Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama

3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64985

⸱

17 Mart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, arteriyel trombozu indüklemek için FeCl3 aracılı bir yaralanmanın nasıl kullanılacağını ve elektron mikroskobu analizi için trombozun çeşitli aşamalarında arteriyel yaralanma örneklerinin nasıl toplanacağını ve hazırlanacağını açıklamaktadır.

Özet

Kardiyovasküler hastalıklar tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biridir. Anormal tromboz, diyabet ve obezite gibi sistemik durumların ve ateroskleroz, kanser ve otoimmün hastalıklar gibi kronik inflamatuar hastalıkların ortak bir özelliğidir. Vasküler yaralanma üzerine, genellikle pıhtılaşma sistemi, trombositler ve endotel, yaralanma bölgesinde bir pıhtı oluşturarak kanamayı önlemek için düzenlenmiş bir şekilde hareket eder. Bu süreçteki anormallikler ya aşırı kanamaya ya da kontrolsüz tromboza / yetersiz antitrombotik aktiviteye yol açar, bu da damar tıkanıklığına ve sekellerine dönüşür. FeCl3 ile indüklenen karotis hasar modeli, trombozun in vivo olarak nasıl başladığını ve ilerlediğini araştırmak için değerli bir araçtır. Bu model endotel hasarı/denudasyonu ve ardından yaralanan bölgede pıhtı oluşumunu içerir. Farklı derecelerde vasküler hasara yanıt olarak vasküler hasarı ve pıhtı oluşumunu izlemek için oldukça hassas, kantitatif bir tahlil sağlar. Optimize edildikten sonra, bu standart teknik, trombozun altında yatan moleküler mekanizmaları ve ayrıca büyüyen bir trombüsteki trombositlerdeki ultrayapısal değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Bu tahlil aynı zamanda antitrombotik ve antiplatelet ajanların etkinliğini incelemek için de yararlıdır. Bu makalede, FeCl3 ile indüklenen arteriyel trombozun nasıl başlatılacağı ve izleneceği ve elektron mikroskobu ile analiz için örneklerin nasıl toplanacağı açıklanmaktadır.

Giriş

Tromboz, bir kan damarını kısmen veya tamamen bloke eden ve kanın doğal akışını engelleyen bir kan pıhtısı oluşumudur. Bu, iskemik kalp hastalığı ve felç gibi ciddi ve ölümcül kardiyovasküler olaylara yol açar. Kardiyovasküler hastalıklar morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir ve dünya çapında her dört ölümden birine neden olmaktadır 1,2,3. Tromboz, vasküler sistemin bir arızası olarak ortaya çıkmasına rağmen, altta yatan bir mikrobiyal veya viral enfeksiyon, bağışıklık bozukluğu, malignite veya metabolik durumun bir sonucu olabilir. Kan akışı, endotel hücreleri, kırmızı / beyaz kan hücreleri, trombositler ve pıhtılaşma faktörleri4 dahil olmak üzere vasküler sistemin çeşitli bileşenleri arasındaki karmaşık etkileşim ile korunur. Vasküler yaralanma üzerine, trombositler subendotelyal matriks üzerindeki yapışkan proteinlerle etkileşime girer ve granüler içeriklerini serbest bırakır, bu da daha fazla trombosit alır5. Aynı zamanda, pıhtılaşma kaskadı aktive edilir ve fibrin oluşumuna ve birikmesine yol açar. Sonuçta, bir fibrin ağı6 içinde sıkışmış trombositler ve kırmızı kan hücreleri içeren bir pıhtı oluşur. Trombozu modüle etmek için antiplatelet ve antikoagülan ilaçlar mevcut olmasına rağmen, sahte kanama bu tedavilerde önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmekte ve bu ilaçların dozajlarının ve kombinasyonlarının ince ayarlanmasını gerektirmektedir. Bu nedenle, yeni anti-trombotik ilaçların keşfedilmesi için hala acil bir ihtiyaç vardır7.

