edin.
    4. Elektrikli bir "sandviç" hazırlayın (sünger - filtre kağıdı - jel - PVDF membran - filtre kağıdı - sünger). Transfer aparatını bir buz banyosuna batırın ve proteini 60 dakika boyunca 70 V'ta PVDF membranlarına aktarın.
    5. %5 sütü yapılandırmak için 100 mL TBST çözeltisi (%0,05 [v/v] Ara-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) ve 5 g yağsız süt tozu kullanın. AKT ve p-AKT antikorlarını antikor seyreltici ile 1:1.000 oranında önceden seyreltin.
    6. PVDF membranını çalkalayarak 1 saat boyunca% 5 yağsız süt tozu içinde bloke edin. Bloke ettikten sonra, bloke edici sütü atın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon için seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin.
    7. Birincil antikoru çıkardıktan sonra, PVDF membranını her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkamak için TBST çözeltisi kullanın.
    8. Sekonder antikoru antikor seyreltici ile 1:5.000 oranında önceden seyreltin. İkincil antikoru ekleyin ve 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. İkincil antikoru çıkardıktan sonra, PVDF membranını her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkamak için TBST çözeltisi kullanın.
    9. Bir kemilüminesans algılama sistemi kullanarak proteini tespit edin.

3. Moleküler yerleştirme

  1. UniProt veritabanını açın (https://www.uniprot.org)28. Hedef sembolleri arama kutusuna yazın ve ARA düğmesine tıklayın. Yapı alt başlığında, protein hedeflerinin 3B yapıları için İndir'e tıklayın.
  2. RCSB PDB veritabanı (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29'u açın. Arama kutusuna protein makromoleküllerinin adını yazın. Protein makromolekül yapılarını PDB formatında indirin.
  3. UCSF Chimera 1.16 yazılımı (https://vina.scripps.edu/) ve AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/) kurulum paketini indirin. UCSF Chimera 1.16 yazılımını yükleyin ve açın. Reseptör proteinini görüntülemek için Dosya > Aç'a tıklayın.
  4. Dock Prep'> Yapı Düzenleme > Araçlar'a tıklayın ve suyu kaldırmak, hidrojenasyon ve dengeleme ücretleri eklemek için açılır pencerede Çözücüyü Sil, Hidrojen Ekle ve Ücret Ekle'yi işaretleyin. Reseptör proteinini mol2 formatında kaydetmek için Mol2 Dosyası Yaz'a tıklayın. Aynı adımı ligand üzerinde de gerçekleştirin.
  5. UCSF Chimera 1.16 yazılımında mol2 formatlı ligandı görüntülemek için Dosya > Aç'a tıklayın. AutoDock Vina> Yüzey/Bağlanma Analizi >Araçları'nda, Reseptör çubuğunu reseptör proteininin adına ve Ligand çubuğunu ligandın adına ayarlayın. Yeni geliştirilen alanı ayarlamak için Merkez ve Boyut'un arkasındaki kutuya bir değer girin, böylece ligand ve reseptörü tamamen kuşatmayı mümkün kılar.
  6. Reseptöre ligand bağlanması için en uygun yeri elde etmek üzere moleküler kenetlenme sanal taraması için Tamam'a tıklayın. Bağlama enerjisi değerini optimum konumda kaydedin.

4. İstatistiksel analiz

  1. SPSS 26.0 istatistik yazılımını açın. Veri yükleme için Dosya > Verileri İçe Aktar'a tıklayın.
  2. Deneysel verileri ortalama ± standart sapma olarak sunun.
  3. Tek yönlü ANOVA kullanarak birden fazla grubu karşılaştırın.
    NOT: Bu çalışmada P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

21 Trichosanthes-Fritillaria thunbergia bileşeni ve 144 karşılık gelen hedef dahil olmak üzere toplam 31 Trichosanthes-Fritillaria thunbergia ile ilişkili aktif bileşen tanımlanmıştır. Genel olarak, sırasıyla GeneCards veritabanından ve OMIM veritabanından 9.049 ve 67 LUAD ile ilişkili gen çıkarıldı. Kopyalanan genleri sildikten sonra, LUAD ile ilgili 9.057 gen tanımlandı. LUAD ile ilişkili genlerin ve Trichosanthes-Fritillaria thunbergii aktif bileşen ile ilişkili hedeflerin kesişimi,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel olarak, tam bir ağ farmakolojisi çalışması, veritabanlarından aktif bileşenlerin tanımlanmasını, aktif bileşenlere ve hastalıklara karşılık gelen hedeflerin elde edilmesini, bir ilaç-bileşen-hastalık-hedef ağının oluşturulmasını ve çekirdek hedeflerin ve yolların tahmin edilmesini içerir. Aktif bileşenler ve çekirdek proteinler arasındaki ilişki (moleküler kenetlenme) bilgisayar teknolojisi tarafından önceden tahmin edilir ve son doğrulama bir deney kullanılarak gerçekleştirilir.

İlgili ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi İnovasyon Eğitim Programı (No: 202110026036) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 tripsin-EDTAGibcoR001100
A549  hücre hattıProcellCL-0016
AKT antikoruCST4691S
BCA Protein Test KitiSolarbioPC0020
Kemilüminesans tespit sistemiŞangay Qinxiang Bilimsel Enstrüman FabrikasıChemiScope 6100
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)Solarbio11995
Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) kiti ABklonalRM00021
Fetal sığır serumuScienCell0025
HRP Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L)ABklonalAS014
MTS test kitiPromegaG3580
p-AKT antikoruCST6040S
Penisilin streptomisinGibcoC14-15070-063
Fenilmetansülfonil florür (PMSF)SolarbioP0100
Fosfataz inhibitörüBeyotimeP1081
Fosfat tamponlu salin (PBS)SolarbioP1020
Poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarKırlangıçISEQ00010
RIPA lizis çözeltisiSolarbioR0010
Döner evaporatörŞangay Yarong Biyokimyasal Alet FabrikasıRE52CS-1
Vakumlu dondurarak kurutma mekanizmasıNingbo Scientz BiyoteknolojiSCIENTZ-10
ve beta; -Aktin antikoruABklonalAC026

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708(2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690(2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20(2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252(2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925(2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783(2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462(2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299(2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162(2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717(2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523(2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713(2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300(2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796(2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460(2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843(2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910(2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821(2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923(2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133(2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37(2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

PI3K AKT YoluProtein FosforilasyonuA549 H creleriKEGG Zenginle tirmeProtein Etkile im AH cre Proliferasyon nhibisyonuMolek ler Kenetlenme

İlgili makaleler