Yöntem makalesi

Canlı Tek Hücreleri İzole Etmek için Pankreas Doku Diseksiyonu

DOI:

10.3791/64871

⸱

26 Mayıs 2023

 ,  , 
1The Lautenberg Center for Immunology and Cancer Research, The Institute for Medical Research Israel-Canada, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas metaplastik hücreleri, pankreas tümörlerine yol açan kötü huylu hücrelerin öncüleridir. Bununla birlikte, sağlam canlı pankreas hücrelerini izole etmek zordur. Burada pankreas dokusu ayrışması için etkili bir yöntem sunuyoruz. Hücreler daha sonra tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) veya iki veya üç boyutlu birlikte kültürleme için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas iki ana sistem içerir: hormonları üreten ve salgılayan endokrin sistem ve pankreasın yaklaşık% 90'ını oluşturan ve sindirim enzimleri üreten ve salgılayan hücreleri içeren ekzokrin sistem. Sindirim enzimleri pankreas asiner hücrelerinde üretilir, zimojen adı verilen veziküllerde depolanır ve daha sonra metabolik süreçleri başlatmak için pankreas kanalı yoluyla duodenuma salınır. Asiner hücreler tarafından üretilen enzimler hücreleri öldürebilir veya hücresiz RNA'yı parçalayabilir. Ek olarak, asiner hücreler kırılgandır ve ortak ayrışma protokolleri çok sayıda ölü hücre ve hücresiz proteaz ve RNaz ile sonuçlanır. Bu nedenle, pankreas dokusu sindirimindeki en büyük zorluklardan biri, sağlam ve canlı hücrelerin, özellikle asiner hücrelerin geri kazanılmasıdır. Bu makalede sunulan protokol, bu ihtiyacı karşılamak için geliştirdiğimiz iki adımlı bir yöntemi göstermektedir. Protokol, normal pankrea, pre-malign lezyonları içeren pankreaları veya çok sayıda stromal ve immün hücre içeren pankreas tümörlerini sindirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) en agresif kanser tiplerinden biridir1. Klinik kanıtlar, PDAC'nin uzun yıllar boyunca asiner hücreler de dahil olmak üzere ekzokrin sistem hücrelerinden geliştiği ve KRAS proto-onkogen2'deki mutasyonlar tarafından yönlendirildiği fikrini desteklemektedir.

Pankreas tümörleri birçok farklı hücre tipini içerir ve kötü huylu hücrelerin tümör kütlesinin sadece %20-50'sini oluşturduğu gösterilmiştir3. Farklı hücre tipleri epitel hücreleriyle etkileşime girer, dönüşümlerini destekler ve tümör oluşumunu ve büyümesini arttırır. Erken olaylar, pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN'ler) adı verilen ve bazı durumlarda PDAC4'e dönüşebilen mikroskobik lezyonlara yol açan asiner metaplaziye neden olur.

Bu etkileşimleri araştırmak ve önemli sinyalleri hedeflemek için kritik bir ihtiyaç vardır. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi), gen ekspresyonunu tek hücre çözünürlüğünde ortaya çıkaran, böylece epitel hücrelerinin geçirdiği değişiklikleri izleyen ve böylece pankreas kanseri gelişiminin araştırılmasını sağlayan güçlü bir yöntemdir.

Tek hücrelere doku diseksiyonu ve sindirimi, bir scRNA-seq deneyinin ilk aşamasıdır. Pankreas dokusu sindirimini özellikle zorlaştıran çeşitli faktörler vardır: i) asiner hücreler pankreasın %90'ından fazlasını oluşturur ve asiner hücreler, RNA tabanlı kütüphanelerin kalitesini düşüren proteazlar ve RNazlar dahil olmak üzere büyük miktarlarda sindirim enzimleri içerir; (ii) asiner hücreler çok hassastır ve standart protokoller kullanılırsa parçalanabilir; (iii) Asiner hücreler çok yüksek seviyelerde az sayıda gen eksprese ederler. Bu nedenle, bu hücreler deney sırasında parçalanırsa, bu, diğer hücrelerin gözlemlenen gen ekspresyon profilini kirletebilir; (iv) tümörlerden elde edilen pankreas dokusu desmoplastiktir, bu da hücrelere zarar vermeden diseksiyonu zorlaştırır. Bu nedenle, tüm hücre tiplerinin yüksek canlılığının korunması gerekli olsa da, asiner hücrelerin büyük sayısı ve duyarlılığı ek karmaşıklık katar. Bu faktörler, scRNA-seq deneyleri için gerekli olduğu gibi, %80'den fazla canlı olan ve kümelenme içermeyen tek hücreli bir süspansiyonun elde edilmesinde zorluklar yaratır.

