Yöntem makalesi

Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

DOI:

10.3791/65027

⸱

2 Mayıs 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoid teknolojisi, in vitro olarak karaciğer, beyin ve bağırsak gibi çeşitli insan organı benzeri mini yapılar üretmemize izin verdi. Organoid modellerdeki kayda değer gelişmeler, son zamanlarda hastalık modellemesi, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfinde çeşitli uygulamalar için yeni bir deneysel çağ açmıştır. Yetişkin kök hücreler veya indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi karaciğer organoidleri, çeşitli uygulamalar için kullanılacak hepatositlerin oluşumunu yönetir. Burada, pluripotent kök hücrelerden hepatik organoidler üretmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol sağlıklı ve hasta kaynaklı hücrelere uygulanabilir. 3D endoderm türevli hepatik organoidler (eHEPO'lar) elde etmek için, iPSC'ler doğrudan önce endodermal hücrelere farklılaştırıldı ve daha sonra genişleme ortamını kullanarak hepatik organoidler oluşturmak için FACS ile zenginleştirilmiş EpCAM pozitif (EpCAM +) hücreler kullanıldı. 2 hafta içinde hepatik organoidler üretmek için hızlı ve verimli bir yöntem sunuyoruz. Üretilen organoidler, albümin salgılanması, glikojen depolanması ve sitokrom P450 enzim aktivitesi gibi hepatositlerin temel özelliklerini ve işlevlerini taklit eder. Karaciğere özgü gen ekspresyonu benzerliklerinin yanı sıra, eHEPO'lar aralarında safra kanalikülleri bulunan polarize epitel hücreleri içerir. Ek olarak, eHEPO'lar matür hepatositlere farklılaşma kapasitelerini kaybetmeden uzun süreli (1 yıl) genişletilebilir ve seri geçişler yapılabilir. Bu nedenle, eHEPO'lar fonksiyonel hepatositler üretmek için alternatif bir kaynak sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidler, organ mikro çevresini taklit eden ve organ gelişiminin kendisinde kendi kendini organize etme ve kendini yenileme için gerekli içsel faktörleri içeren 3 boyutlu kültür koşullarında yetiştirilen minyatür organ benzeri yapılardır. Organoidler, pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) veya yetişkin doku kaynaklı hücrelerden (kök veya progenitör hücreler) türetilebilir1. Doğru organ benzeri organizasyonları ve belirli bir organa işlevsel benzerlikleri onları hastalık modellemesi için değerli araçlar haline getirse de, kültürde standardizasyon açısından daha fazla iyileştirmeye ihtiyaçları vardır. Özellikle, karaciğer organoidlerinin üretilmesi için çeşitli protokoller yayınlanmıştır ve bunlar karmaşıklıkları ve tekrarlanabilirlikleri bakımından farklılık gösterir2. Örneğin, Takebe ve ark. tarafından geliştirilen karaciğer tomurcuğu organoidleri, aşağıdaki indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) içeren yoğun, çok hücreli yapılar şeklini alır: hepatik endodermal progenitörler, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) ve mezenkimal kök hücreler (MSC'ler). Bununla birlikte, bu organoidlerin uzun vadeli kendini yenileme kapasitesi yoktur 3,4.

Tarihsel bir perspektiften bakıldığında, Huch ve ark. ilk olarak, hücrelerin polarize olduğu ve doğal epitelin özelliklerini çoğaltmak için uzmanlaştığı yetişkin dokusundan türetilen insan hepatik epitel organoidlerinin üretimini bildirmiştir5. Daha sonra, Guan ve ark. karaciğerde safra kanalı azalması ile ilişkili nadir bir genetik bozukluk olan Alagille sendromunu (ALGS) modellemek için iPSC'den türetilmiş hepatik organoidler kullandılar6. Bu organoidlerin her ikisi de kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve safra ve albümin sekresyonu, glikojen depolanması ve karaciğere özgü ilaç detoksifikasyonu gibi olgun hepatosit fonksiyonları kazanabilir. Yakın tarihli bir çalışmada, Ramli ve ark. kolestatik ilaçları kolanjiyosit benzeri hücrelerden (CLC'ler) oluşan safra kistlerine boşaltan polarize hepatosit benzeri hücreler (HLC'ler) arasında fonksiyonel safra kanalikülleri ağları içeren PSC'den türetilmiş bir karaciğer organoid modelini tanıttı7.

Bu çalışma, eHEPO'lar olarak adlandırılan iPSC'den türetilmiş endodermal hepatik organoidler üretmek için benzersiz bir kültür sunmaktadır. iPSC kültürü ve endoderme farklılaşma adım adım açıklanır ve zenginleştirilmiş EpCAM + progenitörlerinden eHEPO'ların üretilmesi gösterilmiştir. Son olarak, eHEPO'ların işlevselliğinin ve yapısal organizasyonunun karakterizasyonunun yanı sıra organoidlerin dondurularak saklanması açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel adımlarla ilgili izinler Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi yerel Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'ndan alınmıştır (2013/25-4, 12 Mayıs 2013; 2016/30-29, 24 Kasım 2016).

