Burada, hücrelerdeki tek sarmallı DNA seviyelerini ölçmek için immünofloresan tabanlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu etkili ve tekrarlanabilir yöntem, birçok yumurtalık kanserinde ortak bir özellik olan replikasyon stresini incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu tahlil, verimliliğini daha da artıran otomatik bir analiz boru hattı ile uyumludur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek Sarmallı DNA İmmünofloresan Kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücrelerinde Replikasyon Stresinin Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Replikasyon stresi, çeşitli yumurtalık kanserlerinin ayırt edici bir özelliğidir. Replikasyon stresi, çift iplikçik kırılmaları, transkripsiyon-replikasyon çatışmaları veya güçlendirilmiş onkogenler dahil olmak üzere birden fazla kaynaktan ortaya çıkabilir ve kaçınılmaz olarak tek sarmallı DNA'nın (ssDNA) üretilmesine neden olabilir. Bu nedenle, ssDNA'nın nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde ve çeşitli DNA'ya zarar veren koşullar veya tedaviler altında replikasyon stresi seviyesini değerlendirmek için bir fırsat sunar. Ortaya çıkan kanıtlar ayrıca ssDNA'nın DNA onarımını hedefleyen kemoterapötik ilaçlara verilen yanıtların bir göstergesi olabileceğini düşündürmektedir. Burada, ssDNA'yı ölçmek için ayrıntılı bir immünofloresan tabanlı metodolojiyi açıklıyoruz. Bu metodoloji, genomun bir timidin analoğu ile etiketlenmesini ve ardından denatüre olmayan koşullar altında kromatinde analogun antikor bazlı tespitini içerir. ssDNA'nın uzantıları, floresan mikroskop altında odaklar olarak görselleştirilebilir. Odakların sayısı ve yoğunluğu, çekirdekte bulunan ssDNA seviyesi ile doğrudan ilişkilidir. Ayrıca ssDNA sinyalini ölçmek için otomatik bir boru hattı da tanımlıyoruz. Yöntem hızlı ve tekrarlanabilir. Ayrıca, bu metodolojinin basitliği, ilaç ve genetik ekranlar gibi yüksek verimli uygulamalara uygun olmasını sağlar.
Giriş
Genomik DNA sıklıkla çeşitli endojen ve eksojen kaynaklardan gelen çoklu saldırılara maruz kalır1. Endojen hasarın sıklığı, yumurtalık kanserleri de dahil olmak üzere birçok kanser türünde özünde daha yüksek olan reaktif oksijen türleri veya aldehitler gibi metabolik yan ürünlerin seviyeleri ile doğrudan ilişkilidir 2,3. DNA hasarının etkili bir şekilde çözülmesi zorunludur; aksi takdirde, genotoksik lezyonları ve dolayısıyla mutageneziyi teşvik edebilir. Hücrelerin genotoksik lezyonları onarma yeteneği, hatasız DNA onarım yollarının işlevselliğine ve DNA hasarına yanıt olarak hücre dön....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Yumurtalık kanseri hücre hattı OVCAR3, bu adımlarda kullanılmıştır, ancak bu protokol, yumurtalık dışı kaynaklardan türetilenler de dahil olmak üzere diğer birçok hücre hattına geniş ölçüde uygulanabilir. Protokolün şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.
1. Hücrelerin kaplanması
- Poli-L-lizin kaplı kapaklar yapın.
- Poli-L-lizin çözeltisine sahip 50 mL'lik konik bir tüpe otoklavlanmış 12 mm çapında kapaklar ekleyin ve 15 dakika boyunca bir rocker üzerine yerleştirin.
- Çözeltiyi bir doku kültürü davlumbazında aspire edin. Steril su ekleyerek kapak kapaklarını yıkayın ve k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tedavi edilmemiş hücrelerden ve 24 saat boyunca 0.5 mM hidroksiüre ile muamele edilen hücrelerden türetilen çekirdeklerden IdU odaklarının temsili görüntüleri ve miktarının belirlenmesi Şekil 4'te gösterilmiştir. Her iki çekirdek de DAPI kanalında lekelenir ve tanımlanabilir. Bu görüntülerin analizi, her çekirdekteki odakların sayısını ölçmekten ibarettir. Odakların sayısı, replikasyon stresinin derecesi ile orantılıdır.
.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokolde belirtildiği gibi, tahlilin çalıştığından emin olmak için birkaç deneysel kontrol eklemek değerlidir. Bunlar arasında IdU ile tedavi edilmemiş bir numunenin yanı sıra birincil antikor ile tedavi edilmemiş bir örnek de bulunur. Her iki negatif kontrol de DAPI tarafından boyanmış ancak IdU sinyali içermeyen hücreler vermelidir.
Deneysel koşullara ve kullanılan hücre hatlarına bağlı olarak, en iyi floresan sinyalini elde etmek için farklı antikor seyreltmeleri gerekebilir. Çok fazla si.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiç kimse.
Teşekkürler
PV, Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı aracılığıyla Alvin J. Siteman Kanser Merkezi tarafından Açılış Pedalı Sebep Hibesi, Marsha Rivkin Yumurtalık Kanseri Araştırma Merkezi'nden Pilot Araştırma Hibesi, Mary Kay Ash Vakfı ve V-Vakfı'ndan Kanser Araştırma Bursu ile desteklenmektedir. NR, Washington Üniversitesi, St. Louis'e NIH Hücre ve Moleküler Biyoloji eğitimi T32 hibesi ile desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 3 Paraformaldehit (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sükroz + 100 mL 10X PBS + su ile 925 mL'ye kadar hacim sağlar. 75 mL %40 Metanol içermeyen PFA ekleyin, karıştırın ve depolamadan önce 50 mL'lik alikotlar yapın Depolama: -20 °C'de saklayın; C |
| 5-iyodo-2'-deoksiüridin (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g / mol. 10 mM stok için: 3.541 mg IdU'yu 1 mL'ye çözün 1 N sıvı amonyak Depolama: -20 ° C'de saklanır; C |
| Anti-BrdU antikoru | BD Biosciences | 347580 | Depolama: 4 &° C'de saklayın; C |
| Anti-fare Alexa Fluor Plus 488 ikincil antikor | Thermo Scientific | A32766 | Işığa duyarlı - karanlıkta saklayın Depolama: 4 derecede saklayın; C |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | PBS hacmine belirli bir kütle eklenerek yapılmıştır Depolama: 4 derecede saklayın; C |
| Dairesel Kapaklı Cam | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 72230-01 | |
| NIS GA3 Yazılımı | Nikon | ||
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Büyüme Ortamı: L-glutamin, 0.01 mg / mL sığır insülini ile desteklenmiş RPMI; % 20'lik bir nihai konsantrasyona kadar fetal sığır serumu ve 1X Pen Strep Depolama: Dondurucu Ortam: büyüme ortamı +% 5 DMSO ve -80 ° C'de saklanır; C |
| Poli-L-Lizin çözeltisi | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Depolama: 4 derecede saklayın; DAPI |
| P36962 | ProLong Elmas Antifade | Mountant | Depolama: 4 derece ve daha fazla saklayın; C |
| Tripsin-EDTA,% 0.25 | Genesee Scientific | 25-510 | Depolama: 4 ve derece içinde saklayın; C |
| Su, steril filtrelenmiş | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Depolama: 4 ° C'de saklayın; Ç |
Kaynaklar
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamen....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
