At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Ökaryotik hücrelerin mitokondrileri, hücreler tarafından iş ve bakım için kullanılan ATP'nin çoğunu üretir¹. ATP'nin mitokondriyal üretiminde önemli bir adım, oksijenin suya dönüştürülmesidir ve bu nedenle mitokondri ve ilişkili hücrelerin metabolik kapasitesi, oksijen tüketiminin ölçülmesiyle sıklıkla ölçülür². Bununla birlikte, mitokondriyal fizyoloji, basit oksijen tüketimi sürecinden daha karmaşıktır ve bu son noktaya güvenmek, mitokondriyal fonksiyonun ve işlev bozukluğunun hücresel sağlık üzerindeki etkisinin eksik bir değerlendirmesini sağlar. Mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu, sadece oksijen tüketiminin değil, aynı zamanda ATP ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin de değerlendirilmesini gerektirir.

Anahtar mitokondriyal fonksiyonların ek ölçümleri, spesifik floroforların kullanımı yoluyla solunum ölçümü ile eşzamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Tetrametilrhodamine methylester (TMRM), mitokondriyal matriste mitokondriyal transmembran voltaj potansiyeli ile orantılı olarak biriken ve bu birikim nedeniyle floresan yoğunluğunda bir azalmaya neden olan^katyonik bir florofordur 3. TMRM, mitokondriyal membran potansiyelindeki göreceli değişikliklerin bir göstergesi olarak kullanılabilir veya floresan sinyalinin mV'ye dönüştürülmesine izin veren sabitleri belirlemek için ek deneylerle transmembran voltajındaki hassas değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Magnezyum yeşili (MgG), Mg^{2 +} ile bağlandığında floresan olan bir florofordur ve magnezyum iki değerli katyon⁴ için ADP ve ATP'nin diferansiyel afinitesine dayanan ATP sentezinin ölçümleri için kullanılır. Araştırmacılar, MgG floresanındaki değişiklikleri ATP konsantrasyonundaki bir değişikliğe dönüştürmek için spesifik analitik koşullar altında hem ADP hem de ATP için spesifik afinite / ayrışma sabitlerini (Kd) belirlemelidir. Amplex UltraRed (AmR), mitokondriyal solunum sırasında hidrojen peroksit ve diğer ROS üretimini ölçmek için kullanılan florofordur⁵. H2_O2ve AmR (yaban turpu peroksidaz tarafından katalize edilen) arasındaki reaksiyon, 530 nM'de floresan yoluyla tespit edilebilen resorufin üretir. Bu testlerin her biri, mitokondriyal fizyolojinin ilgili yönlerinin eşzamanlı ölçümlerini sağlamak için gerçek zamanlı mitokondriyal solunum tahlillerine ayrı ayrı eklenebilir, böylece solunum ve mitokondriyal çıktı arasında doğrudan bir bağlantı sağlanır.

Atlar, kısmen at iskelet kasının çok yüksek mitokondriyal içeriğinden dolayı çok yüksek oranda kütleye özgü oksijen tüketimi yeteneğine sahiptir ve bu dokuyu mitokondriyal fizyolojiyi incelemek için oldukça alakalı hale getirir. Yüksek çözünürlüklü respirometrinin gelişmesiyle birlikte, bu yeni teknolojiyi kullanan çalışmalar, at iskelet kası mitokondrisinin hem atların olağanüstü egzersiz kapasitesine hem de iskelet kası hastalıklarının patofizyolojisine katkılarını tanımlamaya yardımcı olmuştur 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalar özellikle avantajlıdır, çünkü bu dokunun büyük miktarlarının elde edilmesi terminal değildir. Bu nedenle, at denekleri sadece mitokondriyal fonksiyonun tam karakterizasyonu için yeterli doku sağlamakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal fizyolojiye yüksek kaliteli, mekanik çalışmalar için uzunlamasına kontroller olarak da hizmet eder. Bu nedenle, at iskelet kasında mitokondriyal fizyolojinin daha sağlam bir karakterizasyonunu sağlamak için mitokondriyal membran potansiyelini, ATP sentezini ve bu dokudaki oksijen tüketiminin ölçümünü tamamlayan ROS üretimini ölçmek için ek testler geliştirilmiştir.

