Yöntem makalesi

Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt

DOI:

10.3791/65042

⸱

3 Mart 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok Caenorhabditis elegans solucanından esnek kimyasal ve multimodal stimülasyon ve eşzamanlı nöral aktivitenin kaydedilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, adaptasyon, zamansal inhibisyon ve uyaran çapraz konuşması gibi nöronal fenomenlerin ölçülmesini sağlamak için mikroakışkanlar, açık kaynaklı donanım ve yazılım ve denetimli otomatik veri analizi kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, bireysel nöronların seviyesinden tüm beyin devrelerine kadar nöral dinamikleri anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, nöral tepkiler önceki deneyimlere, içsel durumlara veya stokastik faktörlere bağlı olarak değişebilir, bu nedenle birçok bireyde aynı anda nöral fonksiyonu değerlendirebilecek yöntemlere ihtiyaç duyulur. Çoğu kayıt tekniği bir seferde tek bir hayvanı incelerken, nöronal kayıtları aynı anda düzinelerce Caenorhabditis elegans veya diğer milimetre altı ölçekli organizmalara ölçeklendirmek için geniş alan mikroskobunun kullanımını açıklıyoruz. Açık kaynaklı donanım ve yazılım, kimyasal, optik, mekanik, termal ve elektromanyetik uyaranlar dahil olmak üzere çeşitli uyaran türlerinin yoğunluğunu ve zamanlamasını kontrol eden tam otomatik deneylerin programlanmasında büyük esneklik sağlar. Özellikle, mikroakışkan akış cihazları, kemosensoriyel uyaranların saniyenin altında çözünürlükle hassas, tekrarlanabilir ve kantitatif kontrolünü sağlar. NeuroTracker yarı otomatik veri analizi boru hattı daha sonra sinirsel uyarılabilirlik ve dinamiklerdeki fonksiyonel değişiklikleri ortaya çıkarmak için bireysel ve popülasyon çapında sinirsel tepkileri çıkarır. Bu yazıda nöronal adaptasyon, temporal inhibisyon ve uyaran crosstalk'unun ölçülmesine ilişkin örnekler sunulmaktadır. Bu teknikler stimülasyonun hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini arttırır, popülasyon değişkenliğinin araştırılmasına izin verir ve hücrelerden ve organoidlerden tüm organizmalara ve bitkilere kadar küçük biyosistemlerdeki diğer dinamik floresan sinyallere genellenebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalsiyum görüntüleme teknikleri, floresan mikroskobu ve hedef hücrelerdeeksprese edilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri 1,2,3 kullanılarak in vivo nöral dinamiklerin gerçek zamanlı olarak noninvaziv olarak kaydedilmesini sağlamıştır. Bu sensörler tipik olarak, nöronal aktivasyon ve yüksek hücre içi kalsiyum seviyeleri üzerine floresan yoğunluğunu arttırmak için GFP-kalmodulin-M13 peptid (GCaMP) ailesi gibi yeşil bir floresan protein (GFP) kullanır. Kalsiyum görüntüleme, nöronların ve nöral devrelerin canlılarda nasıl çalıştığını incelemek için özellikl....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nöral görüntüleme ekipmanları

