Yöntem makalesi

Atık Su ve Hava Örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının Miktar Tayini ve Tüm Genom Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/65053

⸱

30 Haziran 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, atık su bazlı epidemiyoloji çalışmaları için kullanılacak atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'sının miktarını belirlemeyi ve iç ve dış aerosollerde SARS-CoV-2'ye maruz kalma riskini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokol aynı zamanda SARS-CoV-2 tüm genom karakterizasyonu için kiremitli amplikon uzun şablon dizileme yaklaşımını da açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atık su bazlı epidemiyoloji, birçok ülkede SARS-CoV-2 ve diğer bulaşıcı hastalıklar için umut verici ve etkili bir sürveyans sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Süreç tipik olarak atık su konsantrasyonunu, nükleik asit ekstraksiyonunu, seçilen genomik segmentlerin amplifikasyonunu ve amplifiye edilmiş genomik segmentin tespitini ve nicelleştirilmesini içerir. Bu metodoloji, hava örneklerinde SARS-CoV-2 gibi bulaşıcı ajanları tespit etmek ve ölçmek için benzer şekilde kullanılabilir. Başlangıçta, SARS-CoV-2'nin öncelikle enfekte bir kişi tarafından konuşurken, hapşırırken, öksürürken, şarkı söylerken veya nefes alırken üretilen damlacıklarla yakın kişisel temas yoluyla yayıldığı varsayılmıştır. Bununla birlikte, giderek artan sayıda çalışma, sağlık tesislerinin havasında SARS-CoV-2 RNA'nın varlığını bildirmiş ve hava yoluyla bulaşmayı virüs için uygun bir yol olarak belirlemiştir. Bu çalışma, hem atık su hem de hava örneklerinden virüslerin çevresel tespitini, miktarını belirlemesini ve dizilenmesini kolaylaştırmak için yerleşik protokollerin bir bileşimini sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aralık 2019'da, daha önce bilinmeyen bir koronavirüs olan SARS-CoV-21'in neden olduğu COVID-19 adlı yeni bir hastalık ortaya çıktı. Ortaya çıkan küresel salgın, dünya çapında klinik ve halk sağlığı laboratuvarları için önemli bir zorluk teşkil etti, çünkü çok sayıda kişi toplumda virüs bulaşmasını ve yaygınlığını doğru bir şekilde değerlendirmek için teste ihtiyaç duyuyor. Bununla birlikte, birçok bölgede, zamanında ve mekansal olarak kapsamlı bir şekilde gerekli test seviyesine ulaşmak ekonomik olarak mümkün değildir 2,3. Bireysel klinik tanıya dayalı mevcut sürveyans sistemleri, büyük ölçüde semptom şiddetine ve bireysel raporlamaya ve ayrıca bu semptomların popülasyonda dolaşan mevcut hastalıklarla ne ölçüde örtüştüğünedayanmaktadır 4,5,6,7,8,9,10. Sonuç olarak, çok sayıda asemptomatik vaka, hastalık yükünün önemli ölçüde hafife alınmasına katkıda bulunur 7,11.

Bu zorluklar nedeniyle, tamamlayıcı bir sürveyans stratejisi olarak COVID-19 sürveyansı için atık su bazlı epidemiyoloji (WBE) önerilmiştir. WBE ilk olarak 2001'detanımlanmıştır 12 ve başlangıçta kokain ve diğer yasadışı uyuşturucuların izini sürmek için kullanılmıştır13. Bu yaklaşım, atık suda stabil olan ve insanlar tarafından atılan herhangi bir maddenin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamanın mümkün olduğu varsayımına dayanmaktadır 8,12. WBE, SARS-CoV-2 3,8,14,15,16 için tamamlayıcı ve etkili bir sürveyans sistemi olarak birçok ülkede başarıyla uygulanmıştır. Sucul ortamlarda insan virüslerini tespit etme yöntemlerinin çoğu şu adımları takip eder: konsantrasyon, nükleik asit ekstraksiyonu, seçilen genomik segmentin (veya segmentlerin) amplifikasyonu ve amplifiye edilmiş genomik segmentin tespiti/miktarının belirlenmesi3.