Bu çalışma Oklahoma Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada temsili sonuçları üretmek için dört safkan jel (17.5 ± 1.3 yıl, 593 ± 45 kg) kullanılmıştır.

1. İskelet kası biyopsi örneğinin alınması

1. Hafif sedasyon altındayken 12 G University College Hospital (UCH) biyopsi iğnesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak ve daha önce yayınlanmış bir raporu takiben lokal anestezi kullanarak, semitendinosus kasının (veya diğer ilgili kasların) merkezinden iskelet kası biyopsileri (steril tekniği izleyin) elde edin¹¹.
2. Biyopsi örneklerini derhal buz gibi soğuk biyopsi taşıma ortamı çözeltisi (2.77 mM CaK 2-EGTA, 7.23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazol, 20 mM taurin, 50 mM K-MES, 0.5 mM ditiyotreitol, 6.56 mM MgCl₂, 5.77 mM ATP ve 15 mM fosfokreatin, pH 7.1'e ayarlanmış; bkz. Analiz için laboratuvara nakliye.
   NOT: Biyopsi nakil ortamının hazırlanmasıyla ilgili özel talimatlar için Doerrier ve ^ark.15'e bakınız.
3. Mitokondrileri, üreticinin talimatlarına göre ticari bir kit kullanarak biyopsi örneklerinden izole edin (bkz. Son depolama tamponu, respirometri testinin bir parçası olan ADP, ATP ve süksinat gibi substratlar içermemelidir.
4. Mitokondri izolasyonu için kullanılan 100 mg kas başına 80 μL süspansiyon ortamı (225 mM mannitol, 75 mM sakkaroz ve 1 mM EGTA; bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak izole mitokondrinin son peletini yeniden askıya alın.
5. Biyopsi prosedüründen mitokondri izolasyonuna kadar olan süreyi en aza indirin ve numuneleri yüksek çözünürlüklü respirometrelere eklenene kadar işleme adımları boyunca 0-4 ° C'de tutun.
   NOT: Ön çalışmalar, izole mitokondri süspansiyonlarının 0-4 ° C'de tutulduğunda yaklaşık 2 saat sonra fonksiyonel kapasitesini kaybetmeye başladığını bulmuştur.

