Yöntem makalesi

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

DOI:

10.3791/65062

⸱

17 Şubat 2023

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), in vitro ve in vivo hücreler tarafından salınan heterojen bir membran vezikülü popülasyonudur. Her yerde bulunmaları ve biyolojik bilgi taşıyıcıları olarak önemli rolleri, onları izolasyonları için güvenilir ve tekrarlayan protokoller gerektiren ilgi çekici çalışma nesneleri haline getirir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü araştırmalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır (uygun edinim gibi). Bu çalışma, küçük EV'lerin (MISEV 2018 terminolojisine göre) diferansiyel santrifüjlemeye dayalı tümör hücre hatlarının kültür süpernatantından izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksinlerle kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir. EV'lerin endotoksin kontaminasyonu, sonraki deneyleri önemli ölçüde engelleyebilir veya hatta gerçek biyolojik etkilerini maskeleyebilir. Öte yandan, gözden kaçan endotoksinlerin varlığı yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu, monositler de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücrelerine atıfta bulunurken özellikle önemlidir, çünkü monositler endotoksin kalıntılarına özellikle duyarlı bir popülasyon oluşturur. Bu nedenle, özellikle monositler, makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler veya dendritik hücreler gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışırken, EV'lerin endotoksin kontaminasyonu açısından taranması şiddetle tavsiye edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV'ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir 1,2. Dahası, EV'ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır3. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV'lerin izolasyonudur. En yaygın endotoksinlerden biri, gram-negatif bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan veçeşitli hücreler tarafından çok sayıda enflamatuar sitokinin salınması nedeniyle akut enflamatuar yanıta neden olabilen lipopolisakkarittir (LPS) 4,5. LPS, LPS bağlayıcı proteine bağlanarak bir yanıt indükler, ardından miyeloid hücreler üzerinde CD14 / TLR4 / MD2 kompleksi ile etkileşime girer. Bu etkileşim, MyD88 ve TRIF'e bağımlı sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar ve bu da nükleer faktör kappa B'yi (NFkB) tetikler. NFkB'nin çekirdeğe translokasyonu, sitokinlerin üretimini başlatır6. Monositler ve makrofajlar LPS'ye karşı oldukça hassastır ve LPS'ye maruz kalmaları enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin (örneğin, IL-6, IL-12, CXCL8 ve TNF-α) salınımına neden olur7,8. CD14 yapısı, benzer afiniteye sahip farklı LPS türlerinin bağlanmasını sağlar ve diğer toll-like reseptörleri (TLR'ler) için bir ko-reseptör görevi görür (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ve 9)6. EV'lerin monositler / makrofajlar üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmaların sayısı halaartmaktadır 9,10,11. Özellikle monositlerin, alt popülasyonlarının ve diğer bağışıklık hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek açısından bakıldığında, EV'lerde endotoksin varlığı ve hatta maskelenmiş varlığı büyük önem taşımaktadır12. EV'lerin endotoksinlerle göz ardı edilen kontaminasyonu, yanıltıcı sonuçlara yol açabilir ve gerçek biyolojik aktivitelerini gizleyebilir. Başka bir deyişle, monositik hücrelerle çalışmak, endotoksin kontaminasyonunun yokluğunda güven gerektirir13. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları su, ticari olarak elde edilen ortam ve serumlar, ortam bileşenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam eşyaları ve plastik eşyalar olabilir 5,14,15.

Bu nedenle, bu çalışma düşük endotoksin içeren EV'lerin izolasyonu için bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Protokol, endotoksinleri EV'lerden çıkarmak yerine, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğine dair basit ipuçları sağlar. Daha önce, endotoksinlerin, örneğin nanotıpta kullanılan mühendislik nanopartiküllerinden nasıl çıkarılacağına dair birçok protokol sunulmuştu; ancak, hiçbiri EV'ler gibi biyolojik yapılar için yararlı değildir. Nanopartiküllerin etkili depirojenasyonu, etanol veya asetik asit durulama, 3 saat boyunca 175 ° C'de ısıtma, γ ışınlama veya triton X-100 muamelesi ile gerçekleştirilebilir; ancak, bu prosedürler EV'lerin 16,17'nin tahrip olmasına yol açmaktadır.