SARS-CoV-2'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi için bir diğer önemli ortam da hava örnekleridir. Başlangıçta, SARS-CoV-2'nin esas olarak enfekte bir kişi tarafından konuşurken, hapşırırken, öksürürken, şarkı söylerken veya nefes alırken üretilen aerosollerden solunum damlacıkları ile yakın kişisel temas yoluyla bulaştığı düşünülüyordu17. Bununla birlikte, birkaç çalışma, özellikle sağlık tesislerinde ve diğer kapalı alanlarda havada SARS-CoV-2 RNA'nın varlığını bildirmeye başladı 18,19,20,21. Hastanelerde ve diğer kapalı alanlarda iç mekanlarda alınan hava örneklerinde SARS-CoV-2 canlılığına dair kanıt, virüs konsantrasyonu yeterince yüksek olduğundabulunmuştur 22,23,2 4. Açık hava çalışmaları, kalabalık dış mekanlar dışındagenellikle SARS-CoV-2 kanıtı bulamamıştır 21,25,26,27,28,29. Şu an itibariyle, SARS-CoV-2'nin hava yoluyla bulaşması bir bulaşma şekli olarak kabul edilmiştir30,31. Yakın tarihli bir gözden geçirme çalışması, kalabalık alanların dışında hava yoluyla bulaşma risklerinin minimum olduğu dış mekanlar ile güçlü kaynakların (yani enfekte insan sayısının) bulunabileceği yetersiz havalandırılan ortamlarda daha büyük risklerin bulunabileceği iç mekanlar arasındaki farkları göstermektedir. Yakın zamanda yapılan kapsamlı bir gözden geçirme çalışması, özellikle havalandırmanın yetersiz olduğu kalabalık alanlarda, dış ve kapalı ortamlarda hava yoluyla bulaşma riskleri arasındaki önemli farklılıkları vurgulamıştır. Çalışma, virüs partiküllerinin seyreltilmesi ve dağılması için daha büyük bir hava hacminin bulunduğu dış ortamlarda hava yoluyla bulaşma riskinin minimum olduğunu göstermektedir32. Bu bulguların COVID-19 ile ilgili halk sağlığı politikaları ve kılavuzları için önemli etkileri vardır. Politika yapıcılar, iç ve dış ortamlar arasındaki bulaşma risklerindeki önemli farklılıkları kabul ederek, virüsün yayılmasını azaltmak ve halk sağlığını korumak için daha etkili stratejiler geliştirebilirler.

Farklı çevresel örneklerden SARS-CoV-2'nin tespiti, miktarı ve dizilimi için çeşitli yöntemler ve protokoller vardır. Bu yöntem makalesi, farklı kapasite seviyelerine sahip laboratuvarların atık su ve hava örneklerinden virüslerin çevresel tespitini, miktarını belirlemesini ve dizilenmesini gerçekleştirmesine olanak tanıyan köklü protokollerin bir kombinasyonunu sunmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tüm yöntemler başka bir yerde yayınlanmıştır ve orijinal yöntemlerden küçük değişiklikler içerir.

1. Atık su toplama ve numune ön işleme

NOT: Çevresel örneklerdeki düşük SARS-CoV-2 RNA konsantrasyonları nedeniyle, başarılı bir tespit için bir konsantrasyon adımının uygulanmasıçok önemlidir 33,34,35. Burada açıklanan, atık suda SARS-CoV-2'nin tespiti için bildirilen ilk yöntemdir36.

