Yöntem makalesi

Hücre Kültürü için Fetal Fare İskelet Kasından 3D Desellülarize Matrislerin Hazırlanması

DOI:

10.3791/65069

⸱

3 Mart 2023

 ,  ,  , 
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, fetal fare iskelet kasının desellülarize matrislerini elde etmek için bir desellülarizasyon protokolü optimize edilmiştir. C2C12 miyoblastlar bu matrisleri kolonize edebilir, çoğalabilir ve farklılaşabilir. Bu in vitro model, kas distrofileri gibi iskelet kası hastalıkları bağlamında hücre davranışını incelemek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matris (ECM), hücreler için yapısal destek sağlamada ve çeşitli hücresel süreçler için önemli olan sinyalleri iletmede çok önemli bir rol oynar. İki boyutlu (2B) hücre kültürü modelleri, hücreler ve ECM arasındaki karmaşık etkileşimleri aşırı basitleştirir, çünkü tam bir üç boyutlu (3B) desteğin olmaması hücre davranışını değiştirebilir ve in vivo süreçleri anlamak için onları yetersiz hale getirebilir. ECM kompozisyonundaki eksiklikler ve hücre-ECM etkileşimleri, çeşitli farklı hastalıklara önemli katkıda bulunur.

Bir örnek, fonksiyonel laminin 211 ve 221'in yokluğunun veya azalmasının, doğumda veya hemen sonrasında tespit edilebilen ciddi hipotoniye yol açabileceği LAMA2-konjenital kas distrofisidir (LAMA2-CMD). Hastalığın bir fare modelini kullanan önceki çalışmalar, başlangıcının fetal miyogenez sırasında meydana geldiğini göstermektedir. Bu çalışma, doğal mikro çevreyi taklit ederek, kas hücreleri ve fetal kas ECM arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin veren bir 3D in vitro model geliştirmeyi amaçlamıştır. Bu protokol, E18.5 fare fetüslerinden diseke edilen, hipotonik tampon, anyonik deterjan ve DNaz ile muamele edilen derin sırt kaslarını kullanır. Elde edilen desellülarize matrisler (dECM'ler), doğal dokuya kıyasla test edilen tüm ECM proteinlerini (laminin α2, toplam lamininler, fibronektin, kollajen I ve kollajen IV) korudu.

C2C12 miyoblastları bu dECM'lerin üzerine tohumlandığında, çoğalmalarını ve farklılaşmalarını destekleyen dECM'lere nüfuz ettiler ve kolonize oldular. Ayrıca, C2C12 hücreleri ECM proteinleri üretti ve dECM'ler içindeki nişlerinin yeniden şekillenmesine katkıda bulundu. Bu in vitro platformun kurulması, LAMA2-CMD'nin başlangıcında yer alan süreçleri çözmek için umut verici yeni bir yaklaşım sağlar ve ECM ile iskelet kası hücreleri arasındaki iletişimdeki eksikliklerin hastalığın ilerlemesine katkıda bulunduğu diğer iskelet kası hastalıklarına uyarlanma potansiyeline sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı matriks (ECM), hücresel olmayan bileşenlerini temsil eden dokuların önemli bir bileşenidir. Bu üç boyutlu (3B) yapı sadece hücreler için fiziksel destek sağlamakla kalmaz, aynı zamanda organizmaların gelişiminde yer alan biyokimyasal süreçlerde de çok önemli bir rol oynar1. Dokuya özgü bir ECM'nin oluşumu, çeşitli hücre içi ve hücre dışı uyaranlardan etkilenen hücreler ve nişleri arasındaki karmaşık etkileşimlerin bir sonucu olarak, gelişim sırasında ortaya çıkar. ECM, zamansal-mekansal bir şekilde kimyasal ve mekanik yeniden düzenlemelere tabi tutulan ve hücre kaderini doğrudan etkileyen oldukça dinamik bir yapıdır2. ECM'nin en dikkat çekici özelliklerinden biri, fonksiyonel çeşitliliğidir, çünkü her doku ECM, içerdiği hücrelere uyarlanmış farklı topolojiler ve özellikler sağlayan benzersiz bir molekül kombinasyonu gösterir1.

ECM sinyalizasyonu ve desteği, gelişim ve homeostaz için çok önemlidir ve bozulduğunda çoklu patolojik durumlara yol açabilir 3,4. Bir örnek, konjenital müsküler distrofinin en yaygın şekli olan LAMA2 eksikliği konjenital distrofidir (LAMA2-CMD). LAMA2 geni, laminin 211 ve laminin 221'de bulunan laminin α2 zincirini kodlar ve mutasyona uğradığında LAMA2-CMD 5'e yol açabilir. Laminin 211, iskelet kası liflerini çevreleyen bazal membranda bulunan ana izoformdur. Laminin 211 anormal veya eksik olduğunda, bazal membran ve kas hücreleri arasındaki bağlantı bozulur ve hastalığın başlangıcına yol açar6. LAMA2-CMD'li hastalar, LAMA2 genindeki mutasyon tipine bağlı olarak hafif ila şiddetli bir fenotip gösterir.