2. Yüksek çözünürlüklü respirometrenin kurulumu

1. Yüksek çözünürlüklü respirometreler, mitokondriyal solunum ve ilişkili süreçleri ölçmek için kullanılır. Respirometreyi kontrol etmek, sensörleri kalibre etmek ve ham verileri toplamak için üretici tarafından sağlanan yazılım kontrol programını kullanın (bkz. Her test koşulu için örnekleri yinelenen olarak analiz edin.
   NOT: Her durumda, bu protokolde açıklanan önerilen titrasyonlar ve nihai reaktif konsantrasyonları 2 mL'lik bir sspirometri odasına dayanmaktadır.
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek ditionitin seri titrasyonuyla her 2-4 haftada bir_O2 sensörünün arka planını_O2 akısını ve sıfır noktasını belirleyin. Kalibrasyon tekrarlanana kadar sonraki tahliller için bu kalibrasyon sabitlerini koruyun.
   NOT: O2'nin mitokondriye difüzyon sınırlamasını önlemek için hiperoksinin (250-500 μM) gerekli olduğu geçirgen kas lifleri^11,12,13,16 kullanılarak daha önce yayınlanmış prosedürlerin aksine^, izole mitokondri 50-200 μM _O2 aralığı kullanılarak değerlendirilebilir. Bu, mitokondriyal süspansiyonu eklemeden önce (yani, günlük tek noktalı kalibrasyonu takiben) solunum ortamının oda havasıyla dengelenmesine izin vererek elde edilebilir. Benzer şekilde, solunum odasının yeniden oksijenlenmesi, oksijen konsantrasyonunu istenen seviyeye yükseltmek için yeterli ortam oksijeni respirometri ortamına çözünene kadar odayı açarak gerçekleştirilebilir.
3. Respirometre odalarını magnezyumsuz ortamlarla doldurun (0,5 mM EGTA, 60 mM K-laktobiyonat, 20 mM taurin, 10 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES, 110 mM sakkaroz ve 1 g/L sığır serum albümini [BSA] esas olarak yağ asidi içermez, pH 7,1'e ayarlanır; bkz.
   NOT: Solunum ortamının hazırlanmasıyla ilgili özel talimatlar için Komlodi ve ^ark.17'ye bakınız.
   1. At iskelet kasının bazal sıcaklığını temsil etmek için alet inkübasyon sıcaklığını 38 ° C'ye ayarlayın ve respirometre odasının dibinde dönen manyetik bir karıştırıcı kullanarak solunum ortamının karıştırılmasını 800 rpm'ye ayarlayın.
   2. Floresan sensörlerle etkileşimi önlemek için oda aydınlatmasını kapatın.
   3. Oksijen elektroduna 800 mV polarizasyon voltajı ile enerji verin ve elde edilen sinyali 1 kazanç ayarıyla yükseltin.
   4. Oksijen konsantrasyonunu her 2 saniyede bir kaydedin, oksijen akışını önceki 40 s (20 veri noktası) boyunca oksijen ölçümünün negatif eğimi olarak hesaplayın ve pmol x ^s-1 x mL inkübasyon çözeltisi olarak raporlayın.
4. Ortamın oda havasıyla dengelenmesini sağlayarak oksijen sensörünü kalibre edin. Yüksek çözünürlüklü respirometre ve standart atmosferik oksijen konsantrasyonu ile ölçülen barometrik basınca dayanarak referans oksijen kısmi basıncını hesaplayın.

3. TMRM kullanılarak mitokondriyal membran potansiyelinin ölçülmesi

1. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Yeşil" floresan sensörleri (530 nm baskın dalga boyu) kullanın. Sensörlere 400-500 mV'de enerji verin; Ortaya çıkan sinyal 1:1.000'lik bir kazançla güçlendirilir.
   NOT: Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için belirli ayarlar optimize edilmelidir.
2. Mitokondri ilavesinden önce TMRM (2 μM'lik nihai konsantrasyon için 4 μL 1 mM çözelti; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
3. Mitokondri ilavesinden önce, eklenen florofor miktarına (mM) karşı floresan sinyalinin (voltaj) basit iki noktalı kalibrasyonunu kullanarak floresan sinyalini kalibre edin.
   NOT: Bu sinyali kalibre etmek için makine kontrol yazılımındaki floresan sinyal kalibrasyon işlevini kullanın. Floresan probundan gelen ham sinyalin, kalibrasyonun ikinci noktasını kaydetmek için stabilize edilmesi 30 dakika veya daha fazla sürebilir.
4. Respirometri titrasyon protokolünün tamamlanmasından sonra, mitokondriyal membran potansiyelinin tamamen çöktüğünü gösteren TMRM floresan sinyalinde daha fazla artış gözlenmeyene kadar birkaç ayırma maddesi titrasyonu (karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon; titrasyonda 2 μL) vererek TMRM sinyalinin son kalibrasyonunu gerçekleştirin (Şekil 1).
   NOT: Bu floresan sinyal değeri, 0 mV transmembran potansiyeline eşit kabul edilir ve respirometri titrasyon protokolü sırasında kaydedilen bağıl membran potansiyel değerleri için referans noktası olarak kullanılır.

