Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre dışı veziküller (EV'ler), in vitro ve in vivo hücreler tarafından salınan heterojen bir membran vezikülü popülasyonudur. Her yerde bulunmaları ve biyolojik bilgi taşıyıcıları olarak önemli rolleri, onları izolasyonları için güvenilir ve tekrarlayan protokoller gerektiren ilgi çekici çalışma nesneleri haline getirir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü araştırmalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır (uygun edinim gibi). Bu çalışma, küçük EV'lerin (MISEV 2018 terminolojisine göre) diferansiyel santrifüjlemeye dayalı tümör hücre hatlarının kültür süpernatantından izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksinlerle kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir. EV'lerin endotoksin kontaminasyonu, sonraki deneyleri önemli ölçüde engelleyebilir veya hatta gerçek biyolojik etkilerini maskeleyebilir. Öte yandan, gözden kaçan endotoksinlerin varlığı yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu, monositler de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücrelerine atıfta bulunurken özellikle önemlidir, çünkü monositler endotoksin kalıntılarına özellikle duyarlı bir popülasyon oluşturur. Bu nedenle, özellikle monositler, makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler veya dendritik hücreler gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışırken, EV'lerin endotoksin kontaminasyonu açısından taranması şiddetle tavsiye edilir.
Giriş
MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV'ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir 1,2. Dahası, EV'ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır3. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV'lerin izolasyonudur. En yaygın ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Ultra santrifüj tüplerinin hazırlanması
- Steril, tek kullanımlık tüpler kullanın. Bu mümkün değilse, ultrasantrifüj tüplerini steril bir Pasteur pipet veya diğer tek kullanımlık aplikatörler kullanarak bir deterjanla yıkadıktan sonra tekrar kullanın. Ultra santrifüj tüplerinin bir tür santrifüjlü malzemeye (hücre kültürü süpernatan / serum / plazma) ve türlere (insan / fare / vb.)
- Bir deterjanla yıkadıktan sonra, ultra santrifüj tüplerini deiyonize, LPS içermeyen suyla 3x durulayın.
NOT: Düşük kaliteli su kullanmayın. - Ultra santrifüj tüplerini kurutun ve% 70 etanol ile doldurun. Gece boyunca dezenfeksiyon için tüpler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol için ön koşul veya zorunlu bir adım, olası endotoksin kontaminasyonunun reaktiflerden dışlanmasıdır. FBS, DMEM, RPMI, PBS ve hatta ultrasantrifüj tüpleri gibi kullanılan tüm reaktifler endotoksin içermemelidir (<0.005 AB / mL). Endotoksin kontaminasyonu olmayan rejimin sürdürülmesi kolay değildir, çünkü örneğin, hücre kültürü için düzenli / standart serum zengin kaynağı olabilir (0.364 AB / mL; bakınız Tablo 1).
Bu protokol düşük endotoksin içeriğine sahip EV'le.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Son birkaç yılda, uygun EV'lerin izolasyonu için yöntemler giderek daha önemli hale geldi ve örneğin güvenilir omikler ve fonksiyonel veriler elde etme bağlamında daha güvenilir analizleri mümkün kıldı24. Önceki araştırma deneyimlerine dayanarak, sadece izolasyon yönteminin türünün değil, aynı zamanda bu prosedür sırasındaki diğer koşulların da önemli olabileceği görülmektedir. EV tükenmiş FBS'nin kullanımı yaygın olarak bir gereklilik olarak kabul edilmektedir25,26
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak inşa edilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi, 2019/33/B/NZ5/00647 hibe numarası ile desteklenmiştir. Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü'nden Profesör Tomasz Gosiewski ve Agnieszka Krawczyk'e EV'lerde bakteri DNA'sının tespitinde paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alix (3A9) Fare mAb | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 2171 | |
| 1250ul Filtre Üniversal Pipet Uçları, Şeffaf, Polipropilen, Pirojenik Olmayan | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Akış Sitometrisi | BD Biosciences | ||
| CBA İnsan Th1/Th2 Sitokin Kiti II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Tavşan mAb | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 13174 | |
| ChemiDoc Görüntüleme Sistemi | Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş. | ||
| DMEM (Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Üniversal Mikroplaka Okuyucu | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Sığır Serumu Güney Amerika Ultra Düşük Endotoksin | Biyobatı | S1860-500 | |
| Gentamisin, 50 mg / mL | PAN – Biyoteknoloji | P06-13100 | |
| Keçi Anti-Fare IgG- HRP | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-2004 | |
| Keçi Anti-Tavşan IgG- HRP | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membran | Bio-Rad Laboratories, Inc. | ||
| Salmonella abortus equi S-formundan (TLRGRADE) LPS | Enzo Yaşam Bilimleri A.Ş. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Elektroforetik Transfer Hücresi | Bio-Rad Laboratuvarları, Inc. | ||
| Nanopartikül İzleme Analizi | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X) | Canlandırıcı | NP0007 | |
| NuPAGE Numune Azaltıcı Ajan (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | şeffaf film |
| Mükemmel 100-1000 bp DNA Merdiveni | EURx | E3141-01 & nbsp; | |
| PierceTM Kromojenik Endotoksin Quant Kiti | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Meşe Sırtı Tüpü, sızdırmazlık kapaklı | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Termal Döngüleyici | Uygulamalı Biyosistem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERİSİ T-1270 rotorlu | SantrifüjThermo Scientific | 75000100 | |
| Alt Hücre GT Yatay Elektroforez Sistemi | Bio-Rad Laboratories, Inc. | ||
| SuperSignal West Pico PLUS Kemilüminesan Yüzey | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 hücre hattı | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) | ||
| SW480 hücre hattı | Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC) | ||
| Şırınga filtresi 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer Hücresi | Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş. | 1703940 | Transfer makinesi |
| Transfer pipeti, 3,5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
Kaynaklar
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Yáñez-Mó, M., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