Laminin α2 proteininin işlevi etkilendiğinde, hastalar doğumda ciddi kas hipotonisi yaşayabilir ve kronik inflamasyon, fibroz ve kas atrofisi geliştirerek yaşam beklentisinin azalmasına neden olabilir. Bugüne kadar hedefe yönelik herhangi bir tedavi geliştirilmemiştir ve tedavi yaklaşımları hastalığın semptomlarını hafifletmekle sınırlıdır7. Bu nedenle, bu hastalığın başlangıcında rol oynayan altta yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması, uygun terapötik stratejilerin geliştirilmesi için çok önemlidir 6,8. LAMA2-CMD için bir model olan dyW fare9'u kullanan önceki çalışmalar, hastalığın başlangıcının utero'da, özellikle fetal miyogenez10 sırasında başladığını göstermektedir. Fetal miyogenez defektinin nasıl ortaya çıktığının daha iyi anlaşılması, LAMA2-CMD için yeni terapötik yaklaşımlar üretmede bir oyun değiştirici olacaktır.

İn vitro sistemler, hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için kontrollü bir ortam sağlar, ancak 2D kültür modelleri doğal dokuların karmaşıklığından yoksundur. Dokuların desellülarizasyonu, 2D modellere ve mühendislik / sentetik iskelelere kıyasla doğal hücre mikro ortamını daha doğru bir şekilde taklit eden doku ve gelişim aşamasına özgü asellüler ECM iskeleleri üretir. Desellülarize matrisler (dECM'ler), konakçı dokunun moleküler ve mekanik ipuçlarını koruma potansiyeline sahiptir ve bu da onları in vivo süreçleri anlamak için daha iyi alternatif modeller haline getirir11.

Hücresizleştirme için kullanılabilecek çeşitli teknikler, reaktifler ve koşullar vardır12,13. Bu çalışmada, Silva ve ark.14,15 tarafından tanımlanan fetal fare kalbi için bir desellülarizasyon protokolü, fetal fare iskelet kasına uyarlanmış ve test edilen tüm ECM bileşenlerini (laminin α2, toplam lamininler, fibronektin, kollajen I ve kollajen IV) koruduğu bulunmuştur. Protokol üç adımdan oluşur: ozmotik şok (hipotonik tampon) ile hücre lizisi, plazma membranı çözünmesi ve protein ayrışması (% 0.05 sodyum dodesil sülfat [SDS]) ve DNA'nın enzimatik yıkımı (DNaz tedavisi). Bildiğimiz kadarıyla bu, fare fetal iskelet kasının hücre deselülizasyonu için kurulan ilk protokoldür.

Bu 3D in vitro sistemi LAMA2-CMD'yi incelemek için kullanmak için, hücresizleştirmeden sonra laminin α2 zincirini korumak çok önemlidir. Bu nedenle, farklı deterjanların (SDS ve Triton X-100) ve konsantrasyonların (% 0.02,% 0.05,% 0.1,% 0.2 ve% 0.5) test edildiği bir optimizasyon protokolü uygulanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Laminin α2 proteininin hücre çıkarılması ve korunması için en uygun seçenek %0.05 SDS olarak bulunmuştur. İyi kurulmuş bir miyoblast hücre hattı olan C2C12 hücreleri16,17, dECM'leri tohumlamak için kullanıldı. Bu hücreler dECM'yi istila eder, çoğalır ve bu iskelelerin içinde farklılaşarak yeni ECM proteinlerini sentezler. Bu 3D in vitro modelin başarılı üretimi, fetal miyogenezde, LAMA2-CMD'nin başlangıcında yer alan moleküler ve hücresel süreçleri anlamak için yeni bir yaklaşım sunar ve ECM ile iskelet kası hücreleri arasındaki iletişimin bozulduğu diğer kas hastalıklarına genişletilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm metodolojiler, Lizbon Üniversitesi Fen Fakültesi Hayvan Refahı Komitesi (ORBEA) ve Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) tarafından onaylanmıştır ve 2010/63/EU sayılı Avrupa Direktifine uygundur.

1. Hücre çözme tamponlarının ve reaktiflerinin hazırlanması

NOT: Hücre çözme protokolü sırasında kullanılan tüm çözeltiler otoklavlama ile sterilize edilmeli ve aksi belirtilmedikçe 3 aya kadar saklanmalıdır.