1. Hücre kültürü için çözeltilerin hazırlanması

  1. Aşağıdaki bileşenleri laminer bir akış başlığında karıştırarak endoderm farklılaşma ortamını hazırlayın: %1 B27, 100 ng/mL Aktivin A, Wnt3a veya %30 wnt3a-CM ve R-spo1 veya %10 R-spo1-CM (Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunu aşağıdaki bileşimle hazırlayın: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, %1 FBS.
  3. Genleşme ortamını (EM) hazırlayın:% 1 N2,% 1 B27, 1.25 mM N-asetil-L-sistein, 50 ng / mL EGF,% 10 R-spo1 şartlandırılmış ortam, 100 ng / mL FGF 10, 10 mM nikotinamid, 5 μM A8301 ve Gelişmiş DMEM / F-12'de 10 μM forskolin (FSK). 10 nM Y-27632 ve 0.3 nM WNT3a ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Tüm ortamı 2-2 °C'de en fazla 8 hafta tutun.
  4. Farklılaşma ortamını (DM) hazırlayın:% 1 N2,% 1 B27, 10 nM gastrin, 50 ng / mL EGF, 100 ng / mL FGF 10, 25 ng / mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng / mL BMP7 ve Ad-DMEM / F-12'de 30 μM deksametazon ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Tüm ortamı 2-8 °C'de 2 hafta boyunca saklayın.

2. Besleyici içermeyen plaka üzerindeki iPSC'lerin çözülmesi

  1. Hücre kültürü plakasını bazal membran matrisi (BMM) ile kaplayın.
    1. Kaplamaya başlamadan önce bir şişe BMM alikotunu gece boyunca veya en az 2 saat buzda çözün. 15 mL'lik konik bir tüpe 6 mL soğuk DMEM/F-12 ekleyin, hemen 80 μL çözülmüş BMM ekleyin ve iyice karıştırın.
    2. Doku kültürü ile muamele edilmiş kuyucuk plakaları kullanın, kültür plakasını BMM çözeltisi ile kaplayın ve kuyu plakası yüzeyini kaplayacak şekilde dağıtın. Plakayı kullanmadan önce en az 1 saat 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, BMM çözeltisini atın ve hemen iPSC'ye özgü ortamı ekleyin.
  2. Kriyojenik eldivenler kullanarak sıvı nitrojen deposundan bir şişe iPSC'yi çıkarın. Şişeyi hemen yüzer bir tüp rafına yerleştirin ve buz kristalleri eriyene kadar rafı 37 ° C'lik bir su banyosuna daldırın.
    1. Şişeyi su banyosundan çıkarın ve dışını% 70 etanol ile iyice silin. Ardından, laminer başlığa yerleştirin. Bu adımda hızlı olmak önemlidir.
    2. Aseptik koşullar altında, laminer bir başlıkta, çözülmüş hücreleri 5 mL iPSC'ye özgü ortam içeren steril 15 mL konik bir tüpe aktarın.
      1. Hücreleri 200 × g'da (oda sıcaklığında) 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yavaşça atın, 5 mL'lik bir serolojik pipetle birkaç kez çok nazikçe pipetleyerek hücreleri 2 mL iPSC'ye özgü ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri kaplanmış kuyucuklara tohumlayın.
    3. Hücreleri kuyu yüzeyi boyunca dağıtmak için plakayı hızlı bir şekilde hareket ettirin. Plakayı 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre inkübe edin.
    4. Kültür ortamını her gün yenileyin.

3. Endoderm farklılaşması

  1. Bölüm 1'de belirtildiği gibi, iPSC'leri bölmeden önce 2 saat yeni bir kuyu plakasını BMM ile kaplayın.
  2. Işık mikroskobu altında iPSC'lerin bütünlüğünü ve canlılığını kontrol edin. Farklılaşmamış iPSC'ler, büyük çekirdeklere, küçük sitoplazmaya ve farklı kenarlara sahip kompakt hücre kolonilerine sahip hücrelerdir.
    NOT: Hücreleri bölmek için iki enzimatik çözüm vardır. Dispas (1 U / mL) kullanılması durumunda, farklılaşmış hücrelerin alanları çıkarılmalıdır. Spesifik bir enzim kullanılıyorsa, bölgeleri kazıma veya emme ile manuel olarak ayırt etmeye gerek yoktur. Spesifik enzimi oda sıcaklığında tutun.
  3. iPSC ortamını oda sıcaklığına ısıtın. Ortamı aspire edin ve iPSC plakasını DMEM / F-12 veya D-PBS ile durulayın. 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 1 mL spesifik enzim ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin ve ardından spesifik enzimi aspire edin ve plakayı 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin.
    NOT: Enzimlerle en uygun tedavi süresi, kullanılan iPSC hattına göre optimize edilmelidir.
  4. İnkübasyon süresinden sonra, 1 mL önceden ısıtılmış iPSC ortamı ekleyin ve farklılaşmamış koloni agregalarını plakanın yüzeyinden ayırmak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Agregaların optimal boyutu 50-200 μM'dir.
    1. 5 mL'lik bir serolojik pipet ile süspansiyonu nazikçe karıştırın ve ardından hücre süspansiyonunu istenen yoğunlukta BMM kaplı kuyucuğa tohumlayın. % 70'lik bir birleşmeye ulaşmak için hücreleri 37 ° C'de 3-5 gün inkübe edin.
  5. Farklılaşmaya başlamadan önce, iPSC ortamını endoderm ortamı ile değiştirin (adım 1.1). Ortamı her gün yenileyin. Farklılaşma adımları sırasında hücrelerin morfolojik değişikliklerini kontrol edin. Farklılaşmayı takiben hücre-hücre etkileşimleri ortaya çıkmaya başlar ve hücreler dikenli bir şekil alır.