4. Magnezyum yeşili (MgG) kullanarak ATP üretiminin ölçülmesi

1. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Mavi" floresan sensörleri (465 nm baskın dalga boyu) kullanın. Bu sensörlere, sensörün doğrusal aralığında beklenen sinyali yakalamak için ayrı ayrı cihazlar için enerji verin.
2. Mitokondri ilavesinden sonra, ancak herhangi bir substrat eklenmeden önce MgG floresan sinyalinin kimyasal kurulumunu ve kalibrasyonunu gerçekleştirin. MgG'ye bağlanmak için Mg 2+ ile rekabet edebilecek katyonları (özellikle Ca²⁺) şelatlamak için respirometri odasına 8 μL 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin, ardından solunum odasına 4 μL 1 mM MgG (1.1 μM) ekleyin.
3. Ham floresan sinyalini 100 mM MgCl 2'lik 10 x 2 μL sıralı titrasyonlarla kalibre ederek floresan sinyalinin stabilizasyonu için titrasyonlar arasında 1 dakika bekleyin (Şekil 2).
   NOT: Tahlilin tamamlanmasının ardından ve makinenin üreticisi ve ilgili yazılım tarafından sağlanan şablonlar kullanılarak çevrimdışı olarak tamamlanan bu işlem, floresan sinyaline (beklenen r² > 0.98) ikinci dereceden bir magnezyum konsantrasyonu eğrisi üretir ve bu eğri, respirometri odasına eklenen bilinen miktarda ADP ve karşılık gelen ATP¹¹ konsantrasyonunu belirlemek için daha önce belirlenen K_d değerleri ile kullanılacaktır.
4. Protokol boyunca ATP konsantrasyonunun zaman içindeki eğimi olan ATP sentezinin hızını belirleyin (Şekil 3).

5. Amplex UltraRed (AmR) kullanarak ROS'un mitokondriyal üretiminin ölçülmesi

1. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için "Yeşil" floresan sensörleri (530 nm baskın dalga boyu) kullanın. Sensörlere 300-400 mV'da enerji verin; Ortaya çıkan sinyal 1:1.000'lik bir kazançla güçlendirilir. Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için özel ayarları optimize edin.
   NOT: MgCl 2 olmadan solunum ortamı kullanılıyorsa, AmR testi için reaktifler eklenmeden önce bu eklenmelidir (1-3 μM MgCl₂ üretmek için 100 mM MgCl_2'nin 20-60 μL'si).
2. Mitokondri ilavesinden önce AmR testinin kimyasal kurulumunu ve ilk kalibrasyonunu gerçekleştirin. Reaksiyona müdahale edebilecek katyonları şelatlamak için 30 μmol DTPA (6 μL 5 mM çözeltisi) ekleyin, ardından süperoksit dismutaz (süperoksit anyonları reaktif oksijen üretiminin daha kapsamlı bir tespiti_{için H2O2'ye}dönüştürmek için 5.000 U / mL'lik bir stok çözeltisinin 2 μL'si), yaban turpu peroksidazı (500 U / mL stok çözeltisinin 5 μL'si), ve respirometri odasında sırasıyla 5 U/mL, 1 U/mL ve 10 μM üretmek için Amplex UltraRed (10 mM stok çözeltisinin 2 μL'si) (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Floresan sinyalinin stabilize olmasına izin verin, ardından yaklaşık 5 dakika arayla iki kez 0,2 μmol hidrojen peroksit (günde taze yapılan 40 μM çözeltinin 5 μL'si) ekleyin.
   NOT: H2_O2'nin iki titrasyonundan önceki ve sonraki floresan sinyali, sistemin üç noktalı doğrusal kalibrasyon eğrisini (beklenen r² > 0,95) sağlar ve eğimi, floresan sinyali ile H2_O2'ninüretimi (veya eklenmesi) arasındaki ilişkiyi raporlamada sistemin genel tepkisini yansıtır. Bu sinyali kalibre etmek için makine kontrol yazılımındaki floresan sinyal kalibrasyon işlevini kullanın.
4. Tahlil boyunca ek iki noktalı kalibrasyonlar (günlük olarak taze yapılan 40 μM'lik bir çözeltinin 5 μL'si) gerçekleştirin, böylece respirometrinin kimyası tahlil boyunca değiştikçe tahlilin tepkisinin ayarlanmasına izin verin, bu kalibrasyon noktalarının spesifik zamanlaması araştırmacının takdirine bağlı olarak (Şekil 4).