Tromboz, vasküler yaralanmaya neden olmak için birden fazla yöntem kullanılarak incelenir: mekanik (damar ligasyonu), termal (lazer yaralanması) ve kimyasal yaralanma (FeCl3 / Rose Bengal uygulaması). Trombozun doğası, yaralanmanın lokalizasyonuna (arteriyel ve venöz), yönteme veya derecesine bağlı olarak değişir. Tüm bu tipler arasında FeCl3'e bağlı vasküler yaralanma en yaygın kullanılan yöntemdir. Farelerde, sıçanlarda, tavşanlarda, kobaylarda ve köpeklerde kullanılmıştır 8,9,10,11,12. Yöntem nispeten basittir, kullanımı kolaydır ve ana parametreler standartlaştırılırsa, çeşitli vasküler sistemlerde (örneğin, arterler [karotis ve femoral], damarlar [juguler] ve arterioller [cremaster ve mezenterik]) duyarlı ve tekrarlanabilirdir (Ek Tablo 1).

Bu model, pıhtı oluşumunun mekaniği ve morfolojisi hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için de kullanılabilir. Bu teknik, trombozu çeşitli akış hızı noktalarında durdurma avantajını, işlemin tıkanmadan önce ara aşamalarını incelemek için benzersiz bir şekilde sunar. Tromboz araştırmalarındaki son gelişmeler, bu modeli tromboliz13'ün farmakolojik olmayan yöntemlerine veya anti-trombotik ve / veya fibrinolitik ajanların non-invaziv olarak verilmesine odaklanmak için kullanmıştır14,15. Birkaç grup, trombosit membranları bu terapötiklerle kaplandığında, ilaçların pıhtıları hedeflemek için termal stimülasyon üzerine aktive edilebileceğini göstermiştir16. Burada açıklanan teknikler, bulgularının tek trombosit düzeyinde doğrulanması gibi çalışmalar için yararlı olabilir. Bu makalede, Protokol 1 temel FeCl3 aracılı vasküler yaralanma prosedürünü tanımlarken, Protokol 2 elektron mikroskobu ile daha fazla analiz için vasküler yaralanma örneğini toplama ve düzeltme yöntemini açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada tartışılan tüm deneyler, Kentucky Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

NOT: Cerrahi aletler Şekil 1 ve Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. C57BL/6J fareler, 8-10 haftalık, erkek/dişi veya ilgili genetik olarak manipüle edilmiş (Nakavt veya Knockin) suşlar kullanıldı.