Sunulan protokol, EV'lerin monositler üzerindeki etkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların aksine, EV'lerde endotoksin safsızlıklarından kaçınmaya odaklanan öncü bir çalışmadır9. Önerilen ilkelerin laboratuvar uygulamalarına uygulanması, EV'lerin klinikte terapötik ajanlar olarak potansiyel kullanımı göz önüne alındığında çok önemli olabilecek güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olabilir12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ultra santrifüj tüplerinin hazırlanması

  1. Steril, tek kullanımlık tüpler kullanın. Bu mümkün değilse, ultrasantrifüj tüplerini steril bir Pasteur pipet veya diğer tek kullanımlık aplikatörler kullanarak bir deterjanla yıkadıktan sonra tekrar kullanın. Ultra santrifüj tüplerinin bir tür santrifüjlü malzemeye (hücre kültürü süpernatan / serum / plazma) ve türlere (insan / fare / vb.)
  2. Bir deterjanla yıkadıktan sonra, ultra santrifüj tüplerini deiyonize, LPS içermeyen suyla 3x durulayın.
    NOT: Düşük kaliteli su kullanmayın.
  3. Ultra santrifüj tüplerini kurutun ve% 70 etanol ile doldurun. Gece boyunca dezenfeksiyon için tüpleri% 70 etanol ile bırakın. Etanol çıkarın ve tüpleri tekrar kurutun.
  4. Tüpleri ve kapakları sterilizasyon ambalajına yerleştirin ve sıkıca kapatın. Plazma veya gaz (etilen oksit) sterilizasyon yöntemini kullanın18,19. Sterilizasyon ambalajı içinde bulunan ultrasantrifüj tüplerini kuru bir yerde saklayın ve son kullanma tarihinden önce kullanın.
    NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki LPS seviyesinin ve EV'lerin izolasyonu için kullanılan suyun aylık olarak izlenmesini sağlayın. İzleme, tüpleri de içermelidir (örneğin, ultrasantrifüj tüplerinde gece boyunca oda sıcaklığında [RT] depolanan suyu [yıkama kontrolü] test ederek).

2. EV tükenmiş düşük endotoksin fetal sığır serumunun (EE-FBS) hazırlanması

  1. Ultra düşük endotoksin FBS kullandığınızdan emin olun (ticari olarak temin edilebilir; bakınız Malzeme Tablosu; <0.1 AB / mL).
  2. Bir şişe ultra düşük endotoksin FBS'yi bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca 56 ° C'de inkübe edin. Bu adım, kompleman sistemini devre dışı bırakmak için gereklidir.
  3. Devre dışı bırakılmış FBS'yi ultra santrifüj tüplerine pipet edin ve 4 °C'de 4 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı steril 50 mL'lik tüplere toplayın, kapak kontaminasyonunu önlemek ve tüpün halkasını ıslatmak için tüp başına 45 mL'yi aşmadığından emin olun.
  4. Bu şekilde hazırlanan EE-FBS serumunu -20 °C'de saklayınız. EE-FBS'deki LPS konsantrasyonunu kontrol edin (adım 6). LPS konsantrasyonu, ultrasantrifüjlemeden önceki ile aynı seviyede olmalıdır.

3. Hücre kültürü

  1. Bu çalışma için, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Kartal besiyerinde (DMEM) 4.5 g / L glikoz, L- glutamin, sodyum piruvat ve gentamisin (50 μL / mL) ile kültür SW480 ve SW620 hücre hatları, aseptik teknik kullanılarak 75cm2 kültür şişelerinde% 10 EE-FBS ile desteklenmiştir. SW480 ve SW620 için şişe başına sırasıyla yaklaşık 4,5 x 10 6 hücre ve 6,5 x 106 hücre tohumlayın.
  2. Süpernatantları haftada iki kez (şişe başına ~ 10 mL) hücreler tam akıcılığa ulaştığında toplayın (SW480 ve SW620 için şişe başına sırasıyla ~ 13.5 x 106 ve 20 x 106 hücre) ve bölün. Hücrelerin yaşayabilirliğinin% 99'dan az olmadığından ve hücrelerin% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de kültürlendiğinden emin olun.
  3. Süpernatantları hücre kültüründen uygun şekilde etiketlenmiş 15 mL tüplere toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için toplanan süpernatantları RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
  4. Süpernatantları dikkatlice toplayın, aspire edici döküntülerden kaçının, etiketli tüplere yerleştirin ve 4 ° C'de 12 dakika boyunca 3.200 x g'de tekrar santrifüj yapın.
  5. İkinci santrifüjleme adımından süpernatantları steril, etiketli 50 mL tüplere toplayın. Tüplerin kenarlarını ıslatmaktan kaçının. Süpernatant hacminin 45 mL'yi geçmediğinden ve tüplerin dikey olarak tutulduğundan emin olun.
  6. Tüpün kapağını steril şeffaf bir filmle sarın ve süpernatantları -80 ° C'de dikey konumda saklayın.
    NOT: Mycoplasma spp'nin aylık kontrolünü gerçekleştirin. ve taze kültür süpernatantlarında LPS kontaminasyonu (adım 6). Süpernatantlardaki endotoksin seviyesi 0.05 EU / mL'yi aşarsa, kontaminasyonun hangi aşamada meydana gelmiş olabileceğini doğrulayın ve işlemi en baştan başlatın. Hücre kültürünün Mycoplasma spp ile kontaminasyonu durumunda. tespit edilirse, EV'lerin bu tür süpernatantlardan izolasyonu durdurulmalıdır.