Burada, sık doku monitörizasyonunun yanı sıra tripsin C ve kollajenaz P kullanan bir protokol geliştirdik. Bu, scRNA-seq deneylerinin başarısını desteklemek için yüksek canlılığı korurken tek hücrelere ayrışmayı destekler 5,6.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İbrani Üniversitesi (Kudüs, İsrail) ve Hadassah Tıp Merkezi'nin (Kudüs, İsrail) ortak etik komitesi (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi), hayvan refahı için çalışma protokolünü onayladı (MD-18-15417-5 "Farelerde pankreas kanserinde doku dinamikleri") ve burada sunulan protokol, hayvan testleri ve araştırmaları için ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur. İbrani Üniversitesi, Laboratuvar Hayvanları Bakımı Uluslararası akredite enstitüsünün Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu için bir Dernektir.

NOT: Fare suşu stoğu #007908, stok #019378 ve stok #008179 Jackson'ın laboratuvarından elde edilmiştir. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) fareleri, yukarıdaki suşları geçerek yaratıldı. Çalışma için her iki cinsiyetten 6 hafta ile 15 ay arasındaki fareler kullanıldı. Tamoksifen, tozun mısır yağında çözülmesiyle hazırlandı. Yetişkin farelere (6-8 haftalık, dişiler ve erkekler), 0. ve 2. günlerde 400 mg / kg'lık bir dozda deri altından tamoksifen enjekte edildi ve enjeksiyondan sonra haftada iki kez incelendi. Tümörleri dahili olarak yerleştirildikleri için ölçmek mümkün değildi; Bu nedenle etik protokole göre anormal klinik bulgular gözlenirse ötenazi uygulandı. Fareler, tamoksifen indüksiyonu sonrası, izofluran ve servikal çıkık kullanılarak farklı zaman noktalarında ötenazi yapıldı.

1. Pankreas diseksiyonu

NOT: Ekstraksiyon sırasında optimum verim ve iyi hücre canlılığı sağlamak için hızlı diseksiyon kritiktir. Pankreas izolasyonu için gereken süreyi kısaltmak için, fareye ötenazi yapılmadan önce tüm alet ve ekipmanların buz üzerinde hazır olması gerekir.

  1. Fareyi CO2 asfiksi ile ötenazi yapın ve servikal çıkık kullanarak doğrulayın. Bu adımdan itibaren tüm işlemler steril diseksiyon aletleri ile yapılmalıdır.
  2. Fareyi sabitleyin ve karnına% 70 etanol püskürtün. Makas ve forseps ile genital bölgede 2,5 cm'lik V şeklinde bir kesi yapın ve karın boşluğunu tamamen açmak için yukarı doğru ilerleyin.
  3. Farenin sol tarafındaki mideyi bulun. Dalağa yakın olan pankreası bulun. Pankreası iki forseps kullanarak (yırtılmadan) mide ve duodenumdan ayırın. Pankreası ince bağırsak, jejunum ve ileumdan ayırmaya devam edin.
  4. Pankreası farenin sağ tarafına hareket ettirin. Pankreas ve bağlı dalağı tamamen ayırmak için pankreas ve göğüs boşluğu arasında kalan bağlantıları forseps ile ayırın.
  5. Pankreası çıkarın ve buz üzerinde bir Petri kabında inceleme için yayın.
    NOT: Hücresel kontaminasyonu önlemek için bu adım sırasında sadece pankreasın çıkarılmasına ve pankreas ile birlikte mezenterik yağ dokusunun veya diğer bitişik dokuların çıkarılmamasına özen gösterilmelidir.

