Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

Özet

Bu protokol, birincil fare ve insan dokusundan türetilen lakrimal bez organoidlerinin nasıl kurulacağını, sürdürüleceğini, genetik olarak değiştirileceğini, farklılaştırılacağını, fonksiyonel olarak karakterize edileceğini ve nakledileceğini açıklar.

Özet

Lakrimal bez oküler yüzey homeostazı için gerekli bir organdır. Gözyaşı filminin sulu kısmını üreterek gözü kuruma stresinden ve dış hakaretlerden korur. Yeterli in vitro modellerin bulunmaması nedeniyle lakrimal bez (pato) fizyolojisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Organoid teknolojisi, birden fazla organ için yararlı bir deneysel platform olarak kendini kanıtlamıştır. Burada, lakrimal bez biyopsilerinden başlayarak fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini oluşturmak ve sürdürmek için bir protokol paylaşıyoruz. Kültür koşullarını değiştirerek, lakrimal bez organoid işlevselliğini arttırıyoruz. Organoid işlevselliği, lakrimal bez organoidlerinin lümenlerinde gözyaşı salınımını tetiklemek için seçilen nörotransmitterlere maruz bırakılmasını içeren bir "ağlama" testi ile araştırılabilir. Bu fenomenin nasıl görüntüleneceğini ve ölçüleceğini açıklıyoruz. Lakrimal bez homeostazında ilgilenilen genlerin rolünü araştırmak için, bunlar genetik olarak değiştirilebilir. Kılavuz RNA tasarımından organoid klon genotiplemesine kadar baz editörleri kullanarak lakrimal bez organoidlerinin genetik olarak nasıl değiştirileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Son olarak, fareye ortotopik implantasyon ile insan lakrimal bezi organoidlerinin rejeneratif potansiyelinin nasıl araştırılacağını gösteriyoruz. Birlikte, bu kapsamlı araç seti, lakrimal bez (pato) fizyolojisini incelemek için fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini kullanmak için kaynaklar sağlar.

Giriş

Lakrimal bez, gözyaşı filmi^1'in sulu tabakasının çoğunun üretilmesinden sorumlu glandüler epiteldir. Gözyaşı filminin sulu tabakası sadece oküler yüzeyi yağlamak için su içermez, aynı zamanda oküler yüzeyi enfeksiyonlardan koruyan geniş bir antimikrobiyal bileşen repertuarı^{içerir 2}. Lakrimal bez hasar gördüğünde veya iltihaplandığında, kuru göz hastalığı oluşur, bu da hastalar için rahatsızlığa neden olur ve sonunda görme kaybına yol açabilir³. Yıllar geçtikçe, lakrimal bezi, özellikle de insan bezini incelemek için model sistemler ^4,5,6 ile sınırlandırılmıştır. Bu, fizyolojik ve patolojik koşullar altında lakrimal bez fonksiyonu ile ilgili bilgi boşluğuna katkıda bulunmuştur.

Son zamanlarda, bir tabaktaki lakrimal bezi incelemek için in vitro modeller geliştirilmiştir ^7,8,9. Bu lakrimal bez organoidleri, in vitro⁷ rejeneratif kapasitelerini sürdüren bir büyüme faktörleri kokteyli ile desteklenmiş, hücre dışı bir matrikste üç boyutlu yapılar olarak yetiştirilen yetişkin kök hücrelerden türetilir. Yetişkin kök hücre (ASC) kaynaklı organoidlerin avantajı, sağlıklı doku özelliklerini özetlerken çok uzun süre korunabilmeleridir. Bu tip organoid, örneğin stromal hücreler de içerebilen indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı organoidlerin aksine, yalnızca epitel hücrelerinden oluşur. Pluripotent kök hücre (PSC) türevi organoidlerin aksine, ASC organoidleri doğrudan yetişkin dokudan kurulur ve genişletilmesi için herhangi bir genetik modifikasyon gerektirmez. ASC organoidleri yetişkin özelliklerini ifade eder¹⁰.

Bu protokol, fare ve insan birincil dokusundan lakrimal bez organoidlerini türetmek için bir araç kutusu içerir. Protokol, basit büyüme faktörü çekilmesi ile organoidlerin işlevselliğinin nasıl daha da artırılacağını ve bir şişme testi yaparak organoidlerin gözyaşı sıvısı salgılaması için nasıl kışkırtılacağını açıklar. Bu protokol ayrıca, CRISPR türevi baz editörlerini kullanarak fare organoidlerini genetik olarak mühendislik yapmak için elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon yöntemi içerir. Geleneksel Cas9'dan farklı olarak, baz editörlerinin kullanımı, çift sarmallı bir kırılma^11,12 üretmeden genomdaki tek bazların modifikasyonuna izin verir. Son olarak, insan lakrimal bezi organoidlerinin immün yetmezlikli farelere ortotopik transplantasyonu ve ardından engraftmanın histolojik değerlendirmesi anlatılmaktadır. Bu lakrimal bez organoid araç kiti, lakrimal bez rejenerasyonu ve fonksiyonu ile ilgili araştırmalarda ve genetik ve enflamatuar hastalık modellemesinde kullanılabilir.

Protokol

Fare deneyleri, Hollanda Kraliyet Sanat ve Bilim Akademisi (KNAW) Hayvan Etik Komitesi tarafından AVD8010020151 proje lisansı altında onaylandı. Organoidler fare fazlası materyalden türetilmiştir. İnsan lakrimal bez biyopsileri, 18-740 protokol numarası altında tıbbi etik kurul tarafından onaylandıktan sonra Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi'nde (UMCU) ameliyat edilen hastaların atık materyallerinden toplandı. Protokol, Şekil 1'de özetlenen birkaç bölüm içerir.

Şekil 1: Protokole genel bakış. Bu şekil, protokolün farklı adımlarını vurgulamaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Tüm ortam ve tampon bileşimleri Ek Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. Fare ve insan lakrimal bezlerinden organoidlerin kurulması