4. EV'lerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu

  1. 0.22 μm şırınga filtreleri ve uygun hacimde şırıngalar hazırlayın. Kültür süpernatantları (90 mL) ile iki tüp hazırlayın.
  2. Şırıngayı süpernatant ile doldurun ve filtreyi iğne adaptörüne takın. Doldurulmuş şırıngayı filtreyle birlikte 50 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. Piston flanşını itin ve ~ 90 mL filtrat toplayın.
  3. Filtreyi (7 mL) ultra santrifüj tüplerine pipet edin (uygun denge için her bir tüpe aynı hacmin pipetlenmesini sağlayın) ve 4 °C'de 2 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüjleyin.
    NOT: EV'lerin peletlenmesinin verimliliği, EV'lerin20'sinin daha iyi geri kazanılması için optimize edilmesi gereken birçok faktöre (örneğin, rotor tipi, k-faktörü, göç yolu uzunluğu, ortamın viskozitesi vb.) bağlıdır.
  4. Steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı atın. Uzun, filtrelenmiş pipet uçlarını kullanarak kalan peletleri toplayın ve iki ultrasantrifüj tüpünde toplayın. EV'leri durulamak için filtrelenmiş endotoksin içermeyen PBS ile 7 mL'ye kadar doldurun.
  5. PBS ile yeniden askıya alınmış peletleri 100.000 x g'de 4 °C'de 2 saat boyunca santrifüj edin. Steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı tamamen çıkarın ve EV'leri yeniden askıya almak için her iki tüpe de 200 μL filtrelenmiş, endotoksin içermeyen PBS ekleyin. Tüm EV'leri toplamak için EV'lerin peletini nazikçe pipetin.
  6. EV'lerin süspansiyonunu steril bir 1,5 mL test tüpüne aktarın (mümkünse, düşük proteinli bir bağlama tüpü kullanın). Nanopartikül izleme analizi (NTA) ve diğer amaçlar (örneğin, protein konsantrasyonu ölçümü) için bir seyreltme hazırlamak için EV süspansiyonunun 10 μL'sini koruyun.
  7. Üreticinin talimatlarına göre, NTA ile ölçümler için EV'leri filtrelenmiş PBS (1: 1.000) ile seyreltin. Kapağı steril şeffaf bir filmle sararak EV tüplerini sabitleyin. EV'leri -80 ° C'de saklayın.