2. Pankreasın enzimatik ve mekanik ayrışması

  1. Aşağıdaki arabellekleri önceden hazırlayın.
    1. Ayrışma tamponu 1: Her numune için 4 mL tripsin C + 6 mL fosfat tamponlu salin (PBS) (bakınız Tablo 1).
    2. Ayrışma tamponu 2: 9 mL Hanks' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 1x; % 4 sığır serum albümini (BSA); 1 mL kollajenaz P (10 mg/mL); 200 μL tripsin inhibitörü (10 mg/mL); ve 200 μL DNaz I (10 mg / mL) (bakınız Tablo 1).
    3. Yıkama tamponu: 50 mL HBSS 1x; 2 g BSA; 1 mL tripsin inhibitörü (10 mg / mL); ve 1 mL DNaz 1 (10 mg / mL).
    4. Enzim aktivitesi durdurma çözeltisi:% 5 fetal sığır serumu (FBS) ve 150 g DNaz I (0.2 mg / mL) içeren HBSS 1x.
  2. Pankreası buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Pankreası HBSS 1x'te% 10 FBS'de durulayın. Yağ dokusu yüzer ve pankreas batar. Bu, hala pankreasa bağlı olan kirletici beyaz yağ dokusunu görselleştirmenin ve hızlı bir şekilde çıkarmanın kolay bir yoludur.
  3. Fare pankreas dokusunu buz üzerinde 5 mL HBSS 1x içeren steril bir Petri kabına aktarın. Noyes makası ve neşter kullanarak pankreası 1 ila 3 mm'lik3 küçük parçalar halinde kesin (Şekil 2A). Birden fazla numune olması durumunda, numuneler %10 FBS/HBSS 1x'te buz üzerinde tutulmalıdır.
  4. Dokuları bir santrifüj tüpüne aktarın. 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücre parçalarını ve kan hücrelerini çıkarmak için süpernatanı aspire edin ve atın.
  5. % 0.02 tripsin C-% 0.05 EDTA içeren ayrışma tamponu 1'deki parçaları, çalkalama (180 rpm) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Hemen %10 FBS/Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) ile yıkayın. 4 °C'de 350 g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  6. Peleti 10 mL yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek ve bir sonraki ayrışma adımından önce 4 °C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyerek tekrar yıkayın.
  7. Pankreası ayrışma tamponu 2'de 37 ° C'de çalkalama (180 rpm) ile 15 dakika inkübe edin.
  8. 15 dakika sonra, pankreas parçalarını küçülen boyuttaki steril pipetlerde (25, 10 ve 5 mL serolojik pipetler) 10 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik ayrışma gerçekleştirin ve 37 ° C'ye geri getirin.
    1. 5 dakika sonra, mekanik ayrışmayı tekrarlayın ve tek hücreli süspansiyon miktarına göre ayrışmayı izlemek için ışık mikroskobu kullanın. Genellikle bu aşamada, süspansiyonun% 90'ından azı izole edilmiş tek hücrelerden oluşuyorsa, daha uzun bir inkübasyon süresine ihtiyaç vardır. Hücre canlılığını izlemek için tripan mavisini kullanın.
    2. İnkübasyona devam edin ve her 5 dakikada bir ayrışmayı tespit etmek için örnekler alın.
      NOT: Toplam inkübasyon süresi dokuya bağlıdır ve numuneler arasında değişebilir. İnkübasyon ve doku ayrışması, hücrelerin %90'ı tek hücrelere ayrıldığında veya canlılıkta bir azalma tespit edildiğinde sona ermelidir.
  9. Pankreas dokusu iyice ayrıştıktan sonra (pankreas parçalarının kaybolmasına ve çözeltinin artan bulanıklığına karşılık gelir) (Şekil 2), enzim aktivitesi durdurma çözeltisi ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayarak enzimatik reaksiyonu durdurun. Bu adımdan itibaren hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
  10. Hücre süspansiyonunu 70μm'lik bir naylon ağdan geçirin ve mikroskop altında hücre canlılığını kontrol edin. Daha küçük boyutlarda naylon ağ, hücre canlılığını azaltabilir.
  11. Peletin tekrar süspanse edilmesi ve 5-10 mL buz gibi soğuk tamponlu yıkama solüsyonu ile yıkanması. Hücreleri sayın.
  12. Birkaç kırmızı kan hücresi gözlenirse, hücrelere oda sıcaklığında 2 dakika boyunca kırmızı kan hücresi lizis tamponu uygulayın. Topaklanmaların gözlendiği durumlarda, numune adım 2.5'te açıklandığı gibi tripsin ile tekrar muamele edilmelidir. Canlılık, mikroskop altında tripan mavisi ile tespit edilir ve canlılık% 80'den azsa, canlı hücreler, MACS MS sütunları ile manyetik olarak aktive edilen hücre sıralama (MACS) ölü hücre çıkarma kiti kullanılarak izole edilmelidir (bkz. Tablo 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada5, bir fare modeli kullanarak PDAC geliştirmenin erken aşamalarını keşfetmek için yukarıda açıklanan protokolü uyguladık. Fare, tamoksifen enjeksiyonundan sonra asiner hücrelerde yapısal olarak aktif KRAS ekspresyonuna izin veren Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7 kasetlerini içerecek şekilde genetik olarak tasarlanmıştır.