1. Fare lakrimal bezinin diseke edilmesi
   1. Makas, forseps ve diseksiyon pedleri dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini hazırlayın. Bir fareyi O₂ / CO₂ inhalasyon¹³ ile ötenazi yapın.
   2. Ötanazi fareyi diseksiyon pedindeki karnına yerleştirin ve uzuvlarını sabitleyin. Fare kulakları arasında ve alnında bulunan saçları% 70 etanol kullanarak ıslatın.
   3. Diseksiyon makası kullanarak, kulaklar arasında kafatasının arkasında bir açıklık açın. Bu açıklığı alnın üzerinden buruna kadar uzatın. Hala makas kullanarak, iki kanat oluşturmak için cildi kulakların arkasından kesin.
   4. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, lakrimal bezler açığa çıkana kadar flepleri buruna doğru sıkıca çekin. Kanatları diseksiyon pedine sabitleyin. Makas kullanarak, lakrimal bezi tamamen açığa çıkarmak için lakrimal bezin üzerinde bulunan zarda küçük bir kesi yapın.
   5. Forsepsleri kullanarak lakrimal bezi çekin. Ana lakrimal kanal yırtılana kadar biraz direnç gösterilmelidir. İsterseniz, ana lakrimal kanalı doğrudan makasla kesin.
   6. Fare lakrimal bezini daha sonraki işlemlere kadar doku kültürü sınıfı PBS'ye yerleştirin. Hücre ölümünü sınırlamak için lakrimal bezi 2-4 saat içinde işlemeye devam edin. Bu daha uzun sürerse, fare lakrimal bezini biyopsi toplama ortamına yerleştirin (Ek Tablo 1).
      NOT: Çok sayıda organoide hemen ihtiyaç duyulursa birkaç lakrimal bez havuzlanabilir.
2. İnsan lakrimal bezi biyopsilerinin toplanması
   1. Ameliyattan önce, 50 mL'lik bir tüpte 20 mL alikot biyopsi toplama ortamı (Ek Tablo 1) hazırlayın ve bunu ameliyattan önce cerraha verin. Bu ortam birkaç ay boyunca 4 ° C'de tutulabilir.
   2. Ameliyat gününde, cerrahın lakrimal bezin bir parçasını (genellikle <1 mm³) örneklemesine ve 4 ° C'de biyopsi toplama ortamında (Ek Tablo 1) saklamasına izin verin.
   3. En kısa sürede işlemek için biyopsiyi toplayın. İdeal olarak, bu biyopsi örneklemesinden sonraki 2 saat içinde aynı gün olmalıdır.
3. Organoid türetme
   1. Aşağıdakileri önceden hazırlayın: çözülmüş hücre dışı matris (ECM), oda sıcaklığı (RT) fare veya insan genleşme ortamı (Ek Tablo 1), çözülmüş kollajenaz, taban ortamı (Ek Tablo 1), iki neşter, bir adet 10 cm'lik Petri kabı, 15 mL'lik bir tüpe takılı 70 μm'lik bir süzgeç ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de önceden ısıtılmış 12 kuyucuklu süspansiyon plakaları.
   2. Ek Tablo 1'de gösterilen tüm bileşenleri birleştirerek sindirim ortamını hazırlayın. Doku parçalarının yapışmasını önlemek için neşterleri bu ortamda önceden ıslatın.
   3. Fare veya insan lakrimal bez dokusunu ortamdan alın ve Petri kabına yerleştirin.
   4. Önceden ıslatılmış neşterleri kullanarak dokuyu kıyın. Doku parçaları çok küçük olduğunda (yani, <0,5 mm³), neşterle Petri kabından kazıyarak sindirim ortamına yerleştirin. İnsan biyopsisi zaten çok küçükse, doku kaybını önlemek için kıyma yapmadan doğrudan sindirim ortamına yerleştirin.
   5. Doku parçalarını 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakikaya kadar inkübe edin. Parçaları yeniden askıya almak için 15 mL'lik tüpü düzenli olarak ters çevirin. Dokuyu aşırı sindirmemek için hücre ayrışmasını tezgah üstü mikroskop altında izleyin.
   6. Bu arada, bir Pasteur pipetini, dönerken ucunu bir aleve yerleştirerek daraltın ve taban ortamında önceden ıslatın. Dokuyu verimli bir şekilde ayrıştırmak için, deliğin kalan en büyük doku parçalarından biraz daha küçük olduğundan emin olun. Ayrışma işlemini kolaylaştırmak için, karışımı her 5 dakikada bir, önceden ıslatılmış daraltılmış Pasteur pipet ile yukarı ve aşağı doğru pipetin.
   7. Mikroskop altında birçok tek hücre ve küçük kümeler göründüğünde, baz ortamın 10 mL'sini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Hücreleri pelet etmek için 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
   8. Süpernatanı çıkarın ve yıkamayı tekrarlamak için pelet baz ortamın 10 mL'sinde tekrar askıya alın. ECM'nin yeterli polimerizasyonunu önleyecek büyük sindirilmemiş doku parçalarını ve kalan kollajen liflerini çıkarmak için 70 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Elüatı 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
      NOT: Kırmızı hücre peleti, normalde organoid türetmeyi engellemeyen kırmızı kan hücrelerinin varlığını gösterir. Bununla birlikte, akış sitometrisi gibi bazı uygulamalar için, kırmızı kan hücreleri lize edilmelidir. Bunun için, hücreleri 5 dakika boyunca RT'de 5 mL taze kırmızı kan hücresi lizis tamponunda inkübe edin ve hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet edin.
   9. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini tek bir fare lakrimal bezi için 100 μL soğuk ECM'de ve insan biyopsisi için 50 μL soğuk ECM'de yeniden askıya alın. Yeniden askıya alırken, kabarcıklar yapmamaya dikkat edin, çünkü bunlar ECM polimerizasyonunu ve stabilitesini de etkiler.
   10. 12 delikli bir süspansiyon plakasının kuyucuğu başına 100 μL'ye kadar hücre tohumu. Kuyuda ~ 20 μL damlacıklar yapmak için bir P200 kullanın. Damlacıklar ne kadar küçük olursa, büyüme faktörlerinin ve besin maddelerinin matris boyunca difüzyonu o kadar iyi olur.
   11. ECM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı 20-30 dakika boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre baş aşağı yerleştirin.
   12. ECM katılaştıktan sonra, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına ~1 mL RT fare veya insan genleşme ortamı ekleyin. Organoidler 300 μm'lik bir boyuta ulaşana kadar ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Bunun için, ortamı kuyuya aspire edin ve ECM damlacıklarına dokunmadan kuyunun yan tarafına yavaşça genleşme ortamı ekleyin, böylece onları bozmayın.
       NOT: Primosin (100 mg/mL; ticari stoktan 1:1.000), bakteriyel kontaminasyon meydana gelirse izolasyon üzerine eklenebilir. Bununla birlikte, organoid büyümesini de yavaşlattığı için, bir veya iki pasajdan sonra eklenmemesi veya çıkarılması tercih edilir.

2. Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin genişletilmesi

1. Fare organoidleri için ~ 7 gün ve insan organoidleri için ~ 10 gün sonra, organoidler ~ 300 μm'lik bir boyuta ulaştığında, kültür ortamını çıkarın.
2. Organoidleri içeren ECM damlacıklarını 1 mL tripsin çözeltisinde, damlacıklar parçalanana kadar bir P1.000 ile kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar askıya alın. Bu karışımı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda kısa bir süre inkübe edin.
3. 2-3 dakika sonra, organoid süspansiyonu 10x-15x yukarı ve aşağı borulamak için daraltılmış ve önceden ıslatılmış bir Pasteur pipet kullanın. Organoidlerin ayrışma durumunu bir tezgah üstü mikroskop altında kontrol edin; ~ 20 hücreden oluşan küçük kümeler elde edilmelidir. 37 °C su banyosunda daha uzun süre inkübe edin ve ayrışma tatmin edici olana kadar pipetleme adımını tekrarlayın.
   NOT: Bu adım, çok katmanlı oldukları için insan organoidleri için daha uzun sürebilir. Tek hücreler üretilecek; Bu, organoid süspansiyonun çoğu küçük kümelerden oluştuğu sürece organoid büyümesini etkilemez.
4. Baz ortamın 10 mL'sini ekleyerek ayrışmayı durdurun. Daha sonra, hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet haline getirin.
5. Organoidlerin üzerine uzanabilecek süpernatant ve ECM'yi (organoidler olmadan şeffaf, jöle benzeri tabaka) çıkardıktan sonra, adım 1.3.10'da belirtildiği gibi bir süspansiyon plakasına kaplamadan önce hücreleri uygun bir soğuk ECM hacminde yeniden askıya alın.
   NOT: Genel olarak, fare lakrimal organoidleri 1: 5 oranında ve insan organoidleri 1: 3 oranında bölünür. Bu, 100 μL ECM'de bulunan organoidlerle başlarken, bölünmeden sonra sırasıyla 500 μL ve 300 μL'de yeniden askıya alınmaları gerektiği anlamına gelir.
6. ECM'nin katılaşmasına kadar plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca baş aşağı inkübe edin ve organoidleri RT'de fare veya insan genleşme ortamı ile örtün.

3. Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerini koruyan kriyopreservasyon

1. Organoidleri kriyoproteksiyona tabi tutmak için, önce genleşme ortamındaki organoidleri bölüm 2'de verilen talimatlara göre bölün.
2. Yaklaşık 3-4 gün sonra, organoidler büyüme aşamasındayken, ortamı çıkarın ve 10 mL soğuk baz ortamında organoidler içeren ECM'nin 100 μL'sini yeniden askıya alın. ECM'nin ayrışmasına yardımcı olmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu işlemi kolaylaştırmak için tüpü düzenli olarak çevirin.
3. Organoidleri 5 dakika boyunca 500 x g'de peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve organoid peleti 1 mL kriyoprezervasyon ortamında yeniden askıya alın (artık ECM kriyoprezervasyonu bozmaz). Organoid süspansiyonu bir kriyoviyal ve hemen -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın.
   NOT: Malzeme Tablosunda açıklanan kriyoprezervasyon ortamını kullanırken, kriyovyaller süresiz olarak -80 ° C'lik bir dondurucuda tutulabilir. Başka bir kriyoprezervasyon ortamı kullanılıyorsa, optimum korumayı sağlamak için kriyoviyal 24 saat sonra bir sıvı azot tankına aktarın.
4. Organoidleri çözmek için, kriyoviyal dondurucudan alın ve kuru buz üzerinde 37 ° C'lik bir su banyosuna taşıyın. İçeriğinin çoğu çözülene kadar kriyoviyal suda tutun. İçeriği 10 mL baz ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de döndürün.
5. Organoidleri, adım 2.5 ve adım 2.6'da açıklandığı gibi, genleşme ortamı ile 100 μL ECM'de kaplayın.

