Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi
Bu makalede
Özet
Özet
Mitokondriyal fonksiyon - oksidatif fosforilasyon ve reaktif oksijen türlerinin oluşumu - hem sağlık hem de hastalıkta kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesi biyomedikal araştırmalarda esastır. İskelet kası, özellikle atlar gibi çok yüksek aerobik kapasiteye sahip hayvanlarda sağlam bir mitokondri kaynağıdır ve bu da onları mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için ideal konular haline getirir. Bu makale, farklı mitokondriyal durumlar altında substratları oksitleme kapasitesini ölçmek ve mitokondriyal solunumun farklı elementlerinin göreceli kapasitelerini belirlemek için eşzamanlı florometri ile yüksek çözünürlüklü respirometrinin kullanımını göstermektedir. Tetrametilrhodamine metilester, eşzamanlı oksijen akışı birimi başına üretilen nispi membran potansiyelini hesaplayarak mitokondrinin nispi verimliliğinin hesaplanması da dahil olmak üzere, substrat oksidasyonundan kaynaklanan mitokondriyal membran potansiyelinin üretimini göstermek için kullanılır. ADP'nin ATP'ye dönüşümü, magnezyum için adenilatların farklı afiniteleri nedeniyle reaksiyon odasındaki magnezyum konsantrasyonunda bir değişikliğe neden olur. Bu nedenle, magnezyum yeşili, ATP sentez hızını ölçmek için kullanılabilir ve oksidatif fosforilasyon verimliliğinin daha fazla hesaplanmasına izin verir (fosforilasyonun oksidasyona oranı [P / O]). Son olarak, hidrojen peroksit ile kombine edildiğinde bir floresan ürün (resorufin) üreten Amplex UltraRed'in kullanımı, mitokondriyal solunum sırasında reaktif oksijen türlerinin üretiminin nicelleştirilmesine ve ROS üretimi ile eşzamanlı solunum arasındaki ilişkiye izin verir. Bu teknikler, mitokondriyal fizyolojinin çeşitli simüle edilmiş koşullar altında sağlam bir şekilde nicelleştirilmesine izin verir, böylece bu kritik hücresel bileşenin hem sağlığa hem de hastalığa katkısına ışık tutar.
Giriş
Ökaryotik hücrelerin mitokondrileri, hücreler tarafından iş ve bakım için kullanılan ATP'nin çoğunu üretir1. ATP'nin mitokondriyal üretiminde önemli bir adım, oksijenin suya dönüştürülmesidir ve bu nedenle mitokondri ve ilişkili hücrelerin metabolik kapasitesi, oksijen tüketiminin ölçülmesiyle sıklıkla ölçülür2. Bununla birlikte, mitokondriyal fizyoloji, basit oksijen tüketimi sürecinden daha karmaşıktır ve bu son noktaya güvenmek, mitokondriyal fonksiyonun ve işlev bozukluğunun hücresel sağlık üzerindeki etkisinin eksik bir değerlendirmesini sağlar. Mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu, sadece oksijen tüketimi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma Oklahoma Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada temsili sonuçları üretmek için dört safkan jel (17.5 ± 1.3 yıl, 593 ± 45 kg) kullanılmıştır.
1. İskelet kası biyopsi örneğinin alınması
- Hafif sedasyon altındayken 12 G University College Hospital (UCH) biyopsi iğnesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak ve daha önce yayınlanmış bir raporu takiben lokal anestezi kullanarak, semitendinosus kasının (veya diğer ilgili kasların) merkezinden iskelet kası biyopsileri (steril tekniği izleyin) elde edin11. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Önerilen referans durumu, sağlıklı bir sedanter safkan (zorunlu egzersiz nedeniyle artan zindelik yok) ve postüral kasın merkezinden toplanan, mitokondri bakımından zengin tip I iskelet kası liflerinin yüksek bir yüzdesini içeren ve dinlenme metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edilen taze bir kas örneğidir (yani, 38 ° C ve pH 7.0). Bu koşullar altında, araştırmacı L N değerleri 2.71 ± 0.90, PN değerleri 62.40 ± 26.22, PN+S değerleri 93.67 ± 34.76 ve PS değerleri 46.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yüksek çözünürlüklü respirometrenin standart çıkışına floresan sinyallerin eklenmesi, mitokondriyal fizyoloji hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak floresan sinyalinin titiz kalibrasyonu kalite verileri için kritik öneme sahiptir. MgG kullanımı için orijinal protokoller, magnezyum-adenilat ayrışma sabitleri hesaplanırken üretilen kalibrasyon eğrilerinin sonraki tahlillere uygulanabileceğini düşündürmektedir4; Bununla birlikte, MgG'den gelen floresan sinyali, bu yaklaşım için tahlilden tahlilden .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu makale ile ilgili çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, John ve Debbie Oxley Atçılık Spor Hekimliği Kürsüsü ve Grayson Jokey Kulübü Araştırma Vakfı'nın cömert desteğini kabul etmek istiyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Yaşam Teknolojileri | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Kalsiyum karbonat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Yazılımı O2K flororespirometreyi çalıştırmak için | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Yaban turpu peroksidaz | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hidrojen peroksit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Testten önce günlük olarak taze yapılmalıdır |
| İmidazol | Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnezyum klorür hekzahidrat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnezyum Yeşil | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitokondriyal izolasyon kiti | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K flororespirometre | Oroboros Inc | anda tam test spektrumunu çalıştırmak için birden fazla ünite gerekir. | |
| Fosfokreatin | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potasyum hidroksit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potasyum laktobiyonat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potasyum fosfat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Piruvat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Testten önce günlük olarak taze yapılmalıdır |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Süksinat | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sükroz | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Süperoksit dismutaz | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurin | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titrasyon pompası | Oroboros Inc | ||
| Titrasyon şırıngaları | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biyopsi iğnesi | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Çeşitli boyutlarda mevcuttur |
Kaynaklar
- Wilson, D. F. Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization. Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).
- Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introdu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
