Burada, sıçan modelinde normotermik ex situ koruma sonrası heterotopik olarak implante edilen bir kalbin değerlendirme protokolünü sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Normotermik Ex-Situ Perfüze Heterotopik Kalp Transplantasyonunun Sıçan Modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Kalp nakli, son dönem kalp yetmezliği için en etkili tedavidir. Terapötik yaklaşımlar ve girişimlerdeki gelişmelere rağmen, nakil için bekleyen kalp yetersizliği hastalarının sayısı hala artmaktadır. Normotermik ex situ koruma tekniği, geleneksel statik soğuk hava deposu tekniği ile karşılaştırılabilir bir yöntem olarak kurulmuştur. Bu tekniğin temel avantajı, donör kalplerin fizyolojik bir durumda 12 saate kadar korunabilmesidir. Ayrıca bu teknik, dolaşım ölümünden sonra donör kalplerinin resüsitasyonuna izin verir ve implantasyon sonrası donör fonksiyonunu iyileştirmek için gerekli farmakolojik müdahaleleri uygular. Normotermik ex situ koruma tekniklerini geliştirmek ve koruma ile ilgili komplikasyonları ortadan kaldırmak için çok sayıda hayvan modeli oluşturulmuştur. Büyük hayvan modelleri, küçük hayvan modellerine göre kullanımı kolay olsa da maliyetli ve zorludur. Bu çalışmada normotermik ex situ donör kalp korunumu ve ardından heterotopik abdominal transplantasyonun uygulandığı bir sıçan modeli sunulmuştur. Bu model nispeten ucuzdur ve tek bir deneyci tarafından gerçekleştirilebilir.
Giriş
Kalp nakli, dirençli kalp yetmezliği için tek uygulanabilir tedavi olmaya devam etmektedir 1,2,3,4. Kalp nakli ihtiyacı olan hasta sayısında istikrarlı bir artışa rağmen, donör organların mevcudiyetinde orantılı bir artış gözlenmemiştir5. Bu sorunu ele almak için, zorlukları iyileştirmek ve donörlerin kullanılabilirliğini artırmak amacıyla donör kalplerini korumaya yönelik yeni yaklaşımlar geliştirilmiştir6,7,8,9
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Chonnam Ulusal Üniversite Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Merkezi etik kurulu (onay no. CNU IACUC - H - 2022-36) tüm hayvan deneylerini onayladı. Bu çalışmada kullanılan erkek Sprague-Dawley sıçanları (350-450 g), laboratuvar hayvanlarının bakım ve kullanım kılavuzuna uygun olarak bakım aldı. Sıçanlar, standart yiyecek ve su ile 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsüne sahip sıcaklık kontrollü odalara yerleştirildi.
1. Hazırlık
NOT: Tek bir deneyci tüm deneysel prosedürleri gerçekleştirebilir.
- Ameliyattan önce oksijenatör, pompa ve perfüzyon hatları dahil olmak üzere Langen....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 , küçük bir hayvan modelinde kullanılan deneysel tasarımı göstermektedir. Şekil 2 , küçük bir hayvan oksijenatörü içeren modifiye edilmiş Langendorff perfüzyon aparatını göstermektedir. Heterotopik abdominal implantasyon için anastomoz sırası Şekil 3'te sunulmuştur.
Şekil 4 , laktat, potasyum ve ortalama aort basıncı gibi ex situ perfüzyon sırasında kalbin ca.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu modeli kurarken odak noktamız, normotermik insan kalp naklini çoğaltmaktı. Ejecting olmayan modeller, donör kalbin ex situ ortamda korunması için yaygın olarak tercih edilen tekniktir16. Ejecting modelleri, ex situ perfüzyon17 sırasında kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesinde birçok avantaj sunarken, heterotopik transplantasyon modelleri için uygun değildir. Heterotopik transplantasyonda, implante edilen donör kalbin, alıcı dolaşım sisteminde konakçı .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Chonnam Ulusal Üniversite Hastanesi Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nden B2021-0991 ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan NRF-2020R1F1A1073921 hibesi ile desteklenmiştir
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AES aktif tahliye sistemi | Smiths medikal | PC-6769-51A | CO2 ve aşırı izofluran kullanın |
| Anestezi makinesi | Smiths medical | PC-8801-01A | İzofluran ve oksiegn'i karıştırır ve hayvana |
| verir B20 hasta monitörü | GE tıbbi sistemler | aort basıncı ve sıcaklığını gözlemlemek için | B20 |
| Homeotermik İzleme Sistemi | Harvard cihazı | 55-7020 | Hayvanın sıcaklığını izlemek ve korumak için |
| Mikro-1 Sıçan oksijenatörü | Dongguan Kewei tıbbi aletler | Micro-MO | Langendorff devresinde gaz değişimi için |
| Mikropunktur tanıtıcı Abdominal | aort yoluyla kemere kardiyoplejik solüsyon iletmek için | COOK medical | G48007 |
| Mikroskop | Amscope | MU1403 | Yakınlaştırma cerrahi için alan (Alıcı) |
| Cerrahi büyüteç | SurgiTel | L2S09 | Cerrahi alanı yakınlaştırmak için (Donör) |
| Şırınga pompası | AMP tümü | SP-8800 | Kardiyoplejik çözüm sunmak için |
| Transonik akış sensörü | Transonik | ME3PXL-M5 | Perfüzyon devresi akış sensörü |
| Transonik boru akış modülü | Transonic | TS410 | akış alma sistemi |
| Watson - Marlow pompaları | Harvard aparatı | 010.6131.DAO | Devridaim perfüzat için kullanılan peristaltik pompa |
| WBC-1510A | JEIO TECH | Isıtma banyosu | |
| Sprague-Dawley sıçanları | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea | ||
| Medications> | |||
| BioHAnce Jel Göz Damlası | SENTRIX Hayvan bakımı | göz için ıslak merhemler | |
| Sefazolin | JW ilaç | Profilaksi için | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | Kalp hasadı için | |
| Diklofenak | Myungmoon Pharm. Co., Ltd, ağrı | kontrolü için | |
| , Heparin | JW ilaç | Antikoagülan, | |
| İnsülin | JW farmasötik | hormon tedavisi | |
| Salin | Hidrasyon tedavisi için | JW pharmaceutical |
Kaynaklar
- Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
- Ardehali, A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