4. Lakrimal bez organoidlerinin ayırt edilmesi ve işlevselliğinin değerlendirilmesi

1. Organoid farklılaşma
   1. Lakrimal bez organoidlerini ayırt etmek için, önce genleşme ortamındaki organoidleri bölüm 2'deki talimatlara göre bölün.
   2. 2 gün sonra, genişletme ortamını adım 1.3.12'de açıklandığı gibi fare veya insan farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Fare organoidlerini bu ortamda 5 gün ve insan organoidlerini 9 gün boyunca korumak için ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
   3. Diferansiyasyon ortamında 5 gün veya 9 gün sonra organoid farklılaşmasını değerlendirmek için, RNA'yı çıkarmak için organoidler içeren 100 μL ECM toplayın. Bunu yapmak için, ECM damlacıklarını bir P1.000 kullanarak kuyuda bulunan 1 mL ortamdaki yeniden askıya alın ve organoid süspansiyonu 3 mL buz gibi soğuk baz ortamına aktarın. Organoidleri 5 dakika boyunca 500 x g'de peletleyin.
   4. Süpernatanı atın ve peleti RNA ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın. Aşağı akış RNA ekstraksiyonunu, RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre gerçekleştirin. Örneğin, elde edilen RNA'yı, kök hücrelerin (TP63, KRT5, KRT14) ve farklılaşmış hücre belirteçlerinin (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) ekspresyonunun RT-qPCR analizi için kullanın. ¹⁴.
      NOT: İlgili ekspresyon analizini elde etmek için, seçilen belirteçlerin ekspresyonunu bir veya birkaç doku örneğinde ölçün. Farklılaşma koşulları altında kültürlenen organoidler daha az RNA içerme eğilimindedir.
2. Fonksiyonel şişlik testi
   NOT: Protokolün bu kısmı için, en az 7 gün boyunca farklılaşmış insan lakrimal bezi organoidlerini kullanın. Fonksiyonel yırtılma için yeterli belirteç ekspresyonunu sağlamak için gereken minimum süre 7 gündür. 12 delikli bir plakanın her bir kuyusu bir koşul oluşturur. Minimum koşul sayısı üçtür: pozitif kontrol, negatif kontrol ve test koşulu.
   1. Taze olarak, lakrimal bez organoidleri tarafından salgılanmayı indükleyen bireysel bileşenler içeren 1 mL insan farklılaşma ortamı hazırlayın. Örneğin, 100 μM noradrenalin ve 1 μM forskolin ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Forskolin, genellikle maksimum şişmeye neden olan pozitif bir kontrol görevi görür.
   2. Otomatik bir parlak alan hızlandırılmış mikroskopta, plakada görüntülenecek konumları, zaman aralığını (5 dakika) ve süreyi (4 saat) ayarlayın. ECM damlacığının tamamının her konumda görünür olduğundan emin olun.
   3. Görüntülemeye başlamadan hemen önce ve plakayı mikroskoptan hareket ettirmeden, kültür ortamını görüntülenecek kuyucuklardan çıkarın ve adım 4.2.1'de hazırlanan iyi askıya alınmış ortamla değiştirin. Negatif bir kontrol olarak, yalnızca farklılaşma ortamı ile değiştirilen farklılaşma ortamına sahip bir kuyuyu dahil edin, çünkü orta tazeleme bazı organoid şişmeyi tetikleyebilir.
   4. 4 saate kadar sonra, şişme testi biter. Sonuçları analiz edin.
      NOT: Bu adımlar, otomatik parlak alan hızlandırılmış görüntülemeye izin veren bir EVOS M7000 mikroskobu ile gerçekleştirilir. Bu mikroskop için, hızlandırılmış görüntülemeyi ayarlamak üzere ayrıntılı üreticinin el kitabına bakın. Not olarak, benzer özelliklere sahip başka herhangi bir mikroskop kullanılabilir.
   5. Organoid şişmesini ölçmek için, her bir organoidin çapını 0 saat ve 4 saatte ölçün. Tek bir organoid damlacığın görüntülerini ImageJ'de 0 saat ve 4 saatte açın.
   6. Araç çubuğundaki Düz çizgi simgesine tıklayın ve önce bir organoidin çapını 0 saatte çizin. Ardından, bu çizginin uzunluğunu ve dolayısıyla şişmeden önceki organoid çapı ölçmek için ImageJ'deki (Analiz > Ölç) Ölçüm aracını kullanın. Şişlikten sonra organoid çapını elde etmek için işlemi aynı organoid üzerinde 4 saatte tekrarlayın.
   7. Şişme tahlilinden önce ve sonra durum başına ~ 20 organoidin organoid çapını ölçün.