  1. Demineralize suya (dH 2 O) 137 mM'de sodyum klorür (NaCl), 2,68 mM'de potasyum klorür (KCl), 8,1 mM'de potasyum-dihidrojen fosfat (KH 2 PO 4) ve 1,47mM'de disodyum hidrojen-fosfat dihidrat (Na2HPO4) ekleyerek 10x fosfat tamponlu salin (10x PBS) hazırlayın ve pH'ı 6,8'e ayarlayın. 1x PBS üretmek için 900 mL demineralizeH2O'ya 100 mL 10x PBS ekleyin. Otoklav yapın ve oda sıcaklığında (RT) saklayın. Steril penisilin / streptomisin stok çözeltisi (10.000 U / mL penisilin ve 10 mg / mL streptomisin [kalem / strep]) kullanımdan önce% 1'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
  2. 1.21 g Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz) ve 1 g etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 1 L dH2O (10 mM Tris baz% 0.1 EDTA) içinde çözerek hipotonik tamponu hazırlayın. Çözünene kadar manyetik bir karıştırıcı kullanın ve pH'ı NaOH / HCl ile 7.8'e ayarlayın. otoklavlama ile sterilize edin ve RT'de saklayın.
  3. Hipotonik yıkama tamponunu, 1.21 g Tris bazını 1 L dH2O (10 mM Tris baz) içinde çözerek hazırlayın. Çözünene kadar manyetik bir karıştırıcı kullanın ve pH'ı NaOH / HCl ile 7.8'e ayarlayın. otoklav ve RT'de saklayın.
  4. %0,05 SDS arıtma çözeltisi üretmek için 100 mL hipotonik yıkama tamponuna 0,05 g sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyerek anyonik deterjan tedavisini hazırlayın. 0,22 μm membran filtreden süzün. RT'de 1 aya kadar saklayın.
    NOT: SDS otoklavlama sırasında çökeldiği ve bozunduğu için SDS çözeltisi otoklavlanmamalıdır.
  5. DNaz arıtma çözeltisini, 1.21 g Tris bazını 0.5 mLdH2O içinde çözerek hazırlayın ve 1 mL 1 M magnezyum klorür (MgCl2) ekleyin. NaOH / HCl. Otoklav ile pH'ı 7.8'e ayarlayın ve RT'de saklayın. kullanımdan önce DNase I ekleyin (50 U / mL).

2. Örnek toplama

NOT: Çalışmada vahşi tip C57/BL6 fareler kullanılmıştır. Tüm teknikler steril koşullar altında laminer akış başlığında gerçekleştirildi.

  1. Gebeliğin embriyonik gününde (E) 18.5 yetişkin hamile dişi fareleri, izofluran inhalasyonu ve ardından servikal çıkık kullanarak ötenazi yapın. Fetüsleri çıkarmak için fareleri terminal diseksiyona tabi tutun.
    1. Farenin karnına% 70 etanol püskürtün.
    2. Cerrahi forseps ve makas kullanarak, alt karın bölgesindeki bir deri kıvrımını kaldırın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için U şeklinde bir kesi yapın18.
    3. E18.5 fetüslerini içeren uterus boynuzlarını yumurta kanallarını ve serviksi keserek toplayın ve hemen% 1 kalem / strep 18 ile buz gibi soğuk1x PBS ile bir Petri kabına aktarın.
    4. Fetüsleri uterustan ve ekstraembriyonik dokulardan hızla çıkarın ve makas kullanarak başlarını keserek ötenazi yapın18.
  2. Her seferinde bir fetüsü buz gibi soğuk 1x PBS'li bir Petri kabına aktarın. Bir stereo mikroskop kullanarak cildi çıkarın ve uzuvları kesin. Ventral taraftan, göğüs kafesini kesin ve sternumu ve altta yatan organları çıkarın.
  3. Fetal gövde dorsal tarafını yukarı çevirin. Vertebral kolonun servikal kısmını, dorsal yağ birikintilerini ve derin sırt kaslarının üstündeki bağ dokusunu çıkarın.
  4. Göğüs kafesini sabitlemek için cerrahi forseps kullanın ve derin sırt kaslarını bir mikro neşter10 kullanarak çevredeki dokulardan dikkatlice kazıyın ve ayırın. Bu prosedür, fetüs başına iki kas parçasının (sol ve sağ), her ikisi de esas olarak longissimus ve iliocostalis kaslarından oluşan, transversospinalis ve levator costarum kaslarının bir kısmının dahil edilmesiyle sonuçlanır.
  5. Kas örneklerini kısa süreli depolama için 4 ° C'de (<1 hafta) veya daha uzun süreler için -80 ° C'de% 1 kalem / strep ile% 1 PBS'de saklayın.
    NOT: En iyi sonuçlar için taze toplanmış numuneler kullanın. Uzun süreler boyunca (>3 ay) dondurulmuş numuneler daha düşük hücre desellülarizasyon verimliliği ve daha fazla protein bozulması göstermektedir. Desellülarizasyon deneyleri için Epaxial kas kütleleri kullanılmıştır, ancak diğer kaslar (örneğin, uzuv kasları) aynı protokolü kullanarak desellülarizasyon için işlenebilir.