5. Batı lekelenmesi ile spesifik belirteçlerin tespiti

  1. Numunelerdeki protein seviyesini belirleyin (örneğin, Bradford testi ile) ve numuneleri (20 μg) yükleme tamponu ile hazırlayın. 5 μL numune tamponu (4x) ve 2 μL numune indirgeyici maddeyi (10x) toplam 20 μL hacme karıştırarak yükleme tamponunu hazırlayın.
  2. SDS (% 10 -% 14) ile poliakrilamid jeller hazırlayın ve 20 μg EV'leri her bir kuyucuğa yükleyin.
  3. Elektroforezi çalışan tamponla (30 g Tris, 144 g glisin, 1 L başına %10 SDS) 150 V'ta 45 dakika boyunca çalıştırın.
  4. Proteinlerin jelden poliviniliden diflorür (PVDF) membranına yarı kuru transferini, 1 saat boyunca 25 V'ta Towbin tamponlu (1.51 g Tris, 7.2 g glisin, 0.5 L'de %10 metanol) bir transfer makinesinde gerçekleştirin.
  5. TBST tamponunda %1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke etmek için membranı TBST tamponuna (1 mL Ara, 1 L başına 100 mL Tris tamponlu salin (TBS 10x)) yerleştirin ve RT'deki rocker'da 1 saat inkübe edin.
  6. %1 BSA'ya seyreltilmiş (1:1.000) antikorlar, anti-CD9 1 (klon#D8O1A) veya anti-Alix1 (klon#3A9) ekleyin ve rocker üzerinde gece boyunca 4 °C'de membranla inkübe edin. Antikorları çıkarın ve membranı 10 dakika boyunca 10 mL 1x TBST ile 3x yıkayın.
  7. Membrandaki birincil antikora bağlı olarak, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare (seyreltme: 1: 2.000) ikincil antikoru ekleyin ve RT'deki rocker üzerinde 1 saat inkübe edin. antikorları çıkarın ve membranı 10 dakika boyunca 10 mL 1x TBST ile 3x yıkayın.
  8. 1 mL'lik bir çözelti elde etmek için substratı ve luminol'ü 1:1 oranında karıştırın. Çözeltiyi membran üzerine dökün. Membranı hemen görüntüleme sisteminin ölçüm odasına yerleştirin, kemilüminesans modülünü seçin ve ekranda protein bantlarını görselleştirin.

6. Limulus Amebosit Lizat testi (LAL) ile endotoksin düzeyinin ölçülmesi

  1. Üreticinin tavsiyesine göre endotoksin seviyesinin kromojenik LAL ölçümünü yapın. Kısaca, endotoksinin limulus amebosit lizatı (LAL) ile etkileşimine dayanan yöntemi kullanın. Bu yöntemin algılama sınırı 0,005 EU/mL'dir.
    NOT: LAL testi, sınırlamalarına rağmen, şu anda bilim veya tıpta kullanılan farklı çözeltilerde ve diğer ürünlerde endotoksin kontaminasyonunu tespit etmek ve ölçmek için standart yöntem olmaya devam etmektedir8. Bu kitin sınırlayıcı faktörü, yeniden yapılandırılan amebosit lizat çözeltisinin stabilitesidir, bu da sulandırıldıktan hemen sonra dondurulduğunda -20 ° C'de sadece 1 hafta stabil kalır.
  2. EV'lerin ve diğer numunelerin on kat seyreltilmesini ve 50 kat serum seyreltilmesini kullanın. Daha ileri deneyler için, sadece EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 AB / mL) ve LPS içermeyen kültür süpernatantları gibi düşük endotoksin reaktifleri kullanın.

7. EV örneklerinde prokaryotik 16S rRNA geninin tespiti

  1. DNA'yı EV örneklerinden izole edin. Reaktifleri ve izolasyon bölgesini aseptik tutmaya çalışın. DNA konsantrasyonunu ve kalitesini ölçün (örneğin, bir spektrofotometre kullanarak).
  2. Daha önce21'de açıklandığı gibi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin. PCR ürünlerini ultraviyole ışıkta (UV) görselleştirmek için ethidyum bromür veya SYBR yeşili ile% 1.5 agaroz jeli hazırlayın.
  3. Numunenin elektroforezini ve ağırlık işaretleyicisini TRIS-asetat-EDTA tamponu ile 75 V'ta 45 dakika boyunca çalıştırın. Görüntüleme sistemini kullanarak DNA bantlarını görselleştirin.

8. İnsan monosit modelinde stimülasyon için etkili LPS konsantrasyonunun belirlenmesi