5. Pax6'yı nakavt etmek için bir plazmid inşa etmek

1. nakavt etmek için gRNA tasarımı Pax6 C > T tabanlı editörleri kullanma
   NOT: gRNA tasarımı için birçok yazılım programı mevcuttur. Burada, entegre gRNA tasarımına, ek açıklamaya ve Sanger izlerinin hizalanmasına izin verdiği için Benchling kullanılmıştır. Bu nedenle, sonraki tüm adımlar alternatif yazılım programları kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
   1. Yeni (+) > DNA Dizisi > DNA Dizilerini İçe Aktar'a tıklayarak hedef geni Benchling'de görselleştirerek gRNA tasarım sürecine başlayın.
   2. Veritabanından İçe Aktar sekmesinde, ilgilendiğiniz geni (Pax6) yazın ve Ara'ya basın.
   3. Fare referans genomu GRCm38'in (mm10, Mus musculus) en yeni yapısını seçin ve İçe Aktar'a basın.
   4. Aşağıdaki kurallara bağlı kalarak nakavt gRNA'nın tasarlanabileceği ekzonu seçin:
      1. İlk kodlama ekzonuna bir gRNA koymaktan kaçının, çünkü sonraki ekzonlardaki alternatif başlangıç bölgeleri, hücre tarafından erken indüklenen durdurma kodonunu atlatmak için kullanılabilir.
      2. Pax6 mRNA'nın eklenmesiyle oluşabilecek tüm alternatif transkriptlerde bulunan ekzonlardaki gRNA'ları tasarlayın. Bunu sağlamak için, Ensembl genom tarayıcısında Pax6'yı görselleştirin ve tüm transkriptlerde kullanılan ekzonu seçin.
      3. Alternatif eklemeyi daha da atlatmak için, tamamlanmamış bir kodona sahip bir ekzonu hedefleyin (üçlünün kalan bir veya iki tabanı). Bu daha az önemlidir, ancak indüklenmiş indellerin etkileri hakkında daha fazla kesinlik sağlar. Pax6 için, ekzon 4 ila ekzon 11 iyi bir hedeftir. Ek olarak, triptofan (W), glutamin (Q) veya arginin (R) kalıntıları içeren bir ekzon seçin.
         NOT: SpCas9 kullanan standart C > T baz editörleri, gRNA'nın başlangıcından itibaren nükleotid 4'ten nükleotid 8'e kadar uzanan bir düzenleme penceresine sahiptir (PAM'dan en uzakta). C > T baz editörleri, ters iplikçikte bir gRNA bulunan tüm triptofan (W) kalıntılarına (TGG'den TGA'ya, TAG veya TAA'ya), glutamin (Q) kalıntılarına (CAG'den TAG'a veya CAA'dan TAA'ya) ve son olarak, ileri iplikçikteki arginin (R) kalıntılarına (CGA'dan TGA'ya) durdurma kodonları uygulayabilir.
   5. Ekzon + 20 taban yukarı ve aşağı akış seçin. Hedef işareti CRISPR'de ekranın sağ tarafına tıklayın ve Tasarım ve Analiz kılavuzlarına tıklayın.
   6. Yeni açılan menüde, Tasarım Türü sekmesi altında, " temel düzenleme" için Kılavuzları işaretleyin (Komor ve ark., 2016). Kılavuz Uzunluğu'nu 20 nükleotidde tutun ve Fare için Genom altında GRCm38 (mm10, Mus musculus) öğesini seçin.
   7. Yeşil + işaretine tıkladıktan sonra, yazılım programı tüm protospacer bitişik motif (PAM) dizilerini otomatik olarak algılar ve ekranın sağ tarafında, ilgilenilen ekzonun etrafındaki alandaki tüm potansiyel gRNA'ların bir listesini oluşturur.
   8. Kırmızı bir kutudaki durdurma kodonu işaretine (*) kadar listede ilerleyin; bu, potansiyel olarak bir amino asidi bir durdurma kodonuna dönüştürebilecek ve böylece bir nakavtla sonuçlanabilecek bir gRNA'ya işaret eder.
   9. gRNA dizisinin sağındaki ilk sütunda, düzenleme penceresinin etrafındaki her hedef "C" için, in silico öngörülen düzenleme verimlilikleri hesaplanır. Durdurma kodonu ile sonuçlanan C > T düzenlemesinin en az ~ 10 düzenleme verimliliğine sahip olduğundan emin olun.
   10. gRNA'nın hangi hedef dışı lokuslara bağlanabileceğini kontrol etmek için Hedef Dışı sütunundaki değere tıklayın. Özgüllüğü artırmak için herhangi bir ek gene bağlanan bir gRNA seçmekten kaçının. Örneğin, Pax6'yı bir C > T baz editörü ile düzenlemek için iyi bir gRNA, ekzon 7'yi hedefler ve 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3' dür.
   11. Ekranın sağ üst köşesindeki Ek Açıklamalar simgesine ve ardından Yeni Ek Açıklama'ya tıklayarak Benchling dosyasında bir ek açıklama oluşturun. Ek açıklamayı adlandırın ve Strand açılır menüsünde doğru gRNA yönünün seçildiğinden emin olun.
2. gRNA plazmid üretimi
   NOT: Organoidlere gRNA iletimi için çeşitli vektörler mevcuttur. Aşağıdaki plazmid, gRNA yapımı için bir baz olarak kullanılmıştır: pFYF1320 (Addgene #47511, Keith Joung'dan bir tür hediye).
   1. pFYF1320'deki gRNA'ları klonlamak için, standart ileri astarı kullanarak ters bir PCR stratejisi uygulayın: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Ters astarı tasarlamak için, gRNA ara parça dizisinin ters tamamlayıcısını aşağıdaki evrensel ters astar parçasının önüne yapıştırın (gRNA oryantasyonunu [+ veya - ipliği] iki kez kontrol edin): CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. C > T taban düzenleyicisini kullanarak fare Pax6'nın ekzon 7'sini hedeflemek için ters astar aşağıdaki gibidir: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Her iki astarı da sipariş edin.
   2. 61 °C'lik bir tavlama sıcaklığında 35 döngü boyunca yüksek doğrulukta bir DNA polimeraz kullanarak şablon olarak 1 ng pFYF1320 kullanarak ters bir PCR reaksiyonu çalıştırın.
   3. PCR reaksiyonunu, 2.281 baz çiftinin (bp) beklenen parçasını görselleştirmek için TAE tamponunda 100 V'ta ~ 45 dakika boyunca% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Tercih ettiğiniz kiti kullanarak jel temizliği yapın.
   4. Aşağıdaki ligasyon reaksiyonunu ayarlayın: 100 ng temizlenmiş PCR ürünü, ilk pFYF1320 şablon DNA'sını çıkarmak için Dpn1 enzimi ve T4 ligaz. Karışımı 20 °C'de 15 dakika, 37 °C'de 30 dakika ve 80 °C'de 20 dakika inkübe edin.
   5. Reaksiyon karışımını kimyasal olarak yetkin DH5α bakterilerine dönüştürün ve bakterileri ampisilin¹⁵ içeren agar plakalarına yayın.
   6. Ertesi gün, 50 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 3 mL lizojen suyu (LB) ortamında üç ayrı koloni seçin ve genişletin.
   7. Ertesi gün, bir miniprep kiti kullanarak üç mini kültürün her birinin 1 mL'sinde bir mini hazırlık gerçekleştirin ve geri kalanını 4 ° C'de saklayın. Elde edilen plazmidi, gRNA'nın vektör^16'ya doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için U6_Forward astarı ile Sanger dizilemesine tabi tutun.
   8. Doğru plazmid ile tek bir bakteri kolonisini tanımladıktan sonra, plazmid DNA'sını bir gecede yükseltmek için ampisilin ile desteklenmiş 50 mL LB içinde karşılık gelen mini kültürün 500 μL'sini aşılayın. Bir midiprep kiti kullandıktan sonraki gün bir midi hazırlığı gerçekleştirin. Bu plazmid, bölüm 6'daki elektroporasyon için kullanılacaktır.