4. eHEPO kuruluşu

  1. EpCAM+ endodermal hücrelerin FACS ile zenginleştirilmesini gerçekleştirin.
    1. Hücre sıralama deneyinden önce bir organoid spesifik BMM şişesini (Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözdürün. Hücre sıralama deneyinden önce doku kültürü plakalarını gece boyunca 37 °C'de önceden ısıtın.
    2. Endoderm hücrelerini 1x PBS ile durulayın. 300 μL tripsin ekleyin ve inkübatörde 5 dakika inkübe edin. 3 mL soğuk DMEM-F12 ekleyin ve tek hücreler oluşturmak için 1.000 μL filtre uçlarıyla pipetleyin.
    3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri 300 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 10 mL FACS tamponu ile yıkayın (adım 1.2).
    4. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için, hücreleri önce 100 μm'lik bir gözenekli süzgeç ve ardından 40 μm'lik bir gözenekli süzgeç ile filtreleyin.
      NOT: Süzgeci kullanmadan önce süzgecin yüzeyini 1 mL FACS tamponu ile durulayın.
    5. Hücre süspansiyonunu 300 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. Tripan Blue8 ile hücre numarasını sayın.
    6. Boyama oranı 1:11'dir. Örneğin, 105 μL FACS tamponu ile 15 x 106 hücreyi yeniden süspanse edin ve 45 μL FcR ve 15 μL EpCAM ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Hücreleri 40 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve tüpü ışıktan koruyun. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu yıkamak için 500 μL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri 300 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin.
    7. Peletleri 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri ölçmek için hücre süspansiyonuna DAPI (0.5 μM / 1 mL, son konsantrasyon) ekleyin. Hücre sıralama adımına başlayana kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
  2. EpCAM'i ve sıralanmış hücreleri BMM'ye gömün. Hücre tasnif işleminden sonra, FACS tamponunu geri çekmek için hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 20 μL BMM'de 3.000-5.000 hücreyi yeniden süspanse edin.
    1. Her 48 oyuklu plakanın ortasına bir damla BMM ekleyerek hücreleri tohumlayın. BMM katılaşana kadar hücreleri 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Plakayı dikkatlice geri takın ve 10 dakika daha inkübatörde tutun. Damlacığı genleşme ortamı ile kaplayın (48 oyuklu bir plaka için oyuk başına 250 μL).
    2. Organoid ortamı her 3 günde bir yenileyin. 10-11. günlerde organoid boyutu 100 μm'den daha büyük olacaktır.
  3. eHEPO mekanik ayrışma ve farklılaşma gerçekleştirin.
    1. Her organoid damlacığı 1:4 oranında bölün. Bölmek için organoid ortamı atın ve 500 μL soğuk Ad-DMEM/F12 ekleyin. 1.000 μL filtre uçları ile BMM damlacıklarını kuvvetlice pipetleyin.
    2. 15 mL konik tüplere maksimum 10 BMM damlacık toplayın ve 5 mL soğuk Ad-DMEM / F12 ekleyin. Tüpü 3-5 dakika buz üzerinde tutun.
    3. Hücreleri 200 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1 mL kalana kadar atın. 200 μL filtre uçları kullanarak hücre peletini 30-40 kez kuvvetlice pipetleyin. Organoid boyutunu ışık mikroskobu altında kontrol edin, tek hücreli bir süspansiyon oluşumundan dikkatlice kaçının.
    4. Mekanik ayrışmadan sonra, 5 mL soğuk Ad-DMEM / F12 ekleyin ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı atın ve hücreleri tohumlayana kadar süspansiyonu buz üzerinde tutun.
    6. 50 μL'lik bir BMM damlacığı tohumlayın (24 oyuklu bir plaka için oyuk başına 35 μL BMM + 15 μL hücre ve Ad-DMEM/F-12 içerir).
    7. EM ortamına BMP7 (25 ng / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 3 gün boyunca kültürleyin. 4. günde, ortamı farklılaştırma ortamıyla değiştirin (adım 1.4). Ortamı her 3 günde bir yenileyin ve hücreleri en az 14 gün boyunca kültürleyin.