1. FeCl3'e bağlı karotis arter yaralanması

  1. Fare anestezi indüksiyonu
    1. Fareyi tartın.
    2. İntraperitoneal olarak 0,2 g/kg tribromoetanol çözeltisi enjekte ederek fareyi uyuşturun (yani ). Enjekte etmeden önce anestezik çözeltinin oda sıcaklığında (RT) olduğundan emin olun. Bu doz, fareyi yaklaşık 1 saat sakinleştirmek için yeterlidir.
    3. Farenin yatıştırıldığından emin olmak için enjeksiyondan 5 dakika sonra ayak parmağını sıkıştırarak ayak parmağı refleksini kontrol edin. Fare sakinleştirilmezse, ayak parmağını çekecektir. Bu durumda, 5 dakika bekleyin ve tekrar kontrol edin.
    4. Fare hala tamamen yatıştırılmamışsa, ilk dozun 1 / 4'ünü uygulayın ve 5 dakika bekleyin.
    5. İşlem boyunca, farenin anestezik düzlemini bir ayak parmağı tutamağı ile periyodik olarak izleyin. Ek olarak, optimum anesteziyi korumak için solunum hızı ve vücut ısısı da izlenebilir.
  2. Fareyi hareketsiz hale getirin
    1. Fareyi sırtüstü pozisyonda ısıtma yastığına (37 ° C) yerleştirin ve ekstremiteleri hareketsiz hale getirmek için yapışkan bant kullanın.
    2. Servikal/boyun bölgesini uzatmak üzere farenin üst ön dişlerini nazikçe çekmek için bir cerrahi iplik (0,1 mm) kullanın. Bu, cerrahi alanın daha iyi görüntülenmesi ve Doppler probunun stabilitesi için önemlidir. İplik boyutu önemli değildir, çünkü boynu uzatmak için sadece hayvanın ön dişlerini çekmek için kullanılır.
  3. Kesi
    1. Ameliyat bölgesine %70 etanol püskürtün veya alkollü mendille silin.
    2. Bir pamuklu çubuk kullanarak, cerrahi bölgeye az miktarda epilasyon kremi sürün. 1-2 dakika bekleyin ve ardından kremayı çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu veya mendil kullanın.
      NOT: Bu adım temiz bir cerrahi bölge için önemlidir.
    3. Makas ve forseps kullanarak (Şekil 1B11,1B13), mandibuladan suprasternal çentiğe doğru bir orta hat insizyonu yapın. Bölgenin daha iyi görselleştirilmesini sağlamak için cildi geri çekin (Şekil 2A).
  4. Karotis arter maruziyeti
    1. Cerrahi forseps ve mikro diseksiyon forsepsleri kullanarak, üst üste binen yüzeyel fasyayı künt diseke edin ve sol karotis arteri açığa çıkarmak için çıkarın (Şekil 1B12,1B13). Bu bölgedeki diğer vaskülatürlere zarar vermemek için bu aşamada makas kullanmadığınızdan emin olun.
    2. Karotis arteri çevreleyen ekstra dokuyu çıkarın. Çevreleyen dokunun aşırı diseksiyonundan kaçının, çünkü bu alan vagus sinirini ve vertebral arteri barındırır.
    3. Karotis arteri cerrahi ve dikiş bağlayıcı forseps ile diseke ederek çevre dokudan ayırın (Şekil 1B12,1B15,2C). Arterde veya çevresindeki vaskülatürde herhangi bir mekanik yaralanmayı önlemek için arteri uzatmadığınızdan veya çekmediğinizden emin olun.
    4. Yaralanmanın yerini işaretlemek için arterin altına bir parça plastik yerleştirin (Şekil 2D). Cerrahi alanda görmeyi kolaylaştırmak için renkli bir saydamlık tabakası kullanın.
  5. Akış probunun yerleştirilmesi
    1. Doppler transonik akım probunu ameliyattan yaklaşık 10 dakika önce tuzlu su çözeltisine (dH2O'da %0.9 NaCl) yerleştirin. Akışın okunmasını kolaylaştırmak için probun diğer ucunu debimetredeki bir ataşmana yerleştirin. Debimetreyi bir bilgisayara takın.
      NOT: Ameliyatlar arasında Doppler transonik akım probu tuzlu su içinde olmalıdır. İşlem boyunca probu nemli ve temiz tuttuğunuzdan emin olun.
    2. Ultrason Doppler transonik akım probunu plastiğin yukarı akımındaki arterin etrafına yerleştirin (Şekil 2D). Probun kap tutucu bölgesinin çok uzamış olmadığından emin olun (Şekil 1C, kırmızı ok).
      NOT: Gerekirse, probun uygun bir yüksekliğini elde etmek için probu gazlı bezlerle destekleyin (Şekil 1B1) ve optimum okuma pozisyonunu kolaylaştırın.
    3. Cerrahi alan bu noktada kuruysa, bölgeyi nemli tutmak için birkaç damla RT salin ekleyin. Akış probu okumasını izleyin. En uygun okuma her hayvan için değişir ve 0.6-1.2 mL / dak arasında herhangi bir yerde olabilir. Daha az veya kararlı değilse, optimum bir okuma elde etmek için akış probu konumunu değiştirin.