6. Pax6 KO klonlarının oluşturulması

1. Organoid elektroporasyon
   1. En fazla 5 gün önce bölünmüş fare organoidleri ile başlayın, böylece proliferatif bir durumda olurlar. Nakavt başına ~ 300-400 μL organoid damlacık kullanın. Herhangi bir plazmid olmadan elektroporate edilecek negatif bir kontrol seçmek için ek bir koşul ekleyin.
   2. Organoidleri ayırmak için 2.1-2.4 arasındaki adımları uygulayın, ancak organoidleri tek hücre olacak şekilde daha uzun süre ayırın. Supernatan'ı atın.
   3. Hücreleri elektroporasyon tamponunun 80 μL'sinde yeniden askıya alın.
   4. 1.5 mL'lik bir tüpte, aşağıdaki plazmidleri maksimum 20 μL için hazırlayın: 2.5 μg pFYF1320-gRNA plazmidi, 2.8 μg transpozaz içeren plazmid, 7.2 μg higromisin direnci transpozon içeren plazmid ve 7.5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      NOT: pFYF1320-gRNA plazmid, baz editörü hedef lokusa yönlendiren önceden tasarlanmış gRNA'yı kodlar. pCMV_ABEmax_P2A_GFP plazmid, baz editörünü ve elektroporasyonu takiben baz editörü ifade eden hücreleri izlemek için kullanılabilecek bir GFP muhabirini kodlar. Transpozaz içeren plazmid, higromisin direnci transpozon içeren plazmid tarafından sağlanan higromisin direnç kasetini genomun içine rastgele bir yere yapıştıran transpozazı kodlar. Bu kaseti genomlarına dahil eden hücreler higromisin'e dirençli hale gelir ve higromisin ilavesiyle pozitif olarak seçilebilir. Birkaç plazmidin birlikte birleştirilmesi çok muhtemel olduğundan, higromisin direnci, Pax6 için düzenlenmiş hücreler için zenginleştirmek için fonksiyonel bir seçim oluşturur.
   5. Plazmidleri hücrelere ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
   6. Elektroportatörü gözenekli darbe (voltaj: 175 V; darbe uzunluğu: 5 ms; darbe aralığı: 50 ms; darbe sayısı: 2; bozunma oranı: ; polarite: +) ve transfer darbesi (voltaj: 20 V; darbe uzunluğu: 50 ms; darbe aralığı: 50 ms; darbe sayısı: 5; bozunma oranı: @; polarite: +/-) için aşağıdaki parametrelerle ayarlayın.
   7. Hücreleri plazmidlerle birlikte bir elektroporasyon küvetine yerleştirin. Hemen 0.30 A ile 0.55 A arasında olması gereken direnci (Ω) ölçün ve hemen elektroporat yapın. Bu adımın hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi, hücrelerin küvetin dibine yerleşmesini önlemek ve elektroporasyon verimliliğini azaltmak için gereklidir.
   8. Hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve bir Rho-kinaz inhibitörü ile desteklenmiş 400 μL elektroporasyon tamponu ekleyin. Hücrelerin RT'de 30 dakika boyunca iyileşmesine izin verin.
   9. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de pelet yapın, süpernatanı atın ve hücreleri 200 μL ECM'de plakalayın. Katılaştıktan sonra, fare genişletme ortamını ekleyin.
   10. Kistik organoidler 2-3 gün sonra büyür. C > T baz editörünün varlığını ortaya çıkaran GFP sinyalini günlük olarak izleyin.
2. Organoid seçimi
   1. ~ 3 gün sonra, organoidler iyileştiğinde, higromisin direnç kasetini entegre eden organoidleri seçmek için fare genleşme ortamına 100 μg / mL higromisin ekleyin. Bir plazmid alan hücrelerin birkaç plazmid alma olasılığı yüksektir. Higromisine dirençli organoidler seçilerek, Pax6 lokusundaki düzenlenmiş organoidler zenginleştirilir.
   2. Negatif kontroldeki tüm hücreler öldüğünde ve hayatta kalan organoidler ~ 300 μm olduğunda, higromisin dirençli organoidleri seçin.
3. Organoid toplama ve genotipleme
   1. Mikroskobun yanında steril P20 uçları ve buz üzerinde her biri 100 μL tripsin çözeltisi içeren 1.5 mL tüpler hazırlayın.
   2. Bir P20 ucunu forseps ile bükün. Hayatta kalan organoidleri içeren plakayı tezgah üstü mikroskopta gözlemleyin. Hayatta kalan bir organoid odaktayken, plakanın kapağını çıkarın. Bükülmüş P20 ucunu kullanarak ve hala mikroskop altında, hayatta kalan her organoidi ayrı ayrı aspire edin ve bunların her birini tripsin çözeltisi içeren ayrı bir tüpe yerleştirin.
   3. En fazla 20 klon alın. Seçilecek klonların sayısı, her deneysel tasarım için gereken klon sayısına ve her gRNA ve lokusa bağlı olarak değişen düzenleme verimliliğine bağlıdır.
   4. Tüm klonlar toplandığında, 1,5 mL'lik tüpleri 5 dakikaya kadar 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Ayrışma hızını artırmak için her tüpü düzenli olarak vorteks edin ve organoidleri tezgah üstü mikroskop altında kontrol edin. Organoidler küçük kümelere ve / veya tek hücrelere ayrıldığında, 1 mL baz ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.
   5. Seçilen her klon için, ayrı bir 1.5 mL tüpte ~ 400 μL genotipe tutun. 5 dakika boyunca 500 x g'de kalan ~ 600 μL'yi döndürün, süpernatanı çıkarın, hücreleri 20 μL ECM'de yeniden askıya alın, 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda tek bir damlacık olarak plakalayın ve higromisin olmadan fare genleşme ortamı ekleyin.
   6. Klonları genotiplendirmek için, 5 dakika boyunca 500 x g'de ~ 400 μL hücre süspansiyonu içeren tüpleri döndürün, süpernatanı çıkarın ve DNA'yı çıkarmak için hücreleri 50 μL DNA ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın.
   7. Hücreleri hemen aşağıdaki gibi inkübe edin: 60 ° C'de 6 dakika, vorteks ve 95 ° C'de 4 dakika. Bu DNA, -20 ° C'de 7 güne kadar saklanabilir, ancak aşağı akış PCR'sini hemen gerçekleştirmek en uygunudur.
   8. Nükleaz ile hedeflenen lokusu yükseltmek için, önceden sipariş edilen yeterli genotipleme primerleri ve düşük doğruluklu bir polimeraz kullanarak ekstrakte edilen DNA'nın 2 μL'sinde bir PCR gerçekleştirin. Genotipleme primerleri AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) ve TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R) 'dir. Amplikon, verimli bir şekilde sıralandığından emin olmak için beklenen düzenlenmiş lokustan yaklaşık 100 bp başlamalıdır.
   9. Adım 5.2.3'te belirtildiği gibi PCR verimliliğini değerlendirmek için PCR ürününü bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Doğru boyutta bir bant tespit edildiğinde, bir kit kullanarak DNA jeli ekstraksiyonu yapmak için jelden kesin.
   10. Daha önce genotipleme primerleri ile seçilen her organoid klondan ekstrakte edilen DNA'yı dizileyin.
   11. Elde edilen dizileri Benchling'deki Pax6 geniyle hizalayın. İçe aktarılan gen dizisini adım 4.1'den açın. Sağ taraftaki Hizalamalar'a ve ardından Yeni hizalama oluştur'a tıklayın. Dizileme sağlayıcısından alınan .ab1 dosyalarını yükleyin, nükleotid türü olarak DNA'yı seçin ve İleri'ye basın.
   12. Aşağıdaki pencerede, Hizalama oluştur'a tıklamadan önce Çok Sıralı ve hizalama programı Otomatik (MAFFT) öğesini seçin.
   13. Her iki alel üzerinde homozigot prematüre durdurma kodonuna (baz editörlerle elde edildiği gibi) sahip genotipleri tanımlayın. Genişlemek için ilgili organoid klonları saklayın ve daha fazla analiz için bunları kriyoprotekte edin. İdeal olarak, potansiyel nükleaz hedef dışı etkilerini atlatmak için üç farklı organoid klonu yan yana analiz edilmelidir.

7. NSG farelerinde insan lakrimal bezi organoidlerinin ortotopik transplantasyonu

1. Organoid preparatı
   1. İnsan lakrimal bezi organoidleri, bölüm 2'de açıklandığı gibi, transplantasyon gününden ~ 3 gün önce bölünmelidir. Transplantasyon gününde, engraftman şansını artırmak için organoidlerin proliferatif fazda olduğundan emin olun.
   2. Organoidleri ECM'den çıkarmak için, 0.125 U / mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için kültür ortamına dispaz ekleyin. Bir P1.000 kullanarak, ECM damlacıklarını bozmak için iyice askıya alın ve plakayı 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre geri yerleştirin. 100 μL'lik bir ECM hacmi, ~ 10 lakrimal bezi enjekte etmek için yeterlidir.
   3. Enzimi yıkamak için organoidleri 10 mL baz ortamda tekrar askıya alın. Hücreleri 5 dakika boyunca 400 x g'de pelet yapın.
   4. Hücreleri (~ 1.500.000) % 5 ECM ile desteklenmiş 50 μL soğuk insan genleşme ortamında yeniden askıya alın. Organoid süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.
2. Farelerde ortotopik transplantasyon
   1. Hayvan tesisinde, organoid süspansiyonu ve insülin iğnelerini buz üzerinde bulundurun. Organoid süspansiyonu soğuk bir insülin iğnesinde aspire edin.
   2. Anesteziyi başlatmak için NOD scid gama (NSG) immün yetmezlikli bir fareyi %3 izofluran ile yatıştırın. Fare uyurken, ana lakrimal bezin (göz ile kulak arasında yarı yolda bulunan) erişilebilir olduğu şekilde hızlı bir şekilde yan tarafına yerleştirin.
   3. 5 μL organoid süspansiyonu doğrudan deriden lakrimal beze enjekte edin. Bir fare lakrimal bezinin içerebileceği maksimum hacim 5 μL'dir.
   4. Farenin iyileşmesine izin verin ve özellikle göz üzerinde transplantasyonla ilgili herhangi bir rahatsızlığın varlığını değerlendirmek için fareyi her gün izleyin.
3. Engraftmanı değerlendirin
   1. Kısa süreli veya uzun süreli engraftasyonun değerlendirilmesi gerekip gerekmediğine bağlı olarak 90 güne kadar O2/CO₂ inhalasyonu ile fareyi kurban edin¹³.
   2. Lakrimal bezi bölüm 1'de tarif edildiği gibi diseke edin. RT'de 24 saat boyunca% 4 formalin içinde sabitleyin.
   3. Lakrimal bezi bir kasete yerleştirin. Lakrimal bezi aşağıdaki gibi inkübe ederek dehidrate edin:% 70 etanolde 2 saat,% 96 etanolde 2 saat,% 100 etanolde (2x) 1 saat, ksilende 2 saat ve fırında 58 ° C'de sıvı parafinde bir gece.
   4. Ertesi gün, lakrimal bezi metalik bir kalıpta tercih edildiği gibi yönlendirin, sıvı parafin ile doldurun ve bloğun soğuk bir yüzeyde katılaşmasına izin verin. Bu işlem en iyi şekilde bir gömme makinesi ile gerçekleştirilir.
   5. Parafin bloğu katı olduğunda, bir mikrotom kullanarak tüm bloğu 4-5 μm kesitlere ayırın. Tüm bölümleri (kurdele şeklinde) kuru ve cereyan etmeyen bir ortamda tutun. Bölümler oda sıcaklığında süresiz olarak tutulabilir.
   6. Tüm bloğu kapsayan her 10 bölümden birini örnekleyin.
      1. Bölümleri bir slayta aşağıdaki gibi monte edin: slaytın üzerine bir damla su koyun, bölümü üstüne yerleştirin, 42 ° C'lik bir sıcak plaka üzerinde gerilmesini sağlamak için ~ 2 dakika dinlendirin ve suyu yavaşça kağıtla çıkarın.
      2. Kızakları gece boyunca 58 °C'lik bir fırında kurumaya bırakın. Slaytlar bu aşamadan sonra RT'de süresiz olarak tutulabilir.
   7. İnsan hücrelerini fare hücrelerinden ayırt etmek için, bu bölümler üzerinde insan nükleer antijen boyaması yapın. Aşağıdaki yıkamaları yaparak bölümleri yeniden sulandırın: Ksilen (2x) içinde 3 dakika,% 100 etanol (2x) içinde 1 dakika,% 96 etanol,% 90 etanol,% 80 etanol,% 70 etanol,% 60 etanol ve% 25 etanol içinde 1 dakika ve son olarak, demi suda (2x) 1 dakika.
   8. Slaytları PO tamponunda 15 dakika boyunca inkübe edin (Ek Tablo 1). Slaytları ultra saf suda 3 kat yıkayın.
   9. Otoklavda sitrat bazlı bir antijen alımı gerçekleştirin:
      1. Slaytları otoklav geçirmez bir slayt tutucuya, sitrat tamponu ile doldurulmuş bir sepete yerleştirin (Ek Tablo 1). Sepeti otoklavın içine yerleştirin ve bir otoklav döngüsü çalıştırın (basınç: 10 PSI; sıcaklık: 121 °C; süre: 15 dakika).
      2. Otoklav basınçsızlaştırıldığında, slaytları içeren sepeti alın ve slaytları RT'ye getirmek için bir RT su banyosuna yerleştirin.
         NOT: Antijen alma stratejisi kullanılan antikora bağlıdır. En uygun antijen alımını gerçekleştirmek için sağlayıcının veri sayfasına bakın.
   10. Slaytları yatay olarak, bölüm tarafı yukarı, bir inkübasyon tepsisine yerleştirin. Üstüne PBS'de %1 sığır serum albümini (BSA) içeren 500 μL bloke edici tampon ekleyin ve 1 saat boyunca inkübe edin. Engelleme arabelleğini çıkarın.
   11. Boyanacak slayt başına 500 μL bloke edici tampona 1 μL insan nükleolar antijen-antikoru ekleyerek antikor çözeltisini hazırlayın. Her slayda antikor çözeltisi ekleyin. 4 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübasyon tepsisinde gece boyunca inkübe edin.
   12. Ertesi gün, slaytları PBS'de 3 kez yıkayın. Slaytları seyreltilmemiş HRP anti-fare sekonder antikoru ile 45 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları PBS'de 3 kez yıkayın.
       DİKKAT. Kimyasal bir başlıkta, DAB tamponunu hazırlayın (Ek Tablo 1). Slaytları DAB tamponu ile 10 dakika boyunca inkübe edin. Herhangi bir atık malzemeyi organik kimyasal sıvı atık konteynerlerine atın.
   13. Slaytları suyla yıkayın. Çekirdekleri boyamak için slaytları hematoksilin içinde 2 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları akan musluk suyunda 10 dakika yıkayın.

