Yöntem makalesi

Fly Compound Eye'ın optik, fizyolojisi ve biyokimyasını incelemek için yöntemler

24 Mart 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TARTIŞILAN MAKALELER:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. Karasinek bileşik gözlerinin görsel alanının otomatik grafiği. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (181), E63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. eGFP etiketli proteinler kullanılarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde zar protein kaçakçılığının incelenmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (179), E63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Drosophila fotoreseptörlerinde fotopigment seviyelerini ölçmek için elektrofizyolojik yöntemler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (184), E63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Endojen Drosophila geçici reseptör potansiyel kanallarının saflaştırılması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (178), E63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Kütle spektrometresi kullanılarak Drosophila fotoreseptörlerinde lipid sinyalizasyonunun analizi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (181), E63516 (2022).

Editöryal

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinek bileşik gözü, temel biyolojik mekanizmaları aydınlatmak için önemli bir biyolojik model sistemidir. Bu sistem kullanılarak incelenen mekanizmalardan bazıları şunlardır: neredeyse panoramik görüş alanına sahip bileşik göz görüşü1; ışığa duyarlı G-proteinine bağlı reseptör 2,3,4'ün biyofiziği, protein montajı ve biyogenezi; fosfolipaz Cβ aracılı sinyal iletim sistemi 5,6; Doğal dokuda TRP kanal aktivasyonu ve modülasyonu 5,6; çoklu protein sinyal kompleksi 7,8'in montajı ve işlevi; inositol-fosfolipid geri dönüşümünün moleküler yapısı, biyokimyası ve işlevi 9,10; ve sinyal proteinlerinin sinyal aracılı hücre altı translokasyonu11,12. Sinek bileşik gözünün benzersiz anatomik yapısı ve optikleri kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve temel gelişim mekanizmaları ve görme kapasiteleri ortaya çıkarılmıştır.