      NOT: Farenin boynunun çok uzamış olmadığından ve ameliyat alanının temiz olduğundan emin olun.
  6. Akış taban çizgisini kaydetme
    1. Probu yerleştirdikten sonra, akışın sabit olduğundan emin olmak için kan akışını 2 dakika boyunca izleyin. Ardından, akışı 2 dakika boyunca kaydedin (Şekil 3B) temel olarak. Debimetrenin ayrıntılı bir açıklaması için, Subramaniam ve ark.17'ye bakınız.
    2. Kan akışını kaydetmek için WinDAQ yazılımını başlatın. Dosya seçeneğine tıklayın ve ardından Kaydet'e tıklayın. Yeni bir klasör ve dosya oluşturun ve kayda başlayın. Kaydı durdurmak için, dosya bölümünde Durdur'a tıklayın.
      NOT: WinDAQ yazılımı yayımcıdan ücretsiz olarak edinilebilir: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. Yaralanma
    1. Akışın kaydını durdurun. Prob pozisyonunu değiştirmediğinizden emin olun, böylece okumalar yaralanmadan sonra tutarlı kalır.
    2. Bölgeyi bir mendil/kağıt havlu ile iyice kurulayın.
      NOT: Küçük bir kalıntı sıvı hacmi bile vasküler yaralanmaya neden olmak için kullanılan FeCl3 çözeltisinin konsantrasyonunu değiştirebilir. Bu, değişken sonuçlara yol açar ve tekrarlanabilirliği etkiler. Alan tamamen kuruduğunda, prob akışı ölçemez.
    3. Plastik bir tartım teknesine dairesel bir filtre kağıdı koyun (1 mm çapında, 1 mm çapında kulak delme ile kesilmiş). Filtre kağıdına 1 μL% 6 FeCl3 çözeltisi (dH2O cinsinden yapılmış) ekleyin.
      NOT: Filtre kağıdını kullanmadan hemen önce FeCl3 çözeltisi eklediğinizden emin olun. Kağıdın çok erken ıslatılması FeCl3 çözeltisinin buharlaşmasına neden olabilir ve yaralanmanın ciddiyetini değiştirebilir.
    4. İnce forseps kullanarak, filtre kağıdını alın ve probun yukarı akışındaki artere, arterin plastik ile işaretlenmiş kısmına koyun (Şekil 2D, E). Bu plastik bir işaretleyici ve bir ara parça görevi görür. Yaralı bölgeyi işaretler ve çevredeki nemli alanla temastan kaçınarak FeCl3'ün yanlışlıkla seyreltilmesini önler.
      NOT: Filtre kağıdının düz olduğundan, sıkışmadığından veya herhangi bir şekilde katlanmadığından emin olun. Artere yerleştirildikten sonra, filtre kağıdının konumunu değiştirmeyin; bunu yapmak yaralanmanın boyutunu değiştirir.
    5. Filtre kağıdını yerleştirdikten sonra, zamanlayıcıyı başlatın ve kan akışını kaydedin. 3 dakika sonra, kağıdı çıkarın ve FeCl3'ü çıkarmak ve yaralanma sürecini durdurmak için yaralanma bölgesine salin ekleyin. Ayrıca bölgeyi nemli hale getirir. Bu aşamada, kan akışı, yaralanma öncesi kaydedildiği gibi başlangıç seviyesine geri dönmelidir.
    6. Orijinal kaydın %10'una düşene veya sıfıra ulaşana kadar akışı izleyin ve kaydedin. Trombüs yaralanma bölgesinde oluşmaya başladığında sürekli bir azalma olur (Şekil 3C). Bu süre zarfında akıştaki önemli dalgalanmalara dikkat edin.
    7. Trombüsün stabilitesini incelemek için, her önemli ve tutarlı azalmadan sonra kan akışındaki hızlı artışı kaydedin. Bu olaylar kararsız tromboza bağlı embolizasyon olarak sınıflandırılır (Şekil 4D). Akıştaki tutarlı azalmadan sonra, operatör deneyin sonunda arterdeki yaralanmayı görebilir (Şekil 2F, mavi ok / noktalı oval).
    8. Damar tıkanma süresi, kan akışının en az 1 dakika süreyle tamamen durması olarak tanımlanır. Sıfır okuma veya akıştaki önemli azalma ile gösterildiği gibi, tıkayıcı bir trombüsün oluştuğu zamanı kaydedin.
    9. Denemeyi 30 dakikada sonlandırın. Trombüs izlemeden sonraki 30 dakika içinde oluşmazsa, akışı kaydedin, kaydı durdurun ve probu çıkarın.
    10. Probu %70 etanol ve bir fırça ile temizleyerek artık doku/saç veya kalıntıları temizleyin. Probu saklama kutusuna yerleştirmeden önce tamamen kurutun. Probu uzun süreli depolama için saklama kutusuna yerleştirmeden önce tamamen kurutun.
    11. Servikal çıkık ile fareyi ötenazi yapın. Karkası, laboratuvarın adı ve tarihi ile etiketlenmiş karkas imha torbasına yerleştirin.