6. Mitokondriyal solunum ölçümü

1. Her 2 mL inkübasyon odasına 15 μL izole mitokondri süspansiyonu (adım 1.4) ekleyin, böylece sonuçlar 18.75 mg kasın mitokondriyal verimini temsil eder. Kuluçka odasını kapatın. Numunenin homojen bir süspansiyonunu korumak için numuneyi her titrasyonun arasında vorteks yapın.
2. Herhangi bir substrat eklenmeden önce artık oksijen tüketimini (ROX) ölçün. Bu değeri (tipik olarak 0,2 pmol O₂ x s-1 x ^mL-1'den az), protokolün tamamlanmasından sonra substrat/uncoupler/inhibitör titrasyon (SUIT) protokolü^11'deki her adımın oksijen tüketim değerlerinden çıkarın.
   NOT: Hem oksijen sensöründen hem de floresan sensöründen gelen sinyallerin en az 1 dakika boyunca stabilize olmasına izin verilmesi çok önemlidir (birincil sensör sinyallerinin kararlı hesaplanan eğimi ile değerlendirildiği gibi), çünkü genel solunum durumu titrasyonlar tarafından güvenilir sonuçlar elde etmek için değiştirilir. Bu, tüm titrasyon adımları için geçerlidir.
3. At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonunun ilk karakterizasyonuna izin veren genel amaçlı bir SUIT kullanın. Nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) üretmek ve Kompleks I (L_N) yoluyla oksitlenen NADH tarafından desteklenen fosforilasyon olmayan (sızıntı) solunumu uyarmak için her odaya sırasıyla piruvat (5 μL 2 M sulu çözelti), glutamat (10 μL 2 M sulu çözelti) ve malat (10 μL 0,4 M sulu çözelti) (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4).
4. Kompleks I (P_N) yoluyla fosforilasyon solunumunu uyarmak için ADP (20 μL 500 mM sulu çözelti; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
5. Kompleks I ve Kompleks II (P_{N + S}) kombinasyonu yoluyla fosforilasyon solunumu üretmek için süksinat (20 μL 1 M sulu çözelti; bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
   NOT: Hem Kompleks I hem de Kompleks II yoluyla solunumun kombinasyonu ile, oksijen tüketimi, inkübasyon ortamında çözünen oksijenin çoğunu tüketecek kadar yüksek olabilir. O2 konsantrasyonu 50 μM'nin altına düşerse, ölçülen_O2 konsantrasyonu 150 μM'nin üzerine çıkana kadar inkübasyon odasının kapağını açarak inkübasyon ortamını yeniden oksijenlendirin. mitokondriyal solunum için yeterli_O2'yi korumak için bu adımı gerektiği gibi tekrarlayın.
6. Kompleks I'i bloke etmek için rotenon (2 μL 0.1 mM etanol çözeltisi; bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. Ortaya çıkan oksijen akısı, Kompleks II'nin tek başına süksinatın oksidasyonu yoluyla mitokondriyal oksijen tüketimini destekleme kapasitesini temsil eder (P_S).
   DİKKAT: Rotenon zehirli bir maddedir. Standart laboratuvar güvenliğini kullanın ve yutulmasından veya solunmasından kaçının.
7. Tek bir biyopsinin alikotlarını içeren bireysel respirometri odaları arasında belirli bir deneysel durum için ortalama değeri hesaplayın.
   NOT: Akı kontrol oranları (FCR'ler) gibi türetilmiş hesaplamalar, farklı yollardaki göreli değişiklikleri tanımlamada değerlidir ve FCR_{Sızıntısı} (L N / P N), FCR N (P _N / P N + S) ve FCR_S (P S / P _{N + S}) içerir. Hesaplanan oksidatif fosforilasyon verimliliği (1-L_N / P_{N + S}), toplam solunum kapasitesine göre ayarlanmış kaçak solunumun genel etkisinin bir tahminini sağlar.

Önerilen referans durumu, sağlıklı bir sedanter safkan (zorunlu egzersiz nedeniyle artan zindelik yok) ve postüral kasın merkezinden toplanan, mitokondri bakımından zengin tip I iskelet kası liflerinin yüksek bir