Servikal çıkıktan sonra (fare etik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda pankreas dokusu dissosiyasyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol basittir, kullanımı kolaydır ve katı tümörler de dahil olmak üzere malignite süreci sırasında farklı aşamalarda canlı tek hücreleri pankreas dokusundan izole etmek için bir araç sağlar. Önceki çalışmalarda, pankreası sindirmek için farklı tipte kollajenazlar kullanılmıştır 8,9. Kollajenaz D gibi çok güçlü bir kollajenaz kullanmak, büyük bir bağışıklık hücresi popülasyonu ve daha düşük ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veri analizindeki yardımları için Dr. Avital Sarusi-Portuguez'e ve daha önceki bir çalışmada protokolün oluşturulmasındaki yardımları için Dr. Dror Kolodkin-Gal'e teşekkür ederiz. Parnas laboratuvarının tüm geçmiş ve şimdiki üyelerine teşekkür ederiz. Dr. Gillian Kay ve Dr. Michael Kanovsky'ye editörlükteki yardımları için teşekkür ederiz. Bu proje, İsrail Bilim Vakfı hibesinden (No. 526/18 OP), Alex U. Soyka Programından ve İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan (Araştırma Kariyeri Geliştirme Ödülü) bir hibe almıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif veya Kaynak
70 & m naylon örgü ve nbsp;Corningkedisi##431751
BSASigma Aldrichkedisi# A7906
Kollajenaz PRochekedisi# 11213857001
Kritik Ticari Test
DAPISigma Aldrichkedisi#MBD0015
Dnase IRochekedisi# 10104159001
Deneysel Modeller: Organizmalar/ Suşlar
Fetal Sığır Serumu Güney AmerikaThermoFisherKedi # 10270106
Hanks'in Dengeli Tuz ÇözeltisiBiyolojik endüstrilerkedi # 02-018-1A & nbsp;
KRASLSL-G12D farelerJackson LaboratuvarıJAX008179
MACS ölü hücre temizleme kitiMilteny Bioteckedi # 130-090-101
PBSBiyolojik endüstrilerkedi # 02-023-1A & nbsp;
Ptf1a-CreER miceJackson LaboratuvarıJAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdDomates farelerJackson LaboratuvarıJAX007908
Tripsin C-EDTA %0.05Biyolojik endüstrilercat# 03-053-1A
Tripsin inhibitörRochekedisi#T6522

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  3. Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777(2019).
  4. Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
  5. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).
  6. Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
  7. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
  8. Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
  9. Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
  10. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
  11. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
  12. Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
  13. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre zolasyonuAsiner H cre Canl lPankreatik T m r H creleriDoku Disosyasyon ProtokolMekanik DisosyasyonEnzimatik SindirimH cre Canl l De erlendirmesiFloresan Aktive H cre Ay rmaTek H cre RNA Dizileme

İlgili makaleler