3. Fetal iskelet kası desellülarizasyonu

NOT: Tüm teknikler steril koşullar altında laminer akış davlumbazında gerçekleştirilmiştir. Ayrıntılı bir şematik gösterim için bkz: Şekil 1A. Tüm adımlar, aksi belirtilmedikçe, 25 ° C'de 120 mm (165 rpm) çapında bir yörüngesel çalkalayıcıda ajitasyonla gerçekleştirildi. Kullanmadan önce çözeltilere% 1 kalem / strep ekleyin. Çözeltileri çıkarırken, numunenin pipete sıkışmasını önlemek için dikkatlice aspire edin.

  1. 1. Gün - Epaxial kas kütlelerinden yaklaşık 2 mm x 1 mm x 1 mm (~ 3.5 mg) doku parçaları hazırlayın. 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna% 1 kalem / strep ile 3 mL hipotonik tampon ekleyin ve kuyucuk başına bir tam kas dokusu parçası ekleyin.
    1. Doku parçalarını hipotonik tamponda 18 saat (gecede) (O / N) ajitasyonla inkübe edin.
  2. 2. Gün - İnce uçlu bir pipet kullanarak hipotonik tamponu aspire edin ve numuneleri her seferinde 3 mL 1x PBS ile 3 x 1 saat yıkayın.
    1. Numuneleri 24 saat boyunca 3 mL% 0.05 SDS deterjan çözeltisi ile ajitasyonla inkübe edin.
      NOT: (KONTROL NOKTASI) SDS inkübasyonundan sonra, numuneler görünüşte şeffaf olmalıdır. Numuneler jelatin benzeri bir kıvam gösterir ve bu nedenle sıvıları çıkarırken pipete yapışmaya daha yatkındır.
  3. 3. Gün - SDS deterjan çözeltisini ince uçlu bir pipet kullanarak çıkarın ve doku parçalarını her seferinde 3 mL hipotonik yıkama tamponu ile 3 x 20 dakika karıştırarak yıkayın.
    NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Numuneler hipotonik yıkama tamponunda 4 °C'de 18 saat (O/N) boyunca muhafaza edilebilir. Yıkama adımları sırasında SDS'nin iyi bir şekilde çıkarıldığından emin olun, çünkü artık SDS sitotoksik olabilir.
    1. Doku parçalarını 37 ° C'de ajitasyon ile 2 mL DNaz çözeltisi ile 3 saat boyunca inkübe edin.
    2. DNaz çözeltisini ince uçlu bir pipet kullanarak çıkarın ve doku parçalarını her seferinde 3 mL 1x PBS ile 3 x 20 dakika yıkayın. Son olarak, O / N'yi ajitasyonla yıkayın (60 rpm).
      NOT: DNaz tedavisinden sonra, DNA kalıntılarının varlığı nedeniyle dECM'ler yapışkan hale gelir. Bu nedenle, dikkatli yıkama gereklidir.
    3. dECM'leri hücreselleşmeye kadar (<1 hafta) 4 °C'de %1 kalem/strep ile 1x PBS'de saklayın. Diğer kullanımlar için -80 °C'de saklayın.

4. Hücresizleştirme kalite değerlendirmesi

NOT: Desellülarizasyon sonrası artık hücre içeriğinin varlığını değerlendirmek için DNA nicelleştirme, DAPI/metil yeşili boyama ve faloidin boyama yapıldı. İmmünohistokimya ve western blot analizleri, desellülarizasyondan sonra anahtar ECM proteinlerinin tutulumunu değerlendirmek için yapıldı.