2. FeCl3 kaynaklı Yaralanma sonrası seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) çalışmaları için numunelerin toplanması ve hazırlanması

NOT: Sunulan EM protokolü SBF-SEM için numune hazırlama için uygundur. Bu görüntüleme tekniği, bir pıhtıdaki trombositlerin üç boyutlu yapısını incelemek için benzeri görülmemiş bir yetenek sunar. Bu teknikle, numune, numune boyunca ilerledikçe oluşturulan bir dizi sıralı blok SEM görüntüsü olarak görselleştirilir. Bu preparat için kilit noktalar şunlardır: 1) numune önceden gömülmüş ağır metallerle boyanmalıdır; ve 2) plastik gömülü numune, SEM içinde montaj için uygun şekilde kesilmelidir (kesilmiş numunelerin görseli için Şekil 6'ya bakınız). Gömme sonrası boyama SEM içinde mümkün değildir. EM analizi için FeCl3 kaynaklı damar yaralanmasından bir örnek toplarken, ameliyat yapılırken aşağıdaki değişikliklerin yapılması gerekir. Sunulan FeCl3 cerrahi protokolündeki modifikasyonlar, herhangi bir elektron mikroskobu formuna da uygulanabilir. Anestezi koşulları ve kesi yapma ve karotis arteri açığa çıkarma adımları Protokol 1'deki ile aynıdır.