Sonuçlar

Fare lakrimal bezinin diseksiyonunu takiben (Şekil 2A), enzimatik ve mekanik sindirim, aralarında acini ve kanalların ayırt edilebildiği küçük doku parçaları üretti (Şekil 2B). Kalan büyük doku parçaları ECM'nin dengesini bozacak ve bu da başlangıçtaki organoid büyümesini azaltacaktır. Fare lakrimal bezi organoid türevi, organoidlerin bölünmeye hazır olduğu aşama olan ~7 gün sonra ~500 μm çapında kistik organoidler bulunduğunda başarılı olmuştur (Şekil 2C). Genel organoid türevi başarılı olsa bile, bazı organoidler sonunda durmadan önce büyümeye başlayabilir. İnsan lakrimal bezi organoidleri 3-4 gün içinde kist olarak büyümüş ve doku izolasyonundan 10-14 gün sonra tam büyümüş boyuta ulaşmıştır (Şekil 2D). Hem fareler hem de insanlar için, organoid türetme bazen başarısız oldu, hiç organoid yok ya da az sayıda organoid büyüyordu; Bu genellikle dokunun aşırı sindiriminden kaynaklanıyordu. Fare lakrimal bezi organoidleri en az 40x ve insan organoidleri en az 20x geçirilebilir. Geçiş, organoid büyümeye bağlı olarak ortalama 7-10 günde bir yapıldı.

Şekil 2: Fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin oluşumu. (A) Fare lakrimal bezi diseksiyonunun farklı aşamalarının fotoğrafları. Ok, koruyucu zarının altındaki lakrimal beze işaret eder. (B) Doku sindiriminden hemen sonra fare lakrimal bezi hücrelerinin parlak alan görüntüleri, bir asinus ve bir kanal gösteren girintilerle. (C) Başarılı ve başarısız bir fare lakrimal bezi organoid türevinin parlak alan görüntüleri. (D) 14 gün boyunca insan organoid büyümesinin parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Lakrimal bez organoidleri, genişleme ortamında kültürlendiğinde büyük oranda kök hücre içerir. Farklılaşma seviyelerini artırmak için, büyüme faktörü içeriği azaltılmış bir fare ve bir insan farklılaştırma ortamı kurduk. Farklılaşma ortamında sırasıyla 5 gün ve 7 gün sonra, fare ve insan lakrimal bezi organoidleri yoğunlaşmıştır (Şekil 3A-B). Bu morfolojik değişim, artmış fonksiyonel özelliklerle korelasyon gösterdi. Siklik AMP aktivatörü forskolin veya nörotransmitter norepinefrin uygulanması, 3 saatten daha kısa bir sürede organoid şişmeye (yani apikal su sekresyonu) neden olmuştur (Şekil 3C). Şişlik 3-4 saatten uzun sürdüğünde, bu organoidlerin yeterince farklılaşmadığını ve / veya nörotransmiterler için reseptörler gibi fonksiyonel belirteçleri ifade etmediğini düşündürmektedir.

Şekil 3: İnsan organoidlerinde fare ve insan lakrimal bezi organoidlerinin farklılaşması ve fonksiyonel şişlik testi. (A) Fare lakrimal bezi organoidlerinin 7 gün boyunca genişleme ortamında ve genişleme ortamında 2 gün sonra 5 gün boyunca farklılaşma ortamında kültürlenen parlak alan görüntüleri. (B) Genleşme ortamında 11 gün boyunca ve genişleme ortamında 2 gün sonra 9 gün boyunca farklılaşma ortamında kültürlenen insan lakrimal bezi organoidlerinin parlak alan görüntüleri. (C) 3 saat boyunca taze farklılaşma ortamına (kontrol), 1 μM forskolin'e ve 100 μM norepinefrine maruz kalan farklılaşmış insan lakrimal bezi organoidlerinin parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Fare lakrimal bezi organoidlerinde Pax6'yı nakavt etmek için, seçilen Pax6 hedeflemeli gRNA'yı içeren bir plazmid PCR ve ligasyon ile üretildi (Şekil 4A). Bu gRNA içeren plazmid, tek hücrelere ayrışmış fare lakrimal bezi organoidlerinde Domuzcuk-Bac plazmidleri (higromisin direnci transpozon içeren ve transpozaz içeren plazmidler) ve C > T baz editörü Cas9 ile birlikte elektropoize edildi. 3 gün sonra, organoidler iyileştiğinde, higromisin direnç kasetini içeren klonları seçmek için higromisin'e maruz bırakıldılar. Başarılı elektroporasyonlarda, higromisine dirençli organoidler büyüdü (Şekil 4B). ~ 300 μm'den daha büyük olan büyüyen organoid klonlar, ideal olarak kendiliğinden farklılaşmaya başlamadan önce seçildi (Şekil 4C). DNA, organoidin bir kısmından çıkarılırken, geri kalanını kültürde tuttu. gRNA tarafından hedeflenen Pax6 lokusunun PCR amplifikasyonu, seçilen klonların her biri için 367 bp bandı verdi (Şekil 4D). Güçlendirilmiş lokus sıralandıktan sonra, homozijik olarak C > T düzenlenmiş klonlar (n = 1) tutuldu. Öte yandan, düzenlenmemiş (n = 4), heterozigli olarak düzenlenmiş veya yanlış düzenlenmiş (n = 1) klonlar atıldı (Şekil 4E). Genel olarak, Pax6'yı hedefleyen bu gRNA kullanılarak, sıralanan altı kişiden bir homozigot nakavt fare lakrimal bezi klonu elde edildi. Bazı klonlar iyi büyüdü, ancak bazı organoid klonlar toplandıktan sonra kayboldu veya farklılaşmaya başladı (Şekil 4F). Seçilen 10 organoid klondan 7'si iyi büyüdü.