  1. dECM'de bulunan DNA'nın nicelleştirilmesi
    NOT: DNA'nın varlığını tespit etmek için dECM'ler doğal doku ile karşılaştırılmalıdır.
    1. Hücre sökümden önce, yüksek hassasiyetli bir dijital terazide 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü tartın. Kas örneğini tüpe aktarmadan önce, kalan tüm 1x PBS'yi bir kağıt havlu kullanarak çıkarın. Tüpü numuneyle tartın. Denklemi kullanarak numunelerin ıslak ağırlığını hesaplayın (1):
      Numuneıslak ağırlığı =numuneli ağırlık tüpü - ağırlıkboş tüp (1)
    2. Bölüm 3'te açıklanan protokolü izleyerek örnekleri hücre dışı bırakın.
    3. Numuneleri 2 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.
      NOT: Numuneler, DNA ekstraksiyonu ve nicelleştirilmesine kadar -20 ° C'de tutulabilir.
    4. Spin kolon tabanlı bir kit kullanarak dECM'lerin ve doğal doku örneklerinin DNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin. Sindirim tamponunu üreticinin talimatlarına göre ekleyin.
    5. Numuneleri bir boncuk değirmeninde her seferinde 2,5 dakika boyunca iki kez homojenize edin (montajları çevirerek) tüp başına bir tungsten karbür boncuk kullanarak (soğutulmuş tüp montajları kullanın).
    6. Proteinaz K ekleyin ve 56 ° C'de yavaş ajitasyonla O / N'yi inkübe edin.
    7. Üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi protokolle devam edin.
    8. Üretici tarafından sağlanan tamponla boşaltın ve DNA verimini artırmak için her seferinde 4 ° C'de ≥6.000 x g'de 2 x 1 dakika santrifüj yapın.
      NOT: DNA, nicelleştirmeye kadar -20 ° C'de saklanabilir.
    9. Üreticinin talimatlarını izleyerek floresan dsDNA tespit kiti kullanarak numunelerde bulunan DNA'yı sayısallaştırın.
    10. DNA içeriğini, numunenin orijinal ıslak ağırlığının miligramı başına DNA'nın nanogramları olarak normalleştirin.
    11. İki kuyruklu bir Öğrencinin t-testini kullanarak verileri analiz edin ve ortalamanın (SEM) ortalama ± standart hatası olarak ifade edin.
  2. İmmünohistokimya
    NOT: Çözelti 1, 2 ve 3 ve fiksatif çözelti kullanımdan önce hazırlanmalıdır ve 6 aya kadar dondurulmuş halde tutulabilir. Kullanılan tüm antikorlar ve boyalar ve ilgili seyreltmeler Tablo 1.
    1. Çözümlerin hazırlanması
      1. 2 g paraformaldehit (PFA), 8 g sakkaroz ve 24 μL 1 M CaCl 2 ila 77 mL 0.2 M Na 2 HPO 4 ve 23 mL 0.2 M NaH 2 PO 4 ekleyerek fiksatif çözelti hazırlayın,dH 2O ekleyerek 200 mL'lik nihai hacme pH'ı7.4'e ayarlayın.
      2. 13.5 g Na 2 HPO 4 ve 3.2 g NaH 2 PO4 ila 1 L dH2O ekleyerek 0.12 M fosfat tamponu hazırlayın.
      3. 100 mL 0.12 M fosfat tamponuna 4 g sakkaroz ekleyerek çözelti 1'i hazırlayın.
      4. 100 mL 0.12 M fosfat tamponuna 15 g sakkaroz ekleyerek çözelti 2'yi hazırlayın.
      5. 100 mL 0.12 M fosfat tamponuna 15 g sakkaroz ve 7.5 g jelatin ekleyerek çözelti 3'ü hazırlayın. Jelatin eriyene kadar 37 °C'de ısıtın.
      6. Metil yeşili stok çözeltisi hazırlayın (dH 2 O içinde çözünmüş%2metil yeşil toz)19.
    2. İmmün tespiti
      1. Fiksatif çözeltiyi kullanarak numuneleri 4 °C'de en az 4 saat sabitleyin.
      2. Numuneleri 1x PBS ile 10 dakika boyunca 2x yıkayın.
      3. O/N'yi veya 1 günden fazla bir süreyi çözelti 1'de 4 °C'de tutun.
      4. O/N'yi yıkayın ve 4 °C'de çözelti 2'de 1 günden fazla tutun. Numunelerin RT'ye ısınmasına izin verin.
      5. 37 ° C'de 3 çözelti 3'te 3 saat inkübe edin. Daha sonra kullanmak üzere ekstra çözelti 3'ü 37 ° C'de tutun.
      6. Alüminyum folyoda kalıp küçük (2 cm x 1 cm x 1 cm) kaplar. Kalıplanmış kaba ince bir çözelti 3 tabakası yerleştirin ve ayarlanmasına izin verin. Numuneleri katılaşmış çözelti 3 üzerine yerleştirin ve ılık çözelti 3 ile örtün. Örnekleri yönlendirin ve katılaşmalarına izin verin. Katılaştırılmış çözelti 3 üzerindeki konumu renkli bir kalemle işaretleyin.
      7. Kapları kuru buz soğutmalı veya sıvı azot soğutmalı isopentan yüzeyine yerleştirerek dondurun.
      8. Optimum kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiğini kullanarak, numuneleri içeren dondurulmuş jelatin küpleri kriyostat montajına sabitleyin.
      9. Dondurulmuş jelatin küpleri bölümlendirin ve doku bölümlerini slaytlara aktarın. 60 dakika kurumaya bırakın.
      10. Bölümlerin etrafındaki bir çizgiyi izlemek için hidrofobik bir işaretleyici kullanın.
      11. Slaytları 1x PBS'de 3 x 10 dakika yıkayın.
      12. Kesitleri %1 sığır serum albümini (BSA), %1 keçi serumu ve %0.05 Triton X-100 ile 1x PBS (blokaj çözeltisi) içinde 30 dakika boyunca seyreltilmiş olarak örtün (bloke adımı).
      13. Bloke edici çözeltideki birincil antikorları seyreltin ve bölümleri örtün. Bölümlerin kurumasını önlemek için O/N'yi 4 °C'de kapalı bir kutuda, nemli kağıtla inkübe edin.
      14. Slaytları 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
      15. İkincil antikorları bloke edici çözelti içinde seyreltin ve bölümleri örtün. Karanlıkta RT'de 1,5 saat inkübe edin.
        NOT: Florofor bozulmasını önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının.
      16. Slaytları 4x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın.
        NOT: Güçlü bir arka plan mevcut olduğunda daha yüksek PBS konsantrasyonu kullanılabilir.