5. eHEPO'ların karakterizasyonu

  1. Histolojik incelemeler yapın.
    1. Parafin gömme işlemini gerçekleştirin.
      1. Ortamı çıkarın, 1-2 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve BMM'yi soğuk 1x PBS'de yavaşça yeniden askıya alın. Organoidleri dikkatlice 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Organoidlerin yerçekimi altında yerleşmesine izin verin ve ardından PBS'yi dikkatlice aspire edin. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
      2. Organoidlere 10 mL taze fiksatif (% 10 nötr tamponlu formalin) ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Sabitleyiciyi nazikçe çıkarın, 10 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. PBS'yi dikkatlice aspire edin.
      3. Organoidleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 96 etanol içinde çözülmüş% 0.5 eozin ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisinde boyayın.
        NOT: İmmün boyama yapılacaksa eozin ile boyama yapmayın.
      4. Organoidleri, her biri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir alkol serisi (%70 etanol, %80 etanol ve %96 etanol) kullanarak yıkayarak kurutun. Organoidleri 30 dakika boyunca %100 etanol (mutlak etanol) içinde bekletin.
      5. Organoidleri ksilen kullanarak temizleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) her seferinde 20 dakika boyuncaüç kez 9.
        DİKKAT: Ksilen çok toksik ve yanıcı bir bileşiktir, bu nedenle uygun güvenlik donanımı kullanarak kullanın. Büyük miktarlarda çalışmaktan kaçının.
      6. Organoidleri, plastik bir pipet kullanarak erimiş parafin ile önceden ısıtılmış bir metal tabanlı kalıba ( Malzeme Tablosuna bakın) yavaşça aktarın. Organoidleri erimiş parafin içinde her biri 65 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca üç kez tutun (her değişiklikte yeni taze erimiş parafin ile değiştirin).
      7. Ardından, organoidleri yeni taze parafine gömün. Organoidleri yavaşça metal taban kalıbının ortasına hareket ettirin.
        NOT: Bu adım için hızlı çalışmak çok önemlidir çünkü parafin oda sıcaklığında katılaşır.
      8. Organoidleri stabilize etmek için metal taban kalıbını 10-20 saniye boyunca soğuk plakaya aktarın. Ardından, metal tabanlı kalıbı kaplamak için erimiş parafin dökün ve etiketleme için metal tabanlı kalıbın üstüne bir doku kaseti ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Kalıpta yeterince parafin olduğundan emin olun ve ardından soğuk plaka üzerinde katılaşmasına izin verin. Metal taban kalıbını çıkarın.
      9. Standart bir mikrotom kullanarak 5-7 μm kalınlığında kesitler kesin (Malzeme Tablosuna bakınız). Seri parafin bölümlerini yapışkan mikroskop slaytlarına yerleştirin. Slaytları gece boyunca kurumaya bırakın.
    2. Hematoksilen ve eozin (H & E) ve periyodik asit-Shiff (PAS) boyaması yapın.
      1. Parafine gömülü slaytları deparafinizasyon için gece boyunca 63 ° C'lik bir inkübatöre koyun. Ertesi gün, slaytları her seferinde 20 dakika boyunca üç kez ksilene yerleştirin. Slaytların kurumasına izin vermeyin.
      2. Slaytları kademeli bir alkol serisi (%100 etanol, %96 etanol, %80 etanol ve %70 etanol) ile 2 dakika boyunca yeniden sulandırın. Daha sonra slaytları 1 dakika boyunca damıtılmış suya koyun.
      3. H&E boyama için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
      4. Slaytları 5 dakika hematoksilen çözeltisine koyun. Slaytları akan musluk suyunda 5 dakika durulayın. Slaytları %1 eozin Y solüsyonu ile 10 saniye boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      5. Bölümleri her biri 30 saniye boyunca bir dizi %80 etanol, %96 etanol ve iki adet %100 etanol değişikliği ile kurutun.
      6. Her seferinde 20 dakika boyunca üç kez temizlemek için slaytları ksilenin içine koyun.
      7. Lamelleri, bir montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki bölümlere dikkatlice monte edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Kabarcık kalmadığından emin olun.
      8. PAS boyama için, 5.1.2.4-5.1.2.6 adımlarını ve ardından Akbari ve ark.10 tarafından bildirilen PAS boyama prosedürlerini gerçekleştirin. Daha sonra lamelleri montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki bölümlere dikkatlice monte edin. Kabarcık kalmadığından emin olun.
    3. İmmünohistokimya (IHC) boyaması yapın.
      1. H & E boyama protokolünde adım 5.1.2.1 ve adım 5.1.2.2'yi gerçekleştirin.
      2. Slaytları 0.1 M sitrat tamponunda (pH 6.0) mikrodalgada 10 dakika ısıtın.
      3. Slaytlar oda sıcaklığına soğuyana kadar (yaklaşık 20 dakika) tutun ve slaytları damıtılmış suyla durulayın.
      4. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca metanol içinde taze hazırlanmış% 3 H2O2 içine koyun. Ardından slaytları damıtılmış suda 1 dakika durulayın.
      5. Bölümleri bir bloke edici solüsyon (% 2 serum +% 0.1 Triton X-100 +% 0.1 BSA) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe ederek primer antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin.
      6. Blokaj solüsyonunu nazikçe çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş birincil antikorları (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      7. Ertesi gün, slaytları 10 dakika boyunca iki kez dikkatlice durulayın (.