Şekil 4: Fare lakrimal bezi organoidlerinde Pax6'nın temel düzenleme aracılı nakavtı. (A) Pax6 lokusunu hedefleyen gRNA'nın doğru entegrasyonundan sonra pFYF1320'nin sanger dizileme izi. (B) Elektroporasyonu takiben higromisin'e maruz kaldıktan 5 gün sonra fare lakrimal bezi organoidlerinin parlak alan görüntüleri. Organoidler fare genişleme ortamında kültürlendi. Solda, higromisin büyümesine dirençli bir klon bulunmayan, başarısız bir elektroporasyon örneği vardır. Sağda, birkaç higromisin dirençli organoid klonunun hayatta kaldığı başarılı bir elektroporasyon örneği bulunmaktadır. (C) Seçilmesi gereken klonların ve seçilmemesi gereken klonların parlak alan görüntüleri. (D) gRNA ile hedeflenen Pax6 lokusunun amplifikasyonunu gösteren agaroz jeli. Yeşil renkte, beklenen 367 bp boyutundaki bant vurgulanır. (E) Sanger, higromisin'e dirençli üç organoid klonun izini diziler. Üst klon düzenlenmemiş. Orta klon homozigot C > T baskısıdır ve bu nedenle homozigot nakavttır. Alt klon iki heterozigot nokta mutasyonu sunar ve ya heterozigot bir nakavt ya da karışık bir klondur ve yanlış düzenlenmiştir. (F) Seçilen organoid klonların çeşitli büyüme seviyelerine sahip parlak alan görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Son olarak, farelerde insan lakrimal bezi organoid ortotopik transplantasyonunu gerçekleştirmek için, 3 gün önceden bölünmüş (< 100 μm çapında) organoidler kullanıldı. Organoid engraftman, organoidlerin fare lakrimal bezine enjekte edilmesinden 1 ay sonra, insana özgü bir belirteç olan insan nükleolar antijeni için boyanarak doğrulandı (Şekil 5). Fare lakrimal bezinin tüm bölümlerinden noktasal lekelenmenin olmaması, insan organoid engraftmanının eksikliğini gösteriyordu.

Şekil 5: İnsan lakrimal bezi organoidlerinin fare lakrimal bezine nakli. Transplantasyondan 1 ay sonra engraftmanı izlemek için insan nükleolar belirteci için nakledilen fare lakrimal bezlerinin boyanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Ortamın ve tamponların bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Bu protokol, lakrimal bez organoidlerinin fonksiyonel tahliller, mutasyon modellemesi ve transplantasyon için kurulmasını ve kullanımını açıklamaktadır. Fare ve insan lakrimal bezi organoidleri oluşturulurken, doku ayrışması çok önemlidir. Doku yeterince sindirilmezse, organoid verim düşük olacaktır. Doku aşırı sindirilirse, hücreler ölür ve organoidler olarak büyümez. Her doku, optimal organoid büyümesini sağlamak için belirli bir süre için belirli bir enzimle sindirilmelidir^14,17,18. Lakrimal bez, pipetleme bazlı mekanik ayrışma ile birlikte 5-10 dakikalık bir kollajenaz sindiriminin küçük doku parçalarını izole etmek için yeterli olduğu oldukça yumuşak bir dokudur. Tek hücreli RNA dizilimi gibi uygulamalar için tek hücrelerin elde edilmesi gerekiyorsa, ayrışma tek hücreli aşamaya ulaşılana kadar daha uzun süre gerçekleştirilebilir, ancak canlılıktaki herhangi bir azalmayı sınırlamak için tek hücreler elde edilir edilmez ayrışma durdurulmalıdır. Doku ayrışması çok önemli olduğundan, aşırı sindirim lakrimal bez organoid oluşumunun başarısızlığının en olası nedenidir.

Lakrimal bez organoidlerinin uygun şekilde korunması, kullanımları için önemlidir. Uzun süreli bakım, yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidlerinin, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı organoidlere kıyasla ayırt edici bir özelliğidir ^7,17. Uzun süreli bakım sağlamak için düzenli organoid bölünmesi ve orta değişiklikler yapılmalıdır. Bu olmadan, organoidler farklılaşmaya ve azalmış kök hücre potansiyeli geliştirmeye başlar, bu da uzun süreli bakımlarını engeller⁷. Yine bu adımda, aşırı sindirim kök hücreleri öldürebilir ve organoid bakımını bozabilir. Düzenli bakım için, tek hücrelere organoid ayrışma gerekli değildir. Bununla birlikte, klonal nakavt organoid hatları oluşturmak için, tek hücrelerle başlamak çok önemlidir. Aksi takdirde, organoidler farklı genetik geçmişlere sahip bir hücre mozaiğinden oluşacak ve bu da tek, tanımlanmış bir mutasyonun etkisini analiz etmeyi imkansız hale getirecektir. Burada, durdurma kodonları oluşturmak için bir C > T baz editörünün kullanımını açıklıyoruz. Bu genom editörü, bir NGG PAM'dan 12-18 baz içinde arginin, glutamin veya triptofan kodonların varlığına dayanır. Bir gRNA tasarımında bu koşullar yerine getirilmediğinde, alternatif PAM'lere sahip geleneksel Cas9 veya C >T baz editörleri^{kullanılabilir 7,18}. Bununla birlikte, geleneksel Cas9, onarım¹¹ üzerine indellerle sonuçlanan çift sarmallı kırılmalar sunar. Her iki alel de farklı indelleri barındırabileceğinden, klon genotiplemesi ek dikkat gerektirir. Her iki alelin de çerçeve dışı indeller içerdiğinden ve dolayısıyla organoid klonların hedeflenen^{gen 19} için nakavt edildiğinden emin olmak için getirilen modifikasyonların dekonvolüsyonu yapılmalıdır. C > T baz editörlerinin avantajı, mutlaka durdurma kodonları ile sonuçlanmayan nokta mutasyonlarını modellemek için kullanılabilmeleri gerçeğinde yatmaktadır. Örneğin, lakrimal bez fizyolojisi üzerindeki etkilerini incelemek için aniridi hastalarında bulunan spesifik Pax6 mutasyonlarını modellemek için kullanılabilirler²⁰.

Lakrimal bez, gözyaşı filminin sulu kısmını salgılar¹. İnsan organoidlerinde büyüme faktörü yoksunluğu ve NOTCH inhibisyonunun aracılık ettiği farklılaşmadan sonra gözyaşı sekresyonu özetlenebilir. Bu koşullar altında, organoidler terminal farklılaşmaya uğrar ve daha fazla korunamazlar. Bununla birlikte, farklılaşmış lakrimal bez organoidleri, potansiyel olarak yüksek verimli ekranlarda, kuru göz hastalığı bağlamında yırtılmaya neden olan ilaçların geliştirilmesine rehberlik edebilir. Bu protokolde sunulan yırtılma testi, şu anda organoid boyutunda kısa sürede en büyük değişikliği veren testtir ve bu da bir^{ilaç taraması} bağlamında 7,9,17 oranında ölçmeyi kolaylaştırır.