  1. Atık su numunelerinin toplanması ve konsantrasyonu
    1. 1 L 24 saatlik kompozit atık su numunesi toplayın. Numuneyi 4 °C'de saklayın ve 24 saat içinde protokole devam edin.
    2. Şişeyi hafifçe sallayarak numuneyi homojenize edin. 70 mL'yi 100 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın veya numuneyi 50 mL'lik iki santrifüj tüpe bölün.
    3. Konsantrasyon işleminin dahili kontrolü olarak her numuneden 20 μL mengovirüsü (3.2 x 103 kopya / μL) 70 mL'ye dökün. Alternatif olarak, her 50 mL santrifüj tüpüne 10 μL mengovirüs (3.2 x 103 kopya / μL) dökün.
    4. Numuneyi homojenize edin ve büyük partikülleri ve organizmaları (pelet) çıkarmak için 10 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin.
    5. Elde edilen süpernatanı, 4 ° C'de 40 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüjleyerek 10 KDa'lık bir kesme ile santrifüj ile santrifüj ultrafiltrasyon cihazlarıyla konsantrasyon için kullanın. 40 dakika boyunca 700 x g'da santrifüj ederek ve ultrafiltrasyon cihazının konumunu tersine çevirerek konsantreyi yükseltin.
    6. Elde edilen konsantrenin hacmini ölçün. Hacim, santrifüj filtreleri tıkayan numunedeki katı madde miktarına bağlı olarak değişecektir. Bu çalışmada elde edilen konsantre hacimler 200-1.200 μL arasındaydı.
    7. Elde edilen konsantreyi ticari bir kit veya şirket içi bir yöntem kullanarak RNA ekstraksiyonu için kullanın. Bu çalışmada kullanılan numuneler için, 50 μL'lik bir elüsyon hacmine sahip viral RNA ekstraksiyonu için özel bir ticari kit kullanılmıştır.
    8. Ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu bir florometrik RNA miktar tayin kiti ile ölçün. Ekstrakte edilen RNA'yı alikotlara bölün ve daha fazla analize kadar -80 °C'de dondurun.
      NOT: Her RNA izolasyon prosedürü seti için, ekstraksiyon sırasında olası kontaminasyonu tespit etmek için yalnızca tamponları içeren bir negatif izolasyon kontrolü (NCI) dahil edilmelidir.
  2. Coriolis kompakt hava örnekleyici kullanılarak hava örneklerinin toplanması
    1. Örnekleme sıklığını ve örnekleme yerlerini tanımlayarak araştırma hedefine göre bir örnekleme stratejisi seçin.
    2. Hava örnekleyicide akış hızını ayarlayın (burada, 30 dakika boyunca 50 L/dak). Lütfen 200 L/dk'dan daha yüksek bir akış hızının viral RNA'yı bozabileceğini unutmayın, bu nedenle 200 L/dk'nın altında bir akış hızı kullanılması önerilir.
    3. Başlatmayı darbelendirerek toplamaya başlamadan önce hava örnekleyiciye steril bir koni yerleştirin. Numune alma bittiğinde, koniye 5-15 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Numuneyi 15 saniye boyunca elle hafifçe girdap yapın veya sallayın. Numuneleri kriyotüplerde 4 °C'de veya -80 °C'de 24 saate kadar saklayın.
    4. İsteğe bağlı bir konsantrasyon adımı gerçekleştirilebilir. Her deneyden sonra konileri çamaşır suyu kullanarak temizleyin ve dekontamine edin.
    5. Ticari bir kit veya şirket içi bir yöntem kullanarak RNA'yı çıkarın. Bu çalışmadaki numuneler için, 50 μL'lik bir elüsyon hacmine sahip viral RNA ekstraksiyonu için spesifik bir ticari kit kullanılmıştır.
    6. Ekstrakte edilen RNA'nın konsantrasyonunu bir florometrik RNA miktar tayin kiti ile ölçün. Ekstrakte edilen RNA'yı alikotlara bölün ve daha fazla analize kadar -80 °C'de dondurun.
      NOT: Her RNA izolasyon prosedürü seti için, ekstraksiyon sırasında olası kontaminasyonu tespit etmek için yalnızca tamponları içeren bir negatif izolasyon kontrolü (NCI) dahil edilmelidir.