  1. Karotis arteri açığa çıkardıktan sonra, iki cerrahi iplik arasındaki bölgeyi gevşek bir şekilde çevreleyerek yaralanma bölgesini işaretleyin (boyut: 0.1 mm) (Şekil 5A, B).
  2. Probu arterin altına, alt iplikten distal olarak yerleştirin (Şekil 5C).
  3. FeCl3 yaralanması bölgesini işaretlemek için plastik parçayı iki iplik arasındaki arterin altına yerleştirin (Şekil 5C).
  4. Bazal akışı not etmek için yaralanma yapmadan önce akış ölçümleri yapın. Bu ölçümler, numunenin hangi aşamada toplanacağına karar vermek için kullanılır.
    NOT: Fiksatif (her ikisi de 1x PBS'de yapılmış% 3 paraformaldehit / PFA +% 0.1 glutaraldehit) hazır olduğundan ve RT'de olduğundan emin olun. alternatif olarak, tuzlu bir arka planda% 2.5 glutaraldehit ile fiksasyon da kullanılabilir.
    DİKKAT: Hem paraformaldehit hem de glutaraldehit oldukça toksik ve tahriş edicidir. Onları tutarken, maruz kalmaktan korunmak için eldivenler, göz kalkanı ve maskeler kullanılmalıdır. Tüm fiksatif çözeltiler zehirlidir ve sabitleme adımları bir duman davlumbazında gerçekleştirilmelidir.
  5. FeCl3 ıslatılmış filtre kağıdını artere 3 dakika boyunca (% 8 FeCl3 kullanılır) yerleştirerek yaralanmayı gerçekleştirin (bu süre de değişebilir). 3 dakika sonra, filtre kağıdını çıkarın ve fazla kalan FeCl3'ü çıkarmak için yaralanma bölgesine salin ekleyin. Bu adım, yaralanmanın değişken derecesini önlemek ve prob tarafından akış sayımını kolaylaştırmak için gereklidir (Şekil 5D).
  6. Akış okumasını izleyin. Akış başlangıç değerinin% 50'sinin altına düştüğünde, probu çıkarın. Alanı hızla kurutun ve yaralanma bölgesini harici olarak düzeltmek için bölgeye fiksatif ekleyin.
  7. Arteri forseps ile yaralanma bölgesinin yakınında derhal tutun ve alt ipliğin aşağı akışını ve üst ipliğin yukarı akışını kesin. Gerekirse, başka bir kişiden bir ucu kesmeye yardım etmesini isteyin. Dokuyu plastik doku kültürü kabına toplandığı gibi aynı yönde koyun ve birkaç damla fiksatif ekleyin.
    NOT: Arterin kesilmesi anında geniş kanamaya neden olur, bu nedenle ilk kez kesmeden önce arteri tuttuğunuzdan emin olun. Bu senaryoda, fare exsanguinated edilir. Fare, ekssanguinasyon ve servikal çıkık ile ötenazi yapılır.
  8. Bir neşter kullanarak, arterin etrafındaki ekstra dokuyu temizleyin. Kan akışının yönünü kaydetmeye dikkat edin. Bunu işaretlemek için, bir ucunu yatay olarak ve diğer ucunu sivrilmiş/eğik olarak kesin (Şekil 5E).
  9. Numuneyi RT'de 1 saat boyunca fiksatif (% 3 PFA ve% 0.1 glutaraldehit) içinde tutun. Daha sonra, numuneyi EM analizi için numune işleme laboratuvarına ıslak buz üzerinde gönderene kadar 4 °C'de %1 PFA'da saklayın.
    NOT: Numuneler dondurulmamalıdır. Bu numune toplama yönteminin zorlukları şunlardır:
    1. İlk okuma optimal olmayabilir veya yaralanmadan sonra dalgalanabilir. Bu, EM analizi için tutuklamak üzere seçilen yaralanmanın derecesini etkileyebilir. Bu sorunu çözmek için, hangi konumun en uygun olduğuna karar vermek için probu yerleştirmenin çeşitli konumlarını denedikten sonra, taban çizgisi okumasını birkaç dakika boyunca kaydettiğinizden emin olun.
    2. Analiz için arteriyel bölümün harici fiksatif ve gerçek kesimini ekleyerek yaralanmayı durdurma zamanı, tromboz derecesine değişkenlik katabilir. Harici olarak sabitledikten sonra numune toplama sırasında hızlı olun.
