Birçok Caenorhabditis elegans solucanından esnek kimyasal ve multimodal stimülasyon ve eşzamanlı nöral aktivitenin kaydedilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, adaptasyon, zamansal inhibisyon ve uyaran çapraz konuşması gibi nöronal fenomenlerin ölçülmesini sağlamak için mikroakışkanlar, açık kaynaklı donanım ve yazılım ve denetimli otomatik veri analizi kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt
Bu makalede
Özet
Özet
Floresan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, bireysel nöronların seviyesinden tüm beyin devrelerine kadar nöral dinamikleri anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, nöral tepkiler önceki deneyimlere, içsel durumlara veya stokastik faktörlere bağlı olarak değişebilir, bu nedenle birçok bireyde aynı anda nöral fonksiyonu değerlendirebilecek yöntemlere ihtiyaç duyulur. Çoğu kayıt tekniği bir seferde tek bir hayvanı incelerken, nöronal kayıtları aynı anda düzinelerce Caenorhabditis elegans veya diğer milimetre altı ölçekli organizmalara ölçeklendirmek için geniş alan mikroskobunun kullanımını açıklıyoruz. Açık kaynaklı donanım ve yazılım, kimyasal, optik, mekanik, termal ve elektromanyetik uyaranlar dahil olmak üzere çeşitli uyaran türlerinin yoğunluğunu ve zamanlamasını kontrol eden tam otomatik deneylerin programlanmasında büyük esneklik sağlar. Özellikle, mikroakışkan akış cihazları, kemosensoriyel uyaranların saniyenin altında çözünürlükle hassas, tekrarlanabilir ve kantitatif kontrolünü sağlar. NeuroTracker yarı otomatik veri analizi boru hattı daha sonra sinirsel uyarılabilirlik ve dinamiklerdeki fonksiyonel değişiklikleri ortaya çıkarmak için bireysel ve popülasyon çapında sinirsel tepkileri çıkarır. Bu yazıda nöronal adaptasyon, temporal inhibisyon ve uyaran crosstalk'unun ölçülmesine ilişkin örnekler sunulmaktadır. Bu teknikler stimülasyonun hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini arttırır, popülasyon değişkenliğinin araştırılmasına izin verir ve hücrelerden ve organoidlerden tüm organizmalara ve bitkilere kadar küçük biyosistemlerdeki diğer dinamik floresan sinyallere genellenebilir.
Giriş
Kalsiyum görüntüleme teknikleri, floresan mikroskobu ve hedef hücrelerdeeksprese edilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri 1,2,3 kullanılarak in vivo nöral dinamiklerin gerçek zamanlı olarak noninvaziv olarak kaydedilmesini sağlamıştır. Bu sensörler tipik olarak, nöronal aktivasyon ve yüksek hücre içi kalsiyum seviyeleri üzerine floresan yoğunluğunu arttırmak için GFP-kalmodulin-M13 peptid (GCaMP) ailesi gibi yeşil bir floresan protein (GFP) kullanır. Kalsiyum görüntüleme, nöronların ve nöral devrelerin canlılarda nasıl çalıştığını incelemek için özellikl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Nöral görüntüleme ekipmanları
NOT: Mikroskop aydınlatma zamanlamasını, görüntü alımını ve uyaran dağıtımını kontrol eden görüntüleme ve stimülasyon sisteminin oluşturulmasıyla ilgili ayrıntılı talimatlar için Lawler ve Albrecht15'e bakınız (Şekil 1). Ucuz bir Arduino Nano uyaran kontrolörü, akışkan valfleri dijital sinyaller yoluyla bir valf kontrolörüne harekete geçirir ve optogenetik aydınlatmayı bir LED kontrolörüne analog voltaj sinyalleri yoluyla kontrol eder. Titreşim motorları ve termal ısıtıcılar gibi diğer uyaranlar, dijital veya analog sinyaller kullanılarak k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Zamansal inhibisyon, adaptasyon ve disinhibisyon dahil olmak üzere farklı nöral fenomenleri değerlendiren uyaran modellerinin birkaç örneğini sunuyoruz. Temporal inhibisyon , ilk sunumdan kısa bir süre sonra meydana gelen ikinci bir uyaran sunumuna karşı nöral bir yanıtın anlık olarak bastırılmasıdır14. Bu fenomeni test etmek için, bir çift darbe deneyinde, 0 s ila 20 s arasında değişen bir aralıkla ayrılmış iki 1 s koku verici darbeden oluşan sekiz desen sunulmuştur (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde, farklı uyaran modellerinin geçici olarak hassas bir şekilde verilmesini kullanarak nöral aktivite fenomenlerinin değerlendirilmesi için açık erişimli bir mikroskopi sistemi tarif ediyoruz. Mikroakışkan platform, onlarca hayvanı mikroskop görüş alanında tutarken tekrarlanabilir uyaranlar sağlar. Birkaç ticari mikroskopi yazılım paketi, çeşitli uyaran zamanlama modellerinin ve genellikle her bir modelin veya tescilli dosya formatlarının manuel olarak girilmesini gerektiren programların kolay programlanmasına.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu protokolleri test ettiği ve makaleyi incelediği için Fox Avery'ye ve programlama yardımı için Eric Hall'a teşekkür ederiz. Burada sunulan yöntemlerin finansmanı kısmen Ulusal Bilim Vakfı 1724026 (D.R.A.) tarafından sağlanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bakteri suşları | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) | Cat# OP50 | |
| Deneysel modeller: Organizmalar/suşlar | |||
| C. istenen nöro> | Caenorhabditis < / em>Genetics Center (CGC) veya yayınlanmış | NZ1091 | |
| Kimyasallar, Tedaviler ve Solucan Hazırlama Malzemeleri | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat # B85307 | diasetil, örnek kimyasal uyaran |
| Kalsiyum klorür, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Floresein, Sodyum tuzu | Sigma-Aldrich | Cat # F6377 | |
| Cam su itici | Rain-X | Cat #800002250 | cam hidrofobik tedavi (tek kullanımlık) |
| Magnezyum klorür, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematod Büyüme Ortamı (NGM) agar | Genesee Cat | #: 20-273NGM | |
| Petri kapları (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poli (dimetil siloksan) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat # 1673921 | |
| Potasyum fosfat monobazik | Sigma-Aldrich | Cat # P5655 | |
| Potasyum fosfat dibazik | Sigma-Aldrich | Cat # P8281 | |
| Sodyum klorür, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat # S7653 | |
| (tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)triklorosilan (TFOCS) | Gelest | CAS # 78560-45-9 | cam hidrofobik tedavi (dayanıklı) |
| < güçlü>Yazılım ve algoritmalar< / güçlü > | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Mikroskop kontrol yazılımı | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker veri analiz yazılımı | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Otomatik Mikroskop ve Stimülasyon Sistemi | |||
| Axio Observer.A1 epifloresan için ters mikroskop kurulumu (GFP filtre küpleri, 5 kez; objektif veya benzeri) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED aydınlatıcı | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Dijital sCMOS kamera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3 Minyatür Diapragm İzolasyon Vanası (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Vana 1: Kontrol |
| 2 normalde kapalı (NC) Pinch Vana | Bio-Chem Vana Inc | Cat #075P2-S432 | Vana 2: Çıkış |
| Sıkıştırma Vanası | NResearch | Cat #161P091 | Valf 3: Uyaran seçim |
| Optogenetik stimülasyon LED'i ve denetleyici (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S ve #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 dijital/manuel valf kontrolörü | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Teller ve konektörler | çeşitli | Cell STARS Protokolü Şekil 2'ye bakın (Lawler, 2021) | |
| Mikroakışkan Cihaz Hazırlığı | |||
| Dremel Değişken Hızlı Döner Kesici 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Cam kesmek için hızı 5k RPM'ye ayarlayın |
| Dremel matkap pres döner alet iş istasyonu | Dremel | Cat #220-01 | |
| Elmas matkap ucu | Dremel | Cat #7134 | |
| Cam kaydırak, 1 mm kalınlığında | VWR | Cat # 75799-268 | |
| Cam çizici (Elmas çizici) | Ted Pella | Cat # 54468 | |
| Luer 3 musluk | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G künt iğne | VWR | Cat #89134-100 | |
| Mikroakışkan cihaz | Bu makaleyle ilişkili CAD dosyalarından yazar veya üretici | N / A | |
| Mikroakışkan cihaz kelepçesi | Warner Instruments (veya makine atölyesi) | P-2 | |
| Mikroakışkan boru, 0.02 & Prime; ID | Cole-Parmer | Kedi #EW-06419-01 | |
| Tüp 19 g, 0.5 ve Prime; | New England Küçük Tüp | Kedi #NE-1027-12 |
Kaynaklar
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