Kök hücre tedavisi, kuru göz hastalığında lakrimal bez rejenerasyonu için büyük umut vaat etmektedir²¹. Yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidleri bu tür uygulamalar için bir kaynak materyal olabilir. Burada sunulan protokol, çoğunlukla kistler olarak insan lakrimal bezi organoid engraftmanı ile sonuçlanır. Düşük organoid engraftman, organoidlerin yanlış bölgeye enjekte edilmesi nedeniyle ortaya çıkabilir. Enjeksiyon prosedürünü bir boya ile eğitmek, enjeksiyon bölgesinin izlenmesini sağlar ve sonuçta enjeksiyon doğruluğunu arttırır. Alternatif olarak, fare epidermisi,^22'den önce sıçanlarda yapıldığı gibi, lakrimal beze doğrudan erişime sahip olacak şekilde kesilebilir. Bu yöntem daha uzun sürer, ancak daha doğru olabilir. Öte yandan, mevcut protokolle, organoidler fare lakrimal bezine fonksiyonel olarak entegre edilmedi. Benzer sonuçlar iPSC kaynaklı lakrimal bez engraftmanı²² için de gözlenmiştir. Transplantasyon yöntemi, lakrimal bezin önceden yaralanması, kuru göz faresi modeli kullanılması ve / veya organoidlerin tek hücre veya küçük kümeler halinde enjekte edilmesiyle daha da geliştirilebilir. Bununla birlikte, yetişkin kök hücre kaynaklı lakrimal bez organoidleri ve ilgili araç seti, lakrimal bez araştırması ve rejeneratif tıpta gelecekteki uygulamaların temeli olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL güvenli kilitli santrifüj tüpleri	Eppendorf	EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidrat (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637	CAS: 868272-85-9, DİKKAT, 6 g/L çözelti -20 °C'de alikotte saklanabilir; C
5x yeşil GoTaq Flexi tamponu	Promega	M891A	-20 &°C'de saklayın; C
A83-01	Tocris	2939	-20 > C, 30 mM'de stok, 10000x
Gelişmiş DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	mağazası 4 & derece; C
Ampisilin	Hubrecht Enstitüsü
Ampisilin sodyum tuzu	Sigma-Aldrich	A9518
Otoklav VAPOUR-Line lite	VWR kimyasalları
B27 takviyesi	Invitrogen	17504-044	-20 °C'de saklayın; C, 50x
BD Mikro-İnce insülin iğnesi 1 mL	BD Bioscience	324825
Masaüstü mikroskop DMI1	Leica
Sığır serum albümini (BSA)	MP biyomedikal	160069	4 & derecede saklayın; C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL/6 fareler	Hubrecht Enstitüsü
Kasetleri	Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	Kriyoprezervasyon ortamı, talimatlara uyun
Santrifüj	Eppendorf
Sitrik asit monohidrat	J.T. Baker	0088	CAS: 5949-29-1
Kollajenaz I	Sigma Aldrich	C9407	Alikotlar 20 mg / mL, 20x, -20 ° C'de saklayın; C
Konik tüpler 15 mL	Greiner Bio-One	5618-8271
Konik tüpler 50 mL	Corning	CLS430828-500EA
Lameller 24 mm x 50 mm	Menzel-Glä zer	BB024050S1
Cultrex Bazal Membran Ekstresi (BME), Büyüme Faktörü Azaltılmış, Tip 2 - hücre dışı matriks	R& D Systems, Bio-Techne	3533-001-02	-20 & derece mağaza; C, 4 & derecede tutun; 1 aya kadar C
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Mağazası -20 &° C; C, 10 mM'de stok, 1000x
Disodyum hidrojen fosfat susuz	VWR kimyasalları	28026.292	CAS: 7558-79-4
Di-sodyumhidrojenfosfat dihidrat	Sigma-Aldrich	71643	CAS: 10028-24-7
ThermoFisher Scientific	17105-041		Aliquots'u 50 U / mL'de dispase, -20 & °C'de saklayın; Kullanıma kadar C, 400x
Tek Kullanımlık Neşter Steril N° 10	Swann Morton	3033838
DM4000 mikroskobu	Leica
dNTP'ler 25 mM	Promega	U1420	4 nükleotidi de karıştırın, -20 °C'de saklayın; C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS)	Gibco	14190144	1x
Kolay süzgeçler 70 & mikro; m	Greiner	542170
Elektroporasyon küveti	Nepagene	EC002S
EnVision+/HRP fare	Agilent	K400111-2
Etanol %100	BOOM	84045206; 5000	DİKKAT, Diğer Etanol seyreltmelerini hazırlamak için kullanın
Etanol %70BOOM		84010059.5000	DİKKAT
Etanol %96	BOOM	84050065.5000	DİKKAT
EVOS FL Auto 2 Hücreli Görüntüleme Sistemi	ThermoFisher Scientific Live-imaging		parlak alan mikroscrope
FGF10	Peprotech	100-26	-20 °C'de saklayın; C, baz ortamında 100 mg / mL'de stok, 100x
Fiji	NIH, Fiji geliştiricileri
Formaldehit çözeltisi% 4	Sigma-Aldrich	1.00496	CAS: 50-00-0, DİKKAT
Forskolin	Tocris	1099	-20 & °C'de saklayın; C, 10 mM'de stok, 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraz	Promega	M7805	-20 &°C'de saklayın; C
Hematoksilen	VWR kimyasalları	10047105	Oda sıcaklığında saklayın
HEPES	Gibco	15630-080	4 &�C'de saklayın; C, 100x
Histocore H ve C, Doku gömme makinesi	Leica
Sıcak plaka	Meidax
İnsan nükleolar antijen antikoru	Abcam	ab-190710
Hidroklorik asit 5 N	ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0, DİKKAT
Hidrojen peroksid %30	Chem-lab	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1, DİKKAT
Higromisin B-altın	InvivoGen	ant-hg	100 mg /&mikro'da stok; L, 1000x
Higromisin direnç kaseti içeren plazmid			Andersson-Rolf ve diğerleri, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo %100	Mecan	5960501
LB ortamı	Hubrecht Enstitüsü
MgCl2 25 mM	Promega	A351H	-20 ° C'de saklayın; C
Microtome RM2235	Leica
Midiprep DNA izolasyon kiti	ThermoFisher Scientific	K210005
Miniprep DNA izolasyon kiti	ThermoFisher bilimsel	K210003
N-asetilsistein	Sigma Aldrich	A9165	-20 &°C'de saklayın; C, 500 mM'de stok, 400x
NEPA21 elektroporatör	Nepagene
Nikotinamid	Sigma Aldrich	N0636	Mağaza -20 &°C'de; C, 1M'de stok, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) fareler	Hubrecht Enstitüsü kolonisi
Noggin şartlandırılmış orta	U-Protein Express	Özel sipariş	-20 °C'de saklayın; C
Noradrenalin	Sigma Aldrich	A7257	Mağazası -20 &°C'de; C, 100 mM'de stok
Fırın	Memmert		Seti 58 > C
P20, P200 ve P1000 pipetleri	Gilson
Parafin	VWR kimyasalları	10048502
Pasteur pipetleri, cam tıkalı	ThermoFisher Scientific	1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG	IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC	IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP	Addgene	112101
Penisilin / Streptomisin	Invitrogen	15140-122	-20 & ° C'de saklayın; C
Perteks	Klinipath	-08010
pFYF1320	Addgene	47511
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1000X, -20 ° C'de saklayın; C
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	-20 ° C'de saklayın; C, 10 mM'de stok, 10000x
Petri kabı, 10 cm	Greiner	633102
Q5 tamponu	New England Biolabs	B9027S
Q5 yüksek kaliteli DNA polimeraz	New England Biolabs	M0491S
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti	Qiagen	28704
QuickExtract DNA Ekstraksiyon Çözeltisi	Lucigen	QE09050	Mağaza alikotları -20 & derecede; C
R-spondin 3 şartlandırılmış orta	U-Protein Express	Özel sipariş	-20 ° C'de saklayın; C
sgRNA Ters Astar: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCCTTTCCACAAG	IDT
Slaytlar	StarFrost	MBB-0302-55A	Yapıştırıcı, öğütülmüş
Sodyum azid	Merck	8.22335.1000	CAS: 26628-22-8, DİKKAT
Sodyum sitrat dihidrat	JT Baker	0280	CAS: 6132-04-3
Standart İleri Astar: "/5fos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC	IDT
Alt klonlama verimliliği yetkin hücreler DH5alpha	Invitrogen	18265-017
Süspansiyon hücre kültürü plakaları (24 oyuklu)	Greiner Bio-One	662102	24 oyuklu
Süspansiyon hücre kültürü plakaları (12 oyuklu)	Greiner Bio-One	665102	12 oyuklu
T4 DNA ligaz	New England Biolabs	M0202
TAE tamponu	ThermoFisher Scientific	B49	50x'te stok, ultra saf su ile 1x'e seyreltin
Transpozaz içeren plazmid			Andersson-Rolf ve diğerleri, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzim	Invitrogen	12605-028	4 & °C'de saklayın; C
U6_Forward astar: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT	IDT
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550
Su banyosu	Tulabo
Ksilen	Klinipath	4055-9005	CAS: 1330-20-7, DİKKAT
Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihidroklorür	-20 °C'de saklayın; C, 10 mM'de stok, 1000x