NOT: Mikroskop aydınlatma zamanlamasını, görüntü alımını ve uyaran dağıtımını kontrol eden görüntüleme ve stimülasyon sisteminin oluşturulmasıyla ilgili ayrıntılı talimatlar için Lawler ve Albrecht15'e bakınız (Şekil 1). Ucuz bir Arduino Nano uyaran kontrolörü, akışkan valfleri dijital sinyaller yoluyla bir valf kontrolörüne harekete geçirir ve optogenetik aydınlatmayı bir LED kontrolörüne analog voltaj sinyalleri yoluyla kontrol eder. Titreşim motorları ve termal ısıtıcılar gibi diğer uyaranlar, dijital veya analog sinyaller kullanılarak k....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamansal inhibisyon, adaptasyon ve disinhibisyon dahil olmak üzere farklı nöral fenomenleri değerlendiren uyaran modellerinin birkaç örneğini sunuyoruz. Temporal inhibisyon , ilk sunumdan kısa bir süre sonra meydana gelen ikinci bir uyaran sunumuna karşı nöral bir yanıtın anlık olarak bastırılmasıdır14. Bu fenomeni test etmek için, bir çift darbe deneyinde, 0 s ila 20 s arasında değişen bir aralıkla ayrılmış iki 1 s koku verici darbeden oluşan sekiz desen sunulmuştur (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, farklı uyaran modellerinin geçici olarak hassas bir şekilde verilmesini kullanarak nöral aktivite fenomenlerinin değerlendirilmesi için açık erişimli bir mikroskopi sistemi tarif ediyoruz. Mikroakışkan platform, onlarca hayvanı mikroskop görüş alanında tutarken tekrarlanabilir uyaranlar sağlar. Birkaç ticari mikroskopi yazılım paketi, çeşitli uyaran zamanlama modellerinin ve genellikle her bir modelin veya tescilli dosya formatlarının manuel olarak girilmesini gerektiren programların kolay programlanmasına.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolleri test ettiği ve makaleyi incelediği için Fox Avery'ye ve programlama yardımı için Eric Hall'a teşekkür ederiz. Burada sunulan yöntemlerin finansmanı kısmen Ulusal Bilim Vakfı 1724026 (D.R.A.) tarafından sağlanmıştır.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bakteri suşları
E.  coli (OP50)Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)Cat# OP50
Deneysel modeller: Organizmalar/suşlar
C.  istenen nöro>Caenorhabditis < / em>Genetics Center (CGC) veya yayınlanmışNZ1091
Kimyasallar, Tedaviler ve Solucan Hazırlama Malzemeleri
2,3-ButanedioneSigma-AldrichCat # B85307diasetil, örnek kimyasal uyaran
Kalsiyum klorür, CaCl2Sigma-AldrichCat# C3881
Floresein, Sodyum tuzuSigma-AldrichCat # F6377
Cam su iticiRain-XCat #800002250cam hidrofobik tedavi (tek kullanımlık)
Magnezyum klorür, MgCl2Sigma-AldrichCat# M2393
Nematod Büyüme Ortamı (NGM) agarGenesee Cat#: 20-273NGM
Petri kapları (60  mm)TritechCat #T3305
Poli (dimetil siloksan) (PDMS): Sylgard 184Dow ChemicalCat # 1673921
Potasyum fosfat monobazikSigma-AldrichCat # P5655
Potasyum fosfat dibazikSigma-AldrichCat # P8281
Sodyum klorür, NaClSigma-AldrichCat # S7653
(tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)triklorosilan (TFOCS)GelestCAS # 78560-45-9cam hidrofobik tedavi (dayanıklı)
< güçlü>Yazılım ve algoritmalar< / güçlü >
Arduino IDEArduinohttps://www.arduino.cc/en/software
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-managerMicro-managerhttps://micro-manager.org/
Mikroskop kontrol yazılımıAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker veri analiz yazılımıAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Otomatik Mikroskop ve Stimülasyon Sistemi
Axio Observer.A1 epifloresan için ters mikroskop kurulumu (GFP filtre küpleri, 5 kez; objektif veya benzeri)ZeissCat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED aydınlatıcıExcelitasCat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Dijital sCMOS kameraHamamatsuCat #C11440-22CU
Arduino nanoArduinoCat #A000005
3 Minyatür Diapragm İzolasyon Vanası (LQX12)ParkerCat #LQX12-3W24FF48-000Vana 1: Kontrol
2 normalde kapalı (NC) Pinch VanaBio-Chem Vana IncCat #075P2-S432Vana 2: Çıkış
Sıkıştırma VanasıNResearchCat #161P091Valf 3: Uyaran seçim
Optogenetik stimülasyon LED'i ve denetleyici (615 nm)MightexCat #PLS-0625-030-S ve #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 dijital/manuel valf kontrolörüAutoMate ScientificCat #01-18
Teller ve konektörlerçeşitliCell STARS Protokolü Şekil 2'ye bakın (Lawler, 2021)
Mikroakışkan Cihaz Hazırlığı
Dremel Değişken Hızlı Döner Kesici 4000 DremelCat #F0134000ABCam kesmek için hızı 5k RPM'ye ayarlayın
Dremel matkap pres döner alet iş istasyonuDremelCat #220-01
Elmas matkap ucuDremelCat #7134
Cam kaydırak, 1  mm kalınlığındaVWRCat # 75799-268
Cam çizici (Elmas çizici)Ted PellaCat # 54468
Luer 3 muslukCole-ParmerCat #EW-30600-07
Luer 23 G künt iğneVWRCat #89134-100
Mikroakışkan cihazBu makaleyle ilişkili CAD dosyalarından yazar veya üreticiN / A
Mikroakışkan cihaz kelepçesiWarner Instruments (veya makine atölyesi)P-2
Mikroakışkan boru, 0.02 & Prime; IDCole-ParmerKedi #EW-06419-01
Tüp 19 g, 0.5 ve Prime;New England Küçük TüpKedi #NE-1027-12
çalışmasının ilgili yazarları, örneğin 3

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Otomatik N ronal Kay tMikroak kan CihazlarGeni Alan MikroskopisiCaenorhabditis ElegansKalsiyum G r nt lemeN ral Pop lasyon De i kenli iGenetik Olarak Kodlanm ndikat rlerNeuroTracker AnaliziStim lasyon Paterni Programlama

İlgili makaleler