Bu yöntem koleksiyonu, sinek bileşiği gözünde yukarıdaki mekanizmalardan bazılarını incelemek için yöntemler geliştiren ve rafine eden önde gelen bilim adamlarının çalışmalarını içerir. Muñoz et al. bileşik gözün ve uzamsal organizasyonunun doğru bir tasvirini sağlayan sinek gözünün optik düzenlemesini nicel olarak analiz etmek için bir yöntem tanımlamaktadır13. Bu yöntem, görsel bilginin nöronal işlenmesini ayrıntılı olarak incelemek için gereklidir. Daha da önemlisi, biyo-ilhamlı yapay gözler üretmek için birçok girişimde bulunulmuştur ve bunlar mevcut bileşik gözlerin nicel çalışmalarına dayanmaktadır. Wagner ve ark. Drosophila fotoreseptör hücreleri14 içinde eGFP etiketli proteinleri lokalize etmek için bileşik gözün benzersiz bir optik fenomeni olan derin psödopupil ve korneanın optik nötralizasyonu ile yüksek amplifikasyon mikroskobu kullanır. Bu yöntem, fotoreseptör dejenerasyonu ve hücresel lokalizasyon ve önemli sinyal proteinlerinin kaçakçılığı nedeniyle rabdomerlerdeki yapısal kusurların saptanmasına olanak tanır. Gutorov ve ark. in vivo fotopigment durumlarının seviyesini ve sinyal proteinlerindeki spesifik mutasyonlarla modülasyonlarını ölçmek için tüm gözden veya tek fotoreseptör hücrelerinden elektrofizyolojik ölçümler kullanır15. Bu yöntem, fotonların absorpsiyonu tarafından indüklenen görsel pigment durumu (R) içindeki yük yer değiştirmelerinden yararlanır ve bu da karanlıkta (M) kararlı olan ikinci bir pigment durumunun oluşmasıyla sonuçlanır. Ek bir yöntem, görsel pigmentin karanlık iki kararlı özelliklerinden ve sinek R ve M durumlarının absorpsiyon spektrumlarındaki farklılıklardan yararlanan ışık kapalıyken (PDA) uzun süreli depolarizasyon kullanır. PDA, büyük miktarda fotopigmentin dönüşümüne bağlı olduğundan, fotopigmentin biyogenezindeki en ufak bir kusur bile kolayca saptanabilen anormal bir PDA'ya yol açabilir. Gerçekten de, anormal PDA sergileyen Drosophila mutantları, yeni sinyal proteinlerinin keşfedilmesine yol açmıştır. Bunun göze çarpan bir örneği, iskele proteini inaktivasyonundan oluşan ancak artçı potansiyel D (INAD), göze özgü protein kinaz C (eyePKC), fosfolipaz Cβ (PLCβ) ve geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalından oluşan yeni protein kompleksinin keşfidir. İlk kez, Liu ve ark. Drosophila TRP kanalı16'yı saflaştırmak için bir teknik sunar. Bu değiştirilmiş afinite saflaştırma yöntemi, INAD sinyal kompleksinin montaj mekanizmasına dayanan bir rekabet stratejisi kullanır. Bu strateji, endojen TRP kanalının saflaştırılmasını sağlar. Bu yönteme göre, önce Ni-boncuklarına bağlı bir PLCβ fragmanı histidin ile etiketlenir ve Drosophila baş homojenatlarından elde edilen endojen INAD protein kompleksini aşağı çekmek için kullanılır. Daha sonra, aşırı saflaştırılmış glutatyon S-transferaz (GST) ile etiketlenmiş TRP fragmanları, INAD'a bağlı endojen TRP kanalı ile rekabet etmek için Ni-boncuklara eklenir. Son olarak, süpernatanttaki etiketli TRP kanal fragmanlarını endojen TRP kanalından ayırmak için boyut dışlama kromatografisi kullanılır. Panda et al. kütle spektrometrisi17 kullanarak Drosophila fotoreseptör hücrelerinde çeşitli lipid sınıflarını tanımlamak ve ölçmek için hassas bir teknik bildirmektedir. PLCβ'nin aktivasyonu, yüzey zarında fosfatidilinositol 4,5 bifosfatın (PI(4,5)P2 ) hidrolizine yol açtığından, fototransdüksiyon için çok önemlidir. Bu reaksiyon sonuçta TRP kanalının aktivasyonuna yol açar. Ek olarak, PLCβ aktivitesi birçok lipid türünün üretilmesine neden olur. Bu lipid türlerinin birçoğunun TRP aktivasyonunda yer alabileceği ve duyusal iletimi optimize etmek için fotoreseptörlerin fonksiyonel organizasyonunda anahtar rol oynayabileceği öne sürülmüştür. Panda ve ark.17 tarafından yapılan çalışmada, bu bulgular, spesifik lipidlerin seviyelerini kontrol eden kusurlu enzimleri barındıran Drosophila mutantlarının izole edilmesiyle değerlendirilmiştir.

Sinek bileşik gözü, biyolojideki temel mekanizmaları aydınlatmak için yararlı bir deneysel sistemdir. Drosophila'da geliştirilen güçlü genetik metodoloji, sinek fototransdüksiyonunda yer alan sinyal proteinlerini analiz etmek ve keşfetmek için kullanılabilir. Bu yöntem koleksiyonu, bileşik gözün anatomik ve optik analizi ve fotoreseptör hücrelerinin moleküler bileşenleri ve biyokimyasal reaksiyonları dahil olmak üzere sinek görüşünün temel mekanizmalarını araştırmak için ana teknikleri ayrıntılı olarak özetlemektedir. Video makaleleri ayrıca bu metodolojilerin doğasında var olan zorluklar hakkında önemli tavsiyeler içerir. Bu yöntem koleksiyonu, bu teknikler diğer biyolojik preparatlara uyarlanabileceğinden, bu araştırma alanı dışındaki bilim adamları için de faydalı olmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarın hiçbir onayı yok.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

İlgili makaleler