      8. İkincil antikorları (Keçi Tavşan Karşıtı, Keçi Fare Önleyici) ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat ekleyin ve slaytları damıtılmış suda 5 dakika (üç kez) durulayın.
      9. 3'3 diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi hazırlayın (bu, kullanımdan 30 dakika önce hazırlanmalıdır).
      10. DAB solüsyonunu slaytlara 1-5 dakika uygulayın ve slaytları damıtılmış suda 5 dakika (üç kez) durulayın.
      11. Bölümleri 1 dakika hematoksilen ile karşı boyayın ve slaytları 1 dakika akan musluk suyunda durulayın.
      12. Bölümleri her biri 30 saniye boyunca bir dizi %80 etanol, %96 etanol ve iki adet %100 etanol değişikliği ile kurutun.
      13. Slaytları 20 dakika (üç kez) ksilene koyun.
      14. Lameli bir montaj ortamı ile cam sürgü üzerindeki bölüme dikkatlice monte edin. Kabarcık kalmadığından emin olun.
    4. OCT ekleme işlemini gerçekleştirin.
      1. Organoidleri taze hazırlanmış soğuk %4 PFA kullanarak gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin. Sabitleyiciyi dikkatlice çıkarın ve 1x PBS ile 15 dakika (üç kez) yıkayın.
      2. Damıtılmış su kullanarak% 30'luk bir sükroz çözeltisi (a / h) hazırlayın. 1x PBS'yi çıkarın ve organoidleri kurutmak için% 30 sükroz ekleyin.
      3. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Başlangıçta, çoğu doku% 30 sükroz içinde yüzer ve geçirgenlik tamamlandığında batar. Kriyoproteksiyon bu noktada tamamlanmış olarak kabul edilebilir.
      4. Gömme işlemi için kuru buz veya sıvı nitrojen hazırlayın.
      5. Plastik kriyokalıplara iki ila üç damla OCT ( Malzeme Tablosuna bakınız) koyun. Organoidleri kesmek için doğru yönde üstüne yerleştirin.
      6. OCT'yi yavaşça ve dikkatlice organoidlerin üzerine dökün. Kabarcıklardan kaçınmak için dikkatli olun. Organoidlerin oda sıcaklığında 10-15 dakika yerçekimi altında çökmesine izin verin.
      7. Dondurma adımından önce kriyokalıpları etiketleyin. Hızlı dondurma için kalıpları kuru buz veya sıvı nitrojen üzerine yerleştirin. Kriyokalıpları -80 °C'ye aktarın ve kesit alma işlemine kadar orada saklayın.
    5. İmmünofloresan (IF) boyama yapın.
      1. Donmuş bölüm boyama işlemini gerçekleştirin.
        1. Kriyo bölümlerini oda sıcaklığında 20-30 dakika havayla kurutun. Slaytları 5 dakika (üç kez) damıtılmış suyla yeniden sulandırın. Dokuyu bir pap-pen kullanarak hidrofobik bir bariyer ile çevreleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
        2. Bölüm başına 200-300 μL %0,2 Triton X-100 ekleyin. Slaytları 5 dakika (üç kez) dikkatlice yıkayın. Yıkama adımları sırasında bölümlerin kızaklardan düşmemesine dikkat edin.
        3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici çözelti (% 2 serum +% 0.1 Triton X-100 +% 0.1 BSA) ekleyin.
        4. Blokaj solüsyonunu nazikçe çıkarın, blokaj solüsyonunda seyreltilmiş primer antikorları (E-CAD, A1AT, HNF4α) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve slaytları gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.Ertesi gün, slaytları 10 dakika (iki kez) dikkatlice durulayın.
        5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun ikincil antikorlar (Alexa Fluor 488 [Fare], Alexa Fluor 594 [Fare], Alexa Fluor 594 [Tavşan]) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve slaytları damıtılmış suda 5 dakika (üç kez) durulayın.
        6. Bölüm başına 3 dakika boyunca 100-200 μL Hoechst veya DAPI nükleer boya ekleyin, slaytları 1x PBS ile yıkayın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
        7. Lamelleri, solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki bölümlere monte edin. Slaytları gece boyunca 4 °C'de tutun ve görüntüleme işlemine kadar ışıktan koruyun.
      2. Tam montajlı boyama yapın.
        1. Parafin gömme prosedüründe adım 5.1.1.1 ve adım 5.1.1.2'yi gerçekleştirin.
        2. Bloke edici çözelti ekleyin (1x PBS'de% 0.1 -% 1 Triton X-100,% 1 DMSO,% 1 BSA ve% 1 keçi serumu, Malzeme Tablosuna bakınız) ve organoidleri oda sıcaklığında 2-3 saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin.
        3. Blokaj solüsyonunu nazikçe çıkarın ve bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş primer antikorları (CK19, CK18, ZO-1, ALB) gece boyunca 4 °C'de ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
        4. Ertesi gün, çözeltiyi yavaşça çıkarın ve 1x PBS ekleyin. Organoidlerin yerçekimi altında 10 dakikaya kadar yerleşmesine izin verin. Solüsyonu dikkatlice çıkarın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
        5. Organoidleri ikincil antikorlarla (Alexa Fluor 594 [Fare], Alexa Fluor 488 [Tavşan], Alexa Fluor 488 [Fare]) oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin. Solüsyonu dikkatlice çıkarın ve yıkama adımını dört kez tekrarlayın.
        6. Nükleer boyama için, organoidleri Hoechst veya DAPI nükleer boya ile 10 dakika inkübe edin. Organoidleri 1x PBS ekleyerek yıkayın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Organoidlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