2. SARS-CoV-2 RNA'sının gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile miktar tayini

NOT: Aşağıdaki protokol CDC 2019-Yeni Koronavirüs (2019-nCoV) RT-PCR tanı paneli37'ye göredir. Donma ve çözülme döngülerini önlemek için astar/prob karışımını birkaç alikota bölün.

  1. Her hedef için reaksiyon mastermix'ini hazırlayın (mengovirüs; SARS-CoV-2 [N1 ve N2 genleri]) Tablo 1'deki gibi, reaktif kurulum odasında temiz bir başlıkta. Primerleri/prob karışımını ve enzimi beş kez ters çevirerek karıştırın. Alternatif olarak, ışık darbesi, primerleri / prob karışımını ve enzimi beş kez girdaplar.
    NOT: Hazırlama ve kullanım sırasında tüm reaktifleri soğuk tutun. Donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için, alikotlarda dondurulması şiddetle tavsiye edilir.
  2. İçeriği altta toplamak için tüpleri aşağı doğru döndürün (15-30 s boyunca 1.000 x g ) ve tüpleri soğuk bir rafa veya buz üzerine yerleştirin.
  3. Her hedef için 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin. Her bir mikrosantrifüj tüpüne ihtiyaç duyulan her bir reaktifin miktarını ekleyin (reaksiyon başına hacim çarpımı, gerekli kontroller dahil olmak üzere reaksiyon sayısı). Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve alttaki içeriği toplamak için 5 saniye santrifüjleyin.
  4. Mikrosantrifüj tüplerini soğuk bir rafta tutun ve 15 μL'yi bir soğutma rafındaki şerit PCR tüplerine veya 96 oyuklu bir plakaya dağıtın. Plakayı örtün ve nükleik asit işleme alanına taşıyın (bir soğutma rafında saklayın).
  5. Ekstrakte edilen RNA'nın bir alikotunu çözün ve 5 saniye boyunca hafifçe girdap yapın. Her reaksiyon kuyusuna veya önceden hazırlanmış mastermix'i içeren tüpe 5 μL RNA pipetleyin (5 μL şablon olmayan kontrol [NTC], izolasyonun negatif kontrolü [NCI] ve pozitif kontrol [PC]). Çapraz kontaminasyonu önlemek için eldivenleri gerektiği kadar sık değiştirin.
  6. Tüm reaksiyon plakasını veya tüplerini kapatın ve hafifçe girdap yapın. Plaka veya PCR tüplerini santrifüjleyin (15-30 s için 1.000 x g ).
  7. 25 μL RT-qPCR'yi aşağıdaki döngü koşullarıyla başlatın: 10 dakika boyunca 45 ° C'de ters transkriptaz; polimeraz aktivasyonu 95 °C'de 10 dakika; 15 saniye boyunca 95 ° C'de 45 döngü denatürasyon; ve 45 saniye boyunca 60 ° C'de tavlama/uzatma.
  8. Conte ve ark.38 tarafından bildirildiği gibi mengovirüs kontrollerinin iyileşme verimliliğini hesaplayın:
    figure-protocol-1 × 100

3. Atıksu ve veri analizinde sıralama varyantları

NOT: Açıklanan protokol, Quick ve ark.39,40 tarafından oluşturulmuş değiştirilmiş bir protokoldür. SARS-CoV-2 genom amplifikasyonu için PCR döşeme metodolojisi-ARTIC primerleri ve VarSkip primerleri ile iki set primer kullanır. En iyi genom kapsamını garanti etmek ve bir tipteki primerlerin başarısız olmasına neden olan yeni mutasyonların olasılığını en aza indirmek için primerlerin bir kombinasyonu kullanılır. Genel olarak, protokol üç bölüme ayrılmıştır: ters transkripsiyon (RT) ve amplikon üretimi, dizileme kütüphanesi hazırlama ve dizileme ve veri analizi.