  10. Islak buz üzerinde %1 PFA'da EM analizi için işlenmek üzere numuneleri alın. Daha fazla işleme başlamak için numuneleri buz üzerinde, 0,1 M kakodilat tamponu ile 3 dakika durulayın.
  11. Numuneleri buz üzerinde 1 saat boyunca 0,1 M kakodilat tamponu +% 2,5 glutaraldehit + 2 mM CaCl2'de sabitleyin.
  12. Fiksatifi atın ve numuneleri 2 mM CaCl2 (5 x 3 dakika) içeren soğuk 0,1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın (Şekil 6A).
  13. Numuneleri ozmiyum çözeltisi (% 3 potasyum ferrosiyanür [K 4 C 6 N6Fe] +0.3 M kakodilat tamponu + 4 mM CaCl 2 ile eşit hacimde% 4 sulu osmiyum tetroksit [OsO4; ddH2 O] cinsinden) buz üzerinde 1 saat boyunca sabitleyin.
  14. Numuneler sabitlenirken, ddH2O'da taze% 1 trikloroasetaldehit hidrat (TCH) çözeltisi yapın.
  15. Sabitledikten sonra, numuneleri RT'de ddH2O ile 5 x 3 dakika yıkayın.
  16. Numuneleri filtrelenmiş% 1 TCH çözeltisinde (ddH2O'da yapılmış) RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
  17. Numuneleri RT'de ddH2O ile yıkayın (5 x 3 dk).
  18. Numuneleri RT'de 30 dakika boyunca ddH 2 O'da%2ozmiyum tetroksit içinde sabitleyin.
  19. Numuneleri RT'de ddH2O ile her biri 5 x 3 dakika yıkayın.
  20. Numuneleri% 1 uranil asetat (sulu) içine yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  21. Numuneleri RT'de ddH2O ile her biri 5 x 3 dakika yıkayın ve en blok Walton'un kurşun aspartat boyaması ile işleyin.
  22. En blok Walton'un kurşun aspartat boyama3:
    1. ddH2O'da 30 mM L-aspartik asit çözeltisi yapın.
      NOT: pH 3.8'e yükseltilirse aspartik asit daha hızlı çözünür. Bu stok çözeltisi soğutulursa 1-2 ay boyunca kararlıdır.
    2. 10 mL aspartik asit stoğunda 20 mM kurşun nitrat çözeltisi yapın ve pH'ı 1 N KOH ile 5,5'e ayarlayın.
    3. Numuneleri 30 dakika boyunca 60 ° C'de kurşun aspartat çözeltisine yerleştirin, ardından RT'de ddH2O ile her biri 3 dakika boyunca beş yıkama yapın.
  23. Numuneleri derecelendirilmiş bir etanol serisi ile dehidrate edin. Valdivia protokolü18 ile kimyasal dehidrasyon kullanın.
    1. Numuneyi aşamalı olarak kurutmak için numuneleri aşağıdaki çözeltilerin her birinde yıkayın (Şekil 6B):
      3 dakika boyunca %25 etil alkol
      3 dakika boyunca %50 etil alkol
      3 dakika boyunca %75 etil alkol
      3 dakika boyunca %95 etil alkol
      10 dakika boyunca% 100 etil alkol ve adımı iki kez tekrarlayın (toplam üç yıkama).
  24. Numuneleri 10 dakika boyunca %100 propilen oksit (PO) içinde yıkayın ve adımı iki kez tekrarlayın (toplam üç yıkama).
  25. RT'de bir gecede DMP 30 aktivatörü ile %50/%50 PO/reçine içinde inkübe edin ve 48 saat boyunca DMP30 aktivatörü ile %100 Araldite 502/embed 812/DDSA içine yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Veriler genellikle oklüzyona kadar geçen süre veya tamamen tıkayıcı bir trombüs oluşturmak için gereken süre olarak sunulur. Bu veriler bir Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi (Şekil 4A)19, kan akışının durması veya bir deneyin sona ermesi sırasında terminal kan akışını gösteren çubuklu bir nokta grafiği (Şekil 4B) veya bir çizgi grafik (Şekil 4C) olarak çizilebilir. Trombüs stabilitesi bu teknik kullanılarak i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