        7. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak organoidleri tüpten çıkarın ve cam slaytların üzerine yerleştirin. Organoidlere en az zarar vererek yaptığınızdan emin olun.
        8. Fazla PBS'yi çıkarın ve bir miktar (bir ila iki damla) montaj ortamı ekleyin. Lamelleri, montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki organoidlerin üzerine dikkatlice monte edin. Slaytları 4 °C'de tutun ve görüntüleme işlemine kadar ışıktan koruyun.
  2. Elektron mikroskobu yapın.
    1. Organoidleri Karnovsky çözeltisi (0,1 M sodyum fosfat tamponunda [Sorensen tamponu], pH 7.4, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak gece boyunca 4 ° C'de Karnovsky çözeltisi (% 2,5 tamponlu glutaraldehit +% 2 paraformaldehit) kullanarak sabitleyin.
    2. Organoidleri 0.1 M Sorenson tamponu + 0.1 M sükroz (1: 1) ile 15 dakika (üç kez) yıkayın. Ardından, organoidleri %2 sodyum fosfat tamponlu osmiyum tetroksit içinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 90 dakika boyunca sabitleyin.
    3. Organoidleri %2 ılık agarın içine gömün. Bir neşter kullanarak organoidlerin etrafındaki fazla agarı kesin. Organoidleri Sorensen'in tamponunda 15 dakika (üç kez) yıkayın.
    4. 15 dakika (iki kez)% 50 aseton kullanarak kurutun.
    5. 4 °C'de %70 aseton + %1 fosfotungstik asit + %0,5 uranil asetat ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak gece boyunca kontrast oluşturun.
    6. Ertesi gün, organoidleri bir aseton serisi (%80 aseton, %90 aseton, %96 aseton ve %100 aseton) kullanarak 15 dakika (iki kez) kurutun.
    7. Propilen oksit kullanarak organoidleri 10 dakika (iki kez) temizleyin ve ardından organoidleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir epon:propilen oksit ( Malzeme Tablosuna bakınız) karışımına koyun.
    8. Organoidlere yeni bir epon çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    9. Ertesi gün, temel kalıba yeni bir taze epon çözeltisi koyun ve ardından organoidleri gömün. Polimerizasyon için 65 ° C'de 48 saat inkübatöre koyun.
    10. Organoid epon bloklarını 50-100 nm kesit kalınlığına ayarlanmış bir ultramikrotom ile kesin. Bölümleri formvar kaplı ızgaralara koyun.
  3. CYP3A4 enzim aktivitesini ölçün.
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek piyasada bulunan bir kit ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak CYP aktivitesini ölçün.
      NOT: CYP enzimleri, substratı saptanabilir bir ara ürünedönüştürür 11,12,13. CYP enzim aktivitesini ölçmek için iki seçenek (hücre litik ve litik olmayan) vardır. Kit, bileşik tedaviden sonra bazal CYP aktivitelerini ve indüklenen CYP aktivitelerini analiz etmek için bir uygulama sağlar.
    2. Denemeyi üç nüsha halinde çalıştırın. Lüminesansı bir luminometre ile okuyun ve sinyali hesaplayın. Normalleştirmek için organoidleri tripsinize edin ve hücre sayısını sayın.
  4. İnsan albümin ölçümü yapın.
    1. ELISA testinden 24 saat önce hücre kültürü ortamını taze bir ortamla değiştirin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücre kültürü ortamını (300-500 μL) toplayın ve hücre kalıntılarını ve partiküllerini çıkarmak için 500 x g'da (4 ° C'de) 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı ayırın ve numuneleri -80 ° C'de (3 aya kadar) saklayın.
    2. Standardı ve örneği çift olarak çalıştırın. Olgunlaşmış organoidler albümini kültür ortamına salgılar; bu albümini bir ELISA miktar tayin kiti ile ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız). Çözelti ilavesini durdurduktan sonra 30 dakika içinde 450 nm'de bir ELISA plaka okuyucu ile absorbansı ölçün. Organoidleri tripsinize edin ve normalleştirilecek hücre sayısını sayın.
  5. Amonyak eliminasyon testini gerçekleştirin.
    1. Üreticinin talimatlarına göre amonyak eliminasyon testini gerçekleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın). Kısaca, kültür ortamına 1.5 mMNH4Cl ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
    2. İnkübasyondan sonra, bir amonyak tahlil kiti ile amonyak konsantrasyonunu belirleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Çok modlu bir çoklu plaka okuyucu kullanarak ölçümleri hesaplayın ve değerleri hücre numaralarına göre normalleştirin.
  6. Kolilglisilaminido-floresein (CLF) testini gerçekleştirin.
    1. Kısaca, organoidleri 10 μmol / L CLF ile muamele edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, organoidleri 1x PBS ile yıkayın. Floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme yapın.
  7. Gen ekspresyon analizi yapın.
    1. eHEPO'lardan toplam RNA'yı izole etmek için RNeasy kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) talimatlarını izleyin.
    2. Üreticinin talimatlarını izleyerek, piyasada bulunan bir ana karışım kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın) PCR reaksiyonunu ayarlayın. Her bir primer seti için PCR karışımını hazırladıktan sonra, her numuneden 10 μL'yi 96 oyuklu qPCR plakalarına yerleştirin (Tablo 1).
    3. Plakaları yapışkan sızdırmazlık maddesi ile kapatın ve ardından plakaları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Plakaları bir PCR makinesine yükleyin. Göreceli gen ekspresyonunu bir dahili kontrole normalleştirin (RPL41, Tablo 1) ve 2−ΔΔCt yöntemini 14 kullanarak analiz edin.