      17. Slaytları DAPI çözeltisine (5 μg / mL 1,4-diazabicyclo-2,2,2-oktan % 0,1 Triton X-100 / 1x PBS) her biri 30 s boyunca daldırın.
      18. 1x PBS'de durulayın.
      19. Bölümleri solma önleyici ortama (1x PBS:gliserol [1:9] içinde 50 mg/mL n-propil-gallat) monte edin ve bir kapak kayması ile kapatın. Bir floresan mikroskobunda gözlem ve görüntü elde edene kadar 4 ° C'de saklayın20.
        NOT: In toto immünohistokimya deneyleri için, aynı protokol (bkz. adım 4.2.2.12-4.2.2.18) kullanılmıştır, ancak numuneler daha önce RT'de 3 saat boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş% 4 PFA'da sabitlenmiştir. Kullanılan tüm antikorlar ve boyalar ve bunların ilgili seyreltmeleri Tablo 1'de listelenmiştir. Numuneler daha sonra çelik halkalarla ayrılmış iki kapak parçası arasında solma önleyici ortama monte edildi, balmumu ile yapıştırıldı ve konfokal mikroskop21 kullanılarak 100 μm görüntü yığınları elde edildi.
  3. Batı leke analizi
    NOT: Kullanılan tüm antikorlar ve ilgili seyreltmeler Tablo 1.
    1. Çözümlerin hazırlanması
      1. 2x SDS-PAGE yükleme tamponunu, 80 mL 100 mM Tris baz çözeltisine 20 mL gliserol, 4 g SDS ve 0,2 mL bromofenol mavisi ekleyerek hazırlayın. pH'ı 6,8'e ayarlayın. Kullanmadan önce taze ditiyotreitol (DTT) ekleyin.
      2. Tris tamponlu tuzlu su yıkama tamponunu, 2.4 g Tris bazı, 8.8 g NaCl ve 1 mL ara-20 ila dH2O ilave ederek Tween 20 (TBST) çözeltisi ile hazırlayın.
      3. 1 L dH 2 O'ya 30,2 g Tris baz, 144,2 g glisin ve 10 g SDS ekleyerek 10x çalışan arabelleği (RB) hazırlayın. Kullanmadan önce, 1x RB (çalışma çözeltisi) hazırlamak için 900 mL dH2O'ya 100 mL 10x RB ekleyin.
        NOT: 10x RB RT'de birkaç ay saklanabilirken, 1x RB farklı çalıştırmalarda yeniden kullanılabilir.
      4. 800 mLdH2O'ya 5,82 g Tris baz, 2,93 g glisin ve 0,5 g SDS ekleyerek transfer tamponunu (TB) hazırlayın. Bileşenler çözüldükten sonra, 200 mL metanol ekleyin. 4 °C'de soğutun.
        NOT: TB her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    2. Protein ekstraksiyonu
      1. E18.5 farelerden epaxial kasları toplayın ve hemen yeni eklenmiş DTT (100 mM DTT) ile 2x SDS-PAGE yükleme tamponu içeren bir mikrosantrifüj tüpüne (2 mL) yerleştirin. E18.5 dECM'yi aynı şekilde işleyin.
      2. Tüp başına bir tungsten karbür boncuk ekleyin. Her seferinde 2,5 dakika boyunca bir boncuk değirmeninde 2 kat homojenize edin (montajları çevirin).
      3. Bir ultrason banyosunda 5 dakika boyunca örnekleri sonikleştirin.
      4. Numuneleri 50 °C'de 10 dakika ısıtın.
      5. Numuneleri 12.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
      6. Süpernatantı taze bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      7. Bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak proteini sayısallaştırın.
      8. Daha sonraki kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
    3. Poliakrilamid jel elektroforezi
      1. Prekast akrilamid gradyan jeli kullanın (%4-%20)
      2. Jeli elektroforez tankına monte edin. Tarağı dikkatlice çıkarın. Elektroforez tankında görüntülenen çizgiye kadar 1x RB ekleyin. Kuyuların RB ile dolu olduğundan emin olun.
      3. Kuyucuklara numune başına 100 μg protein yükleyin. 12 μL yüksek molekül ağırlıklı protein standardı yükleyin.
      4. Sabit voltajla toplam 100 dakika çalıştırın (150 V'ta 10 dakika ve 185 V'ta 90 dakika).
    4. Aktarmak
      1. Jel çalışırken filtre pedlerini ve süngerleri soğutulmuş TB (4 °C) ile ıslatın.
      2. Poliviniliden diflorür membranlarını jelin boyutuna göre kesin. Onları metanol ile aktive edin ve dH2O ile yıkayın TB'ye batırın.
      3. Transfer kasetini süngerler, filtre pedleri, jeller ve aktif membranlarla üreticinin talimatlarına göre monte edin.
      4. Kaseti soğutulmuş TB'yi içeren elektroforez tankına yerleştirin (bir buz yatağında). Soğutma ünitesini ekleyin. 100 V'ta 90 dakika boyunca çalıştırın.
      5. Transferden sonra, transfer kalitesini değerlendirmek için Coomassie mavisi bir ikame ile lekeleyin.
    5. İmmün tespiti
      1. Blokaj çözeltisini hazırlayın (% 5 az yağlı süt ile TBST). Membranları RT'de 1 saat boyunca ajitasyonla inkübe edin.
      2. TBST ile 3 x 5 s durulayın.
      3. O / N membranlarını, TBST'de% 2 BSA ve% 0.02 sodyum azid (membran başına 3 mL) ile seyreltilmiş birincil antikorlarla soğuk bir odada (4 ° C) ajitasyonla inkübe edin.
      4. Ertesi gün, TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
      5. Membranları, RT'de 1 saat boyunca% 5 az yağlı süt (her membran için 5 mL) ile TBST'de seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikorlarla inkübe edin.
      6. Membranları TBST 3 x 5 dk ile yıkayın. Algılama adımına kadar TBST'de tutun.
      7. Ticari olarak temin edilebilen bir geliştirme kiti kullanarak proteini görselleştirin. Üreticinin talimatlarına göre algılama reaktifleri ekleyin. Grupların görüntülerini alın.
      8. Membran başına birden fazla antikoru test etmek için, algılama adımından sonra, TBST kullanarak eski antikorları üç yıkama (her biri 5 dakika) ile sıyırın ve 4.3.5.2-4.3.5.7 adımlarını tekrarlayın.