  1. RPMI 1640'ta L-glutamin, glikoz ve% 2 EE-FBS ile desteklenmiş 2 x 106 monosit / mL monosit süspansiyonu hazırlayın. 96 delikli bir doku kültürü plakası22'nin kuyucuğu başına 50 μL süspansiyon ekleyin.
  2. Aşağıdaki son konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda LPS veya kültür ortamı ekleyin: 100 μL toplam hücre süspansiyonu hacminde 0 pg / mL (kontrol), 10 pg / mL, 50 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL ve 100 ng / mL. Her LPS konsantrasyonunun üçlüsünü yapın.
  3. Hücreleri 37 ° C'de 18 saat boyunca kültürleyin,% 5 CO2. Supernatan'ı topla.
  4. Süpernatantı 5 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün. Süpernatantları yeni tüplere aktarın. Toplanan süpernatantlardaki TNF8,23 ve IL-1023 konsantrasyonunu, üreticinin prosedürüne göre, bir akış sitometresi ile sitometrik boncuk dizisi (CBA) insan sitokin kiti ile ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol için ön koşul veya zorunlu bir adım, olası endotoksin kontaminasyonunun reaktiflerden dışlanmasıdır. FBS, DMEM, RPMI, PBS ve hatta ultrasantrifüj tüpleri gibi kullanılan tüm reaktifler endotoksin içermemelidir (<0.005 AB / mL). Endotoksin kontaminasyonu olmayan rejimin sürdürülmesi kolay değildir, çünkü örneğin, hücre kültürü için düzenli / standart serum zengin kaynağı olabilir (0.364 AB / mL; bakınız Tablo 1).

Bu protokol düşük endotoksin içeriğine sahip EV'le...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son birkaç yılda, uygun EV'lerin izolasyonu için yöntemler giderek daha önemli hale geldi ve örneğin güvenilir omikler ve fonksiyonel veriler elde etme bağlamında daha güvenilir analizleri mümkün kıldı24. Önceki araştırma deneyimlerine dayanarak, sadece izolasyon yönteminin türünün değil, aynı zamanda bu prosedür sırasındaki diğer koşulların da önemli olabileceği görülmektedir. EV tükenmiş FBS'nin kullanımı yaygın olarak bir gereklilik olarak kabul edilmektedir25,26

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak inşa edilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi, 2019/33/B/NZ5/00647 hibe numarası ile desteklenmiştir. Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü'nden Profesör Tomasz Gosiewski ve Agnieszka Krawczyk'e EV'lerde bakteri DNA'sının tespitinde paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  Alix (3A9) Fare mAb Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi2171
1250ul Filtre Üniversal Pipet Uçları, Şeffaf, Polipropilen, Pirojenik OlmayanGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Akış SitometrisiBD Biosciences
CBA İnsan Th1/Th2 Sitokin Kiti IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Tavşan mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi13174
ChemiDoc Görüntüleme SistemiBio-Rad Laboratuvarları A.Ş.
DMEM (Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta) Corning10-013-CV
ELX800NB, Üniversal Mikroplaka OkuyucuBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Sığır SerumuGibco16000044
Fetal Sığır Serumu Güney Amerika Ultra Düşük Endotoksin  Biyobatı  S1860-500
Gentamisin, 50 mg / mL  PAN – BiyoteknolojiP06-13100
Keçi Anti-Fare IgG- HRPSanta Cruz Biyoteknolojisc-2004
Keçi Anti-Tavşan IgG- HRPSanta Cruz Biyoteknolojisc-2005
Immun-Blot PVDF MembranBio-Rad Laboratories, Inc. 
Salmonella abortus equi S-formundan (TLRGRADE) LPS  Enzo Yaşam Bilimleri A.Ş.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Elektroforetik Transfer HücresiBio-Rad Laboratuvarları, Inc. 
Nanopartikül İzleme Analizi Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)  Canlandırıcı  NP0007
NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10x)  InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793şeffaf film
Mükemmel 100-1000 bp DNA MerdiveniEURxE3141-01 & nbsp;
PierceTM Kromojenik Endotoksin Quant KitiThermo ScientificA39552
PP Meşe Sırtı Tüpü, sızdırmazlık kapaklıThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Termal DöngüleyiciUygulamalı BiyosistemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERİSİ T-1270 rotorluSantrifüjThermo Scientific75000100
Alt Hücre GT Yatay Elektroforez SistemiBio-Rad Laboratories, Inc. 
SuperSignal West Pico PLUS Kemilüminesan YüzeyThermo Scientific34577
SW480 hücre hattıAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)
SW480 hücre hattıAmerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)
Şırınga filtresi 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer HücresiBio-Rad Laboratuvarları A.Ş.1703940Transfer makinesi
Transfer pipeti, 3,5 mLSARSTEDT86.1171.001
17001401162017717039301704401

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750(2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273(2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27(2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Endotoksin KontaminasyonuDiferansiyel Santrif jlemeNanopartik l zlemeWestern BlotLAL TestiMonosit Stim lasyonuCD9 Mark rAlix Mark r

İlgili makaleler