6. eHEPO'ların dondurularak saklanması

  1. Kriyovialleri nitrojene dayanıklı bir işaretleyici ile etiketleyin. Dondurma kabının izopropanol seviyesini kontrol edin ve deneye başlamadan önce 15-30 dakika boyunca 4 ° C'de tutun.
  2. Bir 50 μL BMM damlacığını bir kriyoviyalde dondurun. Adım 4.3'te açıklandığı gibi organoid mekanik ayrışma ile devam edin. Ayrışmadan sonra, hücre agregasını 500 μL soğuk dondurma ortamında yeniden süspanse edin, ardından süspansiyonu nazikçe kriyoviyallere aktarın ve bunları dondurma kabında tutun.
  3. Hücre dondurma kabını −80 °C'ye aktarın ve 24 saat sonra kriyoviyalleri uzun süreli saklama için sıvı nitrojene aktarın.

7. eHEPO'ların çözülmesi

  1. Bir su banyosunu ve Ad-DMEM/F12'yi 37 °C'ye önceden ısıtın.
  2. Kriyojenik eldivenler kullanarak sıvı nitrojen deposundan bir eHEPO şişesini çıkarın. Buz kristalleri eriyene kadar şişeyi 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı aspire edin ve bölüm 4'te açıklandığı gibi eHEPO'ları tohumlamaya devam edin. BMM damlacığını 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş genleşme ortamı ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Ortamı her 3 günde bir yenileyin ve 3 gün sonra ROCK inhibitörünü çıkarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk olarak, insan fibroblast hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) hücreleri kültürlendi ve epizomal yeniden programlama yoluyla iPSC'lere dönüştürüldü. Taze nakavt serumu, sağlıklı iPSC'ler elde etmek için gerekliydi. Daha sonra, iPSC'ler% 50 -% 60 birleşme ile BMM kaplı kültür plakalarına ekildi. Küçük/orta büyüklükte iPSC kolonilerine sahip olmak, farklılaşma verimliliğini artırdı. Daha sonra, iPSC'ler 5 gün boyunca Activin A, Wnt3a ve R-spo1 faktörlerini içeren besiyeri ile kesin endoderm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, iPSC'lerden başlayarak hepatik organoidlerin üretilmesi, genişletilmesi ve dondurulması/çözülmesi için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, iPSC'lerin besleyici ve besleyici içermeyen kültürde kültürlenmesi, 2 boyutlu endoderm farklılaşması, progenitör hücrelerin FACS ve organoid oluşumu ile zenginleştirilmesi ve fonksiyon kazandıran organoidlerin üretilmesi dahil olmak üzere tüm adımları kapsar. Ayrıca, organoidlerin doğrulanması ve karakterize edilmesi içi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok. Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur. Esra Erdal, ORGANO-ID Biyoteknoloji şirketinin kurucu ortağıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) tarafından SBAG-115S465 ve SBAG-213S182 projeleri ile desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL konik santrifüj tüpleriCorning430052
37 &derece; C su banyosuNü ve210.NB9
37 &derece; C, %5 CO2 inkübatörMemmertINCO 153
50 mL konik santrifüj tüpleriCorning430290
70 &mikro; m ve 40 &mikro; m Hücre süzgeciDoğan352350/ 352340
%70 EtanolSigma1009832511
A1ATAbcamAB166610Seyreltme: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitör)Tocris Biosciene2939
Asetonİzolatör9,01,026
Yapışkanlı Mikroskop LamıHistobondC981040
Gelişmiş DMEM-F12Gibco12634-010
AFPAbcamAB3980Seyreltme: 1/25 (IHC)
AgarEMS10200
ALBAbcamab10241Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Un 488 (Fare)DavetliA11001 SerisiSeyreltme: 1/1000 (IF)
Alexa Un 488 (Tavşan)DavetliA110034Seyreltme: 1/1000 (IF)
Alexa Un 594 (Fare)DavetliA11005 SerisiSeyreltme: 1/1000 (IF)
Alexa un 594 (Tavşan) DavetliA11037 SerisiSeyreltme: 1/1000 (IF)
Amonyak Test KitiSigma-AldrichMAK-310 Serisi
Amonyum klorürSanta CruzSC-202936 (İngilizce)
B27 Takviye Edici Gıdası 50xGibco12587010
Temel kalıpSakura4216
b-FGFPeprotech100-18B
Biyogüvenlik, SINIF II, GÜVENLİK KABİNİTermoGÜVENLİ 2020
Kalibre edilmiş pipetlerGilson'ınF167380
MerkezkaçEppendorf Belediyesi5702
Kolilglisilamidido-floreseinCorning451041