Tablo 1: İmmünohistokimya ve batı leke analizinde kullanılan antikorlar ve boyalar ve ilgili seyreltmeler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.10,22

5. Hücre dışı matrislerde hücre kültürü

NOT: Tüm teknikler laminer akış davlumbazında steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Tüm inkübasyonlar 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile gerçekleştirildi.

  1. Hücre kültürü ortamını, yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 kalem / strep (tam kültür ortamı) ile desteklenmiş, stabil glutamin ve sodyum piruvat (DMEM) ile hazırlayın.
  2. dECM'leri laminer akış başlığında %1 kalem/strep ile 1x PBS'de bir Petri kabına yerleştirin ve mikro neşter ve cımbız kullanarak yaklaşık 500 μm x 500 μm x 250 μm'lik parçalara ayırın.
    NOT: dECM'ler yumuşak bir dokuya sahiptir ve bu nedenle mikro neşterle kesmek yerine yaklaşık olarak aynı boyutta parçalara ayırmak için cımbız kullanmak genellikle daha kolaydır.
  3. Parçaları, daha önce 37 ° C'ye ısıtılmış 200 μL tam kültür ortamına sahip 96 delikli bir plakaya (kuyucuk başına üç veya dört parça) aktarın. İnkübatörde 2 saat inkübe edin.
  4. Alt konfluent (~% 70) C2C12 hücreleri ile tohumlanmış bir T25 şişesine 500 μL tripsin ekleyin. 1 mL tam ortamda tekrar askıya alın.
  5. 10 μL Tripan mavisi boyaya 10 μL resüspansiyon ekleyin ve bir hemositometreye yükleyin. Hücre numarasını sayın ve hesaplayın ve hücre canlılığını onaylayın.
  6. Ortamı dECM'leri içeren 96 delikli plakadan aspire edin ve 50.000 canlı C2C12 hücresi içeren 200 μL tam kültür ortamı ekleyin.
  7. 2 gün boyunca inkübe edin ve daha sonra cımbız kullanarak, dECM'leri (hücrelerle birlikte) 400 μL tam kültür ortamına sahip 48 delikli bir plakaya aktarın. Her 2 günde bir, dECM'lerin kuyunun dibinden ayrılmasını önlemek için ortamı bir mikropipetle dikkatlice aspire edin ve 8. güne kadar taze ortam ekleyin.
    NOT: Matrisler, dECM'lere C2C12 hücre yapışmasını teşvik etmek için 96 delikli plakalarda 2 gün bekletilir ve daha sonra besinlerle daha büyük hacimli bir ortama erişim sağlamak için 48 delikli bir plakaya aktarılır. dECM'ler kuyuların dibine yapışmalıdır.
  8. Farklılaşma deneyi için, tüm kültür ortamını 8. günde farklılaştırma ortamı (DMEM% 2 at serumu ve% 1 kalem / strep ile desteklenmiş) ile değiştirin, ardından 12. güne kadar 4 gün boyunca farklılaşma ortamında inkübasyon yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desellülarizasyon protokolünün amacı, doğal dokunun bileşimine çok benzeyen dECM'ler üretmektir. Desellülarizasyon sürecinin etkinliğini belirlemek için, doku morfolojisinin incelenmesi, DNA seviyelerinin ölçülmesi, F-aktin için boyama ve immünohistokimya ve batı lekeleme teknikleri kullanılarak anahtar ECM bileşenlerinin analizi dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Spesifik olarak, iskelet kası dokularının beş ana ECM bileşeni analiz edildi.

