Yöntem makalesi

Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

DOI:

10.3791/64885

⸱

3 Şubat 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlıklı ve hastalıklı doku ve organlardan izole edilen hücrelerin mevcudiyeti, kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için kilit bir unsurdur. Biyobankalar, biyomedikal araştırmalar için geniş bir birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre koleksiyonu sağlayabilse de, bunlar tüm deneysel ihtiyaçları, özellikle de belirli hastalıklar veya genotiplerle ilgili olanları kapsamaz. Vasküler endotel hücreleri (ECs), immün inflamatuar reaksiyonun anahtar bileşenleridir ve bu nedenle çeşitli hastalıkların patogenezinde merkezi bir rol oynamaktadır. Özellikle, farklı bölgelerden gelen EC'ler farklı biyokimyasal ve fonksiyonel özellikler göstererek, güvenilir deneyler tasarlamak için spesifik EC tiplerinin (yani makrovasküler, mikrovasküler, arteriyel ve venöz) kullanılabilirliğini gerekli kılar. Burada, pulmoner arter ve akciğer parankiminden yüksek verimli, neredeyse saf insan makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücreleri elde etmek için basit prosedürler ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bu metodoloji, ticari kaynaklardan bağımsızlık elde etmek ve henüz mevcut olmayan EC fenotiplerini / genotiplerini elde etmek için herhangi bir laboratuvar tarafından nispeten düşük bir maliyetle kolayca çoğaltılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler endotel, kan damarlarının iç yüzeyini kaplar. Kan pıhtılaşmasının, vasküler tonusun ve immün-inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde anahtar rol oynar 1,2,3,4. İnsan örneklerinden izole edilen endotel hücrelerinin (ECs) kültürü araştırma amaçları için gerekli olmasına rağmen, farklı kan damarlarından (arterler, damarlar, kılcal damarlar) gelen EC'lerin spesifik işlevleri olduğu belirtilmelidir. Bunlar, vasküler endotel patofizyolojisi ile ilgili çalışmalarda kolayca bulunabilen ve yaygın olarak kullanılan insan umbilikal ven endotel ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma onaylandı ve protokol, Chieti-Pescara Üniversitesi (#237_2018bis) insan araştırma etik komitesinin yönergelerini izledi. Şekil 1, endotel hücrelerinin pulmoner parankim veya pulmoner arter segmentlerinden (1-3 cm uzunluğunda) pnömotoraks veya lobektomi gibi çeşitli nedenlerle göğüs cerrahisi geçiren tanımlanmamış insan deneklerden (yazılı rıza ile) izolasyonunu göstermektedir. Bu son durumda, cerrahlar ayrıca bir pulmoner arter segmenti topladılar. Özellikle, cerrahlara kansersiz örnekler toplamaları için doğru bir şekilde talimat verildi. Sunulan protokol, mümkün olan en yüksek verimi ve saflığı elde etmek için optimize edilmi....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HLMEC izolasyonu
HLMVEC'lerin izolasyonu sırasındaki asıl sorun, mikroskobik kılcal damarlar stromal dokudan kolayca ayrılamadığı için kirletici hücrelerin varlığıdır. Bu nedenle, izolasyon sürecinin en erken aşamalarında mümkün olan en yüksek saflığa ulaşmak, kültür geçişlerini ve dolayısıyla hücre yaşlanmasını azaltmak için çok önemlidir. Benzer şekilde, optimal bir izolasyon protokolü, saf HLMVEC'lerin mümkün olan en yüksek verimini vermelidir. Bu hedeflere ulaşmak için, daha önce açıklanan 10,11,1.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler endotel hücrelerinin insan patofizyolojisinde oynadığı çoklu roller, bu hücreleri in vitro patogenetik ve farmakolojik çalışmalar için vazgeçilmez bir araç haline getirmektedir. Farklı vasküler bölgelerden/organlardan gelen EC'ler kendine özgü özellikler ve işlevler gösterdiğinden, ilgili organdan sağlıklı ve hastalıklı ECs'lerin mevcudiyeti araştırma amaçları için ideal olacaktır. Örneğin, HLMVEC'ler akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir; Bu nedenle, bu hücrelerin yüksek verimli, yükse.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmadan yürütüldüğünü beyan etmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı'ndan (eski% 60 2021 ve 2022) R. P.'ye ve İtalyan Kistik Fibroz Vakfı'ndan (FFC # 23 / 2014) ve İtalya Sağlık Bakanlığı'ndan (L548 / 93) MR'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 tripsin-EDTA 1XGIBCO25300-054Hücreleri kültür plakalarından ayırmak için kullanılır
Anti CD31 Antikoru, klon WM59DakoM0823İmmünositokimyada CD-31 boyaması için kullanılır. Kullanılan seyreltme: 1:50
Anti vWF AntikoruThermo Fisher ScientificMA5-14029İmmünositokimyada von Willebrand faktör boyaması için kullanılır. Çalışma seyreltme: 1:100
Otoklavlanabilir cerrahi makasHerhangi BirNumuneleri doğramak için kullanılır
Hücre süzgeçleri 40 & mikro; mCorning431750İkinci filtrasyon sırasında kullanılan
Hücre süzgeçleri 70 & mCorning431751İlk filtrasyon sırasında
Kollajenaz, Tip 2WorthingtonLS004177enzimatik sindirim için kullanılan Tip 2 Kollajenaz kullanılır. Çalışma konsantrasyonu: 2 mg / mL
Konjuge anti CD31 AntikoruBD Biosciences555445Hücre sıralaması için kullanılır (1:20 seyreltme)
Dulbecco′ s Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile  CaCl2 ve MgCl2Sigma-AldrichD8662Orta değişimden önce hücre yıkama için kullanılır
Dulbecco′ CaCl 2 < / sub> ve MgCl < sub > <2 / sub > içermeyen Fosfat Tamponlu SalinSigma-AldrichD8537Tripsinizasyondan önce cerrahi numuneleri ve hücreleri yıkamak için kullanılır
Endotel Hücre Büyüme Ortamı MVPromoCellC-22020HLMVEC büyüme ortamı
FibronektinSigma-AldrichF0895İnsan plazmasından fibronektin plaka kaplaması için kullanılır. Çalışma konsantrasyonu: 50 & g/mL
Domuz derisinden elde edilen jelatin, tip ASigma-AldrichG2500Plaka kaplaması için kullanılır
Tip A jelatinSigma-Aldrichg-2500Domuz derisinden elde edilen jelatin, plaka kaplaması için kullanılır. Çalışma konsantrasyonu:% 1.5

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Akci er Endotel H creleriMikrovask ler Endotel H creleriMakrovask ler Endotel H creleriPulmoner Arter H creleriKollajenaz SindirimiH cre Safla t rmaH cre S zgeci FiltrasyonuSantrif j Y ntemiEndotel H cre Markerlar

İlgili makaleler