Sitrat Tamponu pH 6.0Biyo-optik15-M103
CK-18Santa CruzSC-51582Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19 SerisiSanta CruzSC-6278Seyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Konfokal MikroskopZeissLSM880 Serisi
Kriyojenik kullanım eldivenleri ve göz korumasıCryokit5274
KriyostatLeicaCM 1950
Kriyoviyal tüplerCorning430659
DABRoche11718096001
DAPTSigma-AldrichA5942 Serisi
DeksametazonSigma-AldrichD4902
Dispase Kök Hücre Teknolojileri7923
DMEM F12Gibco31330038
E-CADSanta CruzSC-8426 SerisiSeyreltme: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTADavetli15575-020
Elektron MikroskobuZeissSigma500 Serisi
ELISA kitiFortis yaşam bilimleri etilE88-129
Embed 812 Gömme KitiEMS14121
EntellanMerck107961
Eozin Y %1Sigma-AldrichHT110332
EpCAMMiltenyi Biotec130-059-901Seyreltme: 1/11 (FACS)
EtanolMerck1,00,98,32,511
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco26010066
Forskolin (FSK)Tocris Biosciene1099
Dondurucu konteyner (Mr. Frosty)Termo5100-0001
Dondurucu OrtamGibco12648010
Cam Pastör pipetiİzolatör084.01.001
Glutamax 100xGibco35050-068
Gluteraldehit %25, EM sınıfıEMS16210-1L
Keçi Anti-Fare HRPTermo Balıkçı62-6520Seyreltme: 1/1000 (IHC)
Keçi Anti-Tavşan HRPTermo Balıkçı31460Seyreltme: 1/1000 (IHC)
Keçi SerumuGibco162-10-072
H2O2Merck107209
HematoksilenKırlangıçHX86017674
HEPES, 1 MGibco15630-056
HNF-4&alfa;AbcamAB55223Seyreltme: 1/50 (IHC)
Buz ve kuru buzEv yapımıEv yapımı
İnkübatör (65 &derece; C)Nü veEN 400 Standardı
İzopropanolSigma-Aldrich24137
Leu15 Gastrin I insanSigma-AldrichG9145 Serisi
LuminometreBerthold TeknolojisiLB 960 Serisi
Ana karışım Uygulamalı Biyosistemler43676659
Matrigel matrisi, hESC OnaylıCorning354277
Matrigel matrisi, fenol-kırmızı-içermezCorning356231
MetanolMerck179337
Mikrosantrifüj tüpleriAxygen321-02-501
MikroskopZeissAKSİYO VERT A1
Mikrotom bıçağıTüyS35, C35
mTeSR1Kök Hücre TeknolojileriSC-05850
Çok kuyulu süspansiyon kültür plakalarıSarstedt83,39,21,500
N2 takviyesi 100xGibco17502048
N-AsetilsisteinSigma-AldrichA9165 Serisi
Nötr Tamponlu Formalin %10TekkimTK.60161.05001
NikotinamidSigma-AldrichN0636 Serisi
Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA)Gibco11140050
EKİMDoku-Tek4583
Osmiyum tetroksitEMS19110
P450-Glo Testleri kit PromegaV9001 Serisi
Pap-kalemSigmaZ377821-1EA
ParafinTekkimTK.200661.01002
PAS leke kitiAbcamAB150680
PBSLonzabe17-516
Penisilin/StreptomisinGibco15630-056
Fosfotungustik asitTed Pella19402
Pipet yardımıAxygenMotopet-1
Plaka okuyucu varioskan flaş Termo5250040
Antifade Mountant'ı UzatDavetliP36980
Propilen Oksit, EM sınıfıEMS20401
Gerçek Zamanlı PCR sistemiUygulamalı Biyosistemler7500 Hızlı 
Rekombinant insan Aktivin AR& D338-AC-050
Rekombinant insan BMP7Peprotech120-03
Rekombinant insan EGF'siPeprotechAF-100-15
Rekombinant insan FGF10Peprotech100-26
Rekombinant insan FGF19Peprotech100-32
Rekombinant insan HGF'siPeprotech100-39
Rho kinaz inhibitörü, Y-27632 dihidroklorürSigma-AldrichY0503
RNase/DNase içermeyen 1,5 mL tüpAxygen31108101
RNase/DNase içermeyen filtre uçlarıSarstedt703031255
Döner MikrotomLeicaRM 2245
RPMI 1640 OrtaGibco61870010
Rspo1 koşullu ortamEv yapımı
Asıl slaytBiyo-optik15-MEQ001
Sorenson' s Fosfat TamponuEMS11600-10
SpinnerTermoBENIM DÖNÜŞÜM 6
Steril serolojik pipetlerDoğan357543
Doku KasetiLeica3802240
Düzelt -iciLeicaEM TRIM2
Triton X-100Termo Bilimsel28314
TrypLE Ekspres EnzimiGibco12605010
Tripsin-EDTAGibco25200-056
UltramikrotomLeicaEM UC7
UranilasetatEMS22400
GirdapTermo88880018
Wnt Vekil-Fc Füzyon ProteiniİmmünoHassasN001
KsilenSigma 16446
ZO-1Davetli40-2200Seyreltme: 1/400 (IF)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endodermal OrganoidlerPluripotent K k H crelerOrganoid TeknolojisiHastal k ModellemeHepatosit DiferansiyasyonuFACS Zenginle tirmesiEpCAM Pozitif H crelerAlbumin Salg sSitokrom P450 Aktivitesi

İlgili makaleler