Protokol boyunca, örnekler görünüşte...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ECM, tüm dokularda bulunan ve hücre davranışını ve fonksiyonunu düzenlemede çok önemli bir rol oynayan karmaşık bir makromolekül ağıdır2. ECM, hücrelerin bağlanması için fiziksel bir iskele görevi görür ve proliferasyon, motilite, farklılaşma ve apoptoz gibi hücresel süreçleri aktif olarak modüle eden ipuçları sağlar. Bu nedenle, ECM'nin uygun şekilde oluşturulması ve sürdürülmesi hem gelişim hem de homeostaz1 için gereklidir.

2D hücre kültürü mo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; sözleşme no. 23049), MATRIHEALTH projesi ve UIDB/00329/2020 tarafından finanse edilen cE3c birimi tarafından finanse edilmiştir. MATRIHEALTH Projesi'ni desteklemeyi seçen bağışçımız Henrique Meirelles'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Portekiz BioImaging Platformunun bir düğümü olan Fen Fakültesi Mikroskopi Tesisi'nin altyapılarından yararlanmıştır (referans PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ve Luís Marques'e görüntü edinme ve işleme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Son olarak, teknik destek için Marta Palma'ya ve cömert katkıları için araştırma ekibimize teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Düz, TC, SterilAbdos LabwareP21021
4 & prime;, 6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorürMerckD8417
4 – %20 Mini-PROTEAN TGX Prekast JelBio-Rad4561093
48 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Düz, TC, SterilAbdos LabwareP21023
96 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Düz, TC, SterilAbdos LabwareP21024
Sığır Serum Albümini, Fraksiyon VNZYtechMB04601
BX60 floresan mikroskobuOlympus
Kriyostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM yüksek glikoz, sodyum piruvat ile stabil glutaminBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Kan ve Doku Kiti Qiagen69506
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Merck108418
Fetal sığır serumuBiowestS1560-500
İnce uçlu transfer pipetiThermoFisher15387823
Keçi serumuBiowestS2000-100
Hera Muhafız Akış KabiniHeraeus
Heracell 150 CO2 İnkübatörThermo Scientific
HiMark Önceden Boyanmış Protein Standardıİnvitrojen
At Serumu, Yeni Zelanda menşeliGibco16050122
HRP-&alfa;- Tavşan IgGabcamab205718
HRP-&alfa;- Sıçan IgGabcamab205720
HRP-&alfa;- Fare IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Metil YeşilSigma-Aldrich67060
MM400 Doku LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spektrofotometre ThermoFisher
Paraformaldehit, %16 w/v aq. soln., metanol içermezAlfa Aesar043368-9M
Penisilin-Streptomisin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polistiren Petri kabı 60x15mm havalandırma delikleri ile (steril)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitiThermo ScientificQ32851
Qubit ve ticaret; 3 FlorometreInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo mikroskopLeica
Sodyum Dodesil SülfatMerck11667289001
Süper Don ve reg; Artı yapışma slaytları,Thermo Scientific631-9483
SuperSignal West, Pico PLUS, Kemilüminesan Substrat,Thermo Scientific15626144
TCS, SPE konfokal mikroskopLeica
Tris-(hidroksimetil), aminometano (Tris tabanı) ≥ %99VWR Kimyasalları28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Tripan Mavisi Çözeltisi,Gibco15250061
Tripsin-EDTA (%0.05) (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (%50 Çözelti)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membran rulosu (0.22 & mikro; m)AdvanstaL-08024-001
& alfa ; -Kollajen Iabcamab21286
& alfa ; - Kollajen IVMilliporeAB756P
& alfa ; -Kollajen IVSanta Cruz Biyoteknolojisc-398655
& alfa ; -FibronektinSigmaF-3648
& alfa ; -Laminin ve alfa; 2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Fare Alexa 488Moleküler ProblarA11017
α-Fare Alexa 568Moleküler ProblarA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-fosfo-histon 3Merk Millipore06-570
α-Tavşan Alexa 568Moleküler ProblarA21069
α-Tavşan Alexa 488Moleküler ProblarA11070
α-Rat Alexa 488Moleküler ProblarA11006
, , , DPBS'de %0.4

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142(2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9(2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59(2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436(2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924(2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769(2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101(2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fetal Fare KasEkstrasell ler Matriksskelet Kas ECMKas H cresi DiferansiyasyonuC2C12 MiyoblastlarLaminin Alfa kiKollajen IDNaz Uygulamas

İlgili makaleler