  1. Ters transkripsiyon ve amplikon üretimi
    1. PCR dereceli suda doğru şekilde seyreltmek için giriş numunelerinin bilinen bir qPCR döngü eşiği (Ct) değerine sahip olduğundan emin olun. Ct değeri, qPCR ile miktar tayini sırasında elde edilir. Seyreltmeler aşağıdaki gibidir: Ct değeri 12-15 ise, numuneleri 1:100 seyreltin; Ct değeri 15-18 ise, numuneleri 1:10 oranında seyreltin; Ct değeri 18-35 ise numuneyi seyreltmeyin. Ct değeri 35'in üzerindeki numunelerin çalışmama olasılığı yüksektir.
    2. Bir PCR plakasında, her numuneden 16 μL'yi plaka üzerindeki konumuna pipetleyin. 4 μL ters transkripsiyon (RT) mastermix (5x) ekleyin. Plakayı kapatın ve aşağıdaki koşullarla PCR reaksiyonunu başlatın: 25 dakika 2 °C, 55 dakika 20 °C ve 95 dakika 1 °C.
    3. Her bir primer setinden 10 μM dilüsyon hazırlayın (ARTIC havuzu A ve havuz B ve VarSkip havuzu A ve havuz B). Mastermix'i her bir primer seti (ARTIC seti A ve B ve VarSkip seti A ve B) için Tablo 2'deki gibi hazırlayın. Bundan dört mastermix ortaya çıkacaktır.
    4. Yeni bir PCR plakasında, karşılık gelen her bir kuyucuğa 20 μL mastermix pipetleyin. Her karışıma 5 μL RT numunesi ekleyin.
      NOT: Her numune, ARTIC havuzu A ve B ve VarSkip havuzu A ve B olmak üzere dört reaksiyon karışımına sahip olacaktır.
    5. Plakayı kapatın ve PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi başlatın: 30 saniye boyunca 98 ° C'de polimeraz aktivasyonu; 15 saniye boyunca 98 ° C'de 35 döngü denatürasyon; ve 65 °C'de 4 dakika tavlama/uzatma. Plakayı aşağı doğru döndürün (15-30 s için 1.000 x g ). ARTIC reaksiyon havuzlarını birleştirin ve VarSkip reaksiyon havuzlarını ayrı ayrı birleştirin. Her numunenin iki adet 50 μL'lik amplikon reaksiyonu olacaktır.
    6. Her bir kuyucuğa PCR saflaştırması için 50 μL boncuk bazlı reaktif ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Her kullanımdan önce, boncukları yeniden süspanse etmek için PCR saflaştırma reaktifini kuvvetlice karıştırın.
    7. Plakayı manyetik bir ayırma standına yerleştirin ve boncukların bir pelet oluşturmasını ve sıvının berraklaşmasını bekleyin (~5 dk). Süpernatanı pipetleyin ve atın. PCR plakasını manyetik standın üzerinde tutun.







Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tablo 3'te özetlenen sonuçlar, bu makalede açıklanan yöntem kullanılarak atık su ve hava örneklerinde SARS-CoV-2 RNA'nın tespiti ve miktarının belirlenmesine ilişkin örnekleri göstermektedir. Atık su numuneleri İspanya ve Slovenya'daki atık su arıtma tesislerinden toplandı ve üç kopyadan en az ikisinde Ct 40'tan azsa pozitif olarak kabul edildi ve Ct'nin %5'ten daha az bir varyasyona sahip olması durumunda miktar belirleme geçerli kabul edildi. İspanya ve Portekiz'de iç ve dış hava örnekleri toplandı ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(RT-)qPCR yöntemleri kullanılarak mikrobiyal ve viral tespit ve miktar tayini, dikkate değer duyarlılıkları nedeniyle yaygın olarak kabul görmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler çevresel örnekleri analiz ederken çok sayıda zorlukla karşı karşıyadır. Atık su numuneleri, ölçümleri çarpıtabilecek ve yanıltıcı sonuçlar üretebilecek çok sayıda inhibitör madde içerir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve hassasiyeti artırmak için karmaşık bir protokol tasarlandı, tasarlandı ve uygulandı. Bu protokol, bilimsel literatürdeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların birbiriyle çelişen ekonomik çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Castilla y Leon Bölgesel Hükümeti ve FEDER programının mali desteğiyle gerçekleştirilmiştir (CLU 2017-09, UIC315 ve VA266P20 projeleri).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adaptör + A25 + A2: D19 + A2: D20 + A2 + A2: D19Oxford NanoporeEXP-AMII001Dizileme
AllPrep PowerViral DNA / RNA KitiQiagen28000-50RNA ekstraksiyon kiti
AMPure XPBeckman CoulterA63880PCR Saflaştırma, NGS Temizleme, PCR temizleme
ARTIC SARS-CoV-2 Amplikon PaneliIDT10011442SARS-CoV-2 genom amplifikasyonu
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SKütüphane hazırlığı
CENTRICON PLUS­ 70 10KDA.Fisher Scientific10296062Konsantrasyon filtreleri
CORIOLIS KOMPAKT HAVA ÖRNEKLEYICIBertin Technologies083-DU001Hava örnekleyici
Duran  laboratuvar şişeleriMerckZ305200-10EANumune Alma Şişeleri
Akış Hücresi (R9.4.1)Oxford NanoporeFLO-MIN106DSıralama
Genel laboratuvar sarf malzemeleri (tüpler, qPCR plakaları, vb.)
Ligasyon Sıralama KitiOxford NanoporeSQK-LSK109Dizileme
LunaScript  RT SuperMix KitiNEBE3010  cDNA sentezi
Mengovirüs ekstraksiyon kontrol KitiBiom & eacute; rieuxKMGKonsantrasyon kontrolü
Nalgene Genel Uzun Süreli Depolama Kriyojenik TüplerThermofisher5011-0012Numune saklama
Yerel Barkodlama Genişletme 1-12 (PCR içermezOxford NanoporeEXP-NBD104Barkodlama
NEBNext Ultra II Uç Onarımı/dA-Kuyruk ModülüNEBE7595DNA onarımı
NEBNext VarSkip Kısa SARS-CoV-2 Astar KarışımlarıNEBE7658SARS-CoV-2 genom amplifikasyonu
NEBNext  Hızlı Ligasyon Reaksiyon TamponuNEBB6058SDizilimi ve nbsp;
Fosfat tamponlu tuzlu suMerckP4474Toplama tamponu
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 1X), steril filtreliThermofisherJ61196. APHava numunelerinin elüsyonu
Q5  Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakat 2X Master MixNEBM0494Ssıcak başlangıç DNA polimeraz
Qubit RNA HS Test KitiThermofisherQ32852RNA kantitasyonu
SARS-CoV-2 RUO qPCR Astar & Prob KitiIDT10006713Primer-Prob karışımı ve qPCR pozitif kontrol
TaqPath 1 Adımlı RT-qPCR Master MixThermofisherA15299RT-qPCR kiti

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405(2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094(2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226(2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180(2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404(2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558(2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14(2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251(2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787(2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540(2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955(2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200(2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352(2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732(2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255(2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326(2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599(2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932(2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137(2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773(2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215(2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942(2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557(2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926(2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764(2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002(2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899(2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614(2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776(2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098(2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202(2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574(2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

At k Su EpidemiyolojisiHava rneklemesiViral RNA KantifikasyonuT m Genom DizilemeRT qPCRAt k Su KonsantrasyonuN kleik Asit EkstraksiyonuManyetik Ay rmaevresel S rveyans

İlgili makaleler