FeCl3'ün trombozu indüklemek için vaskülatüre topikal olarak uygulanması yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve çeşitli trombosit reseptörleri, ligand sinyal yolları ve bunların inhibitörleri20,21,22,23 için roller belirlemede etkili olmuştur. FeCl3'ün tromboza neden olduğu mekanizma çok yönlüdür; Önceden, endotel denudasyonu trombozun bir nedeni olarak kabul edildi, an...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması yoktur.

ORCID profilleri: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Teşekkürler

Yazarlar, Whiteheart Laboratuvarı üyelerine bu makaleyi dikkatli bir şekilde inceledikleri için teşekkür eder. Çalışma, NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 ve HL150818) hibeleri ve S.W.W.'ye Gazi İşleri Bakanlığı Liyakat Ödülü, B.S.'ye R01 HL 155519 ve R.D.L.'ye NIBIB intramural program hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.9 Salin Fisher Bilimsel BP358-212NaCl,% 0.9 tuzlu su çözeltisi yapmak için kullanılır;
1 mL Şırınga Becton, Dickinson ve Şirketi 
190 Dayanıklı Etanol KOPTECV1101 Fareyi ameliyata hazırlamak için %70'lik bir etanol çözeltisi yapmak için kullanılır 
2,2,2 TribromoetanolSigma Aldrich48402
25 Yard Siyah Örgülü İpek Sütür (5-0)DEKNATEL136082-1204
26G x 3/8 İğne Becton, Dickinson ve Şirketi 305110
2-metil-2-bütanolSigma Aldrich240486
7.5 mL transfer pipeti, 3 mL'ye derecelendirildiGlobe Scientific Inc.135010
Alkol Hazırlama Pedleri (%70 İzopropil Alkol)MedlineMDS090735
Araldite GY 502 Elektron mikroskobu Hizmetleri 10900
Hücre Kültürü Kabı 35mm X 10mm Corning Anonim Şirketi 
Kompakt Tartı Ward'ın Bilimi 470314-390
Diseksiyon Makası, 12,5 cm uzunluğundaDünya Hassas Aleti15922-G
DMP-30 aktivatör Elektron mikroskobu Hizmetleri 13600
Dodenil Süksinik Anhidrit / DDSAElektron mikroskobu Hizmetleri 13700
Köpek Kaka Torbaları / hayvan karkas imha çantasıTaç Ürünleri PP-RB-200
Doppler FlowProbeTransonik Sistemler A.Ş.MA0.5PSB
GÖMME 812 reçine ve nbsp;Elektron mikroskobu Hizmetleri 14900
Etil Alkol, susuz 200 kanıt Elektron mikroskobu Hizmetleri 15055
Göz Sargısı Forseps, 4" Tam Kavisli, Standart, 0.8mm Geniş UçlarIntegra Miltex18-784
Filtre Kağıdı VWR28310-106
İnce Makas - Keskin-Körİnce Bilim Aletleri 14028-10
Parmak Döngü Kulak Zımbaları Güzel Bilim Araçları 24212-01
Gazlı Bez Süngerler 2 "x 2" & ndash; 12 Katlı Dukal Corporation2128
Glutaraldehit (%10 çözelti)Elektron mikroskobu Hizmetleri 16120
Integra Miltex Karbon Çelik Cerrahi Bıçak #10Integra® Milteks®4110
Demir (III) Klorür SIGMA-ALDRICH157740-100G
Bıçak Sapı Miltex® Ekstra İnce Paslanmaz Çelik Boyut 3Integra Lifesciences 157510
L-aspartik asitSigma  Balıkçı  A93100
L-aspartik asitFisher Scientific BP374-100
Kurşun Nitrat Fisher Bilimsel L-62
LEICA S8AP0 MikroskopLEICAartık mevcut değilşirketten temin edilemiyor
LEICA S8AP0 Mikroskop Standı LEICA10447255şirketinden temin edilememektedir
.VWR82003-822
Mikro Diseksiyon Forsepsleri; 1x2 Diş, Tam Eğri; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" UzunlukRoboz Cerrahi Alet ŞirketiRS-5157
Osmiyum Tetroksit% 4 sulu çözelti Elektron mikroskobu Hizmetleri 19150
Paraformaldehit (%16 çözelti)Elektron mikroskobu Hizmetleri 15710
Potasyum ferrisiyanürSIGMA-ALDRICHP-8131
Propilen Oksit, ACS reaktifi Elektron mikroskobu Hizmetleri 20401
Rainin Klasik Pipet PR-10Rainin17008649
Araştırma Debimetresi Transonik Sistemler A.Ş.T402B01481Modeli: T402
Scotch Magic Görünmez Bant, 3/4 "x 1000", ŞeffafScotch 
Küçük Hayvan Isıtmalı PedK & H İmalat A.Ş.Model: HM10
Sodyum Kakodilat Tamponu 0.2M, pH7.4Elektron mikroskobu Hizmetleri 11623
Steril Pamuk Uçlu Aplikatörler Püriten Medikal Ürünler 25-806 1WC
Steromaster Aydınlatıcı Fisher Bilimsel 12-562-21Artık
Surgical Dumont #7 ForcepsGüzel Bilim Araçları 11271-30
Tiyokarbohidrazid (TCH)SIGMA-ALDRICH88535
Evrensel Düşük Tutmalı Pipet Ucu Yeniden Yüklemeleri (0.1-10 & mikro; L)VWR76323-394
Uranil Asetat Elektronmikroskobu Hizmetleri 22400
Veet Jel Krem Saç ÇıkarıcıReckitt Benckiser3116875
Beyaz Antistatik Altıgen Tartı Tekneleri, Orta, 64 x 15 x 19 mmFisher Scientific S38975
WinDAQ/100 YazılımıDATAQ Instruments, Inc.Sürüm 3.38Ücretsiz olarak indirilebilir. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1ZEISS57615
309659430165 Artık Artık Light-Duty Tissue Wipers 305289 şirketinden temin edilemiyor.Windows için

Kaynaklar

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252(2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260(2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184(2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890(2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859(2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ferrik Klor r YaralanmasKarotis ArterTrombus Olu umuPlatelet Ultrastr kt rVask ler Yaralanma ModeliAntitrombotik AjanlarKan Ak l mTrombus Morfolojisi
Ferrik Klorür Kaynaklı Arteriyel Tromboz ve 3D Elektron Mikroskobu Analizi için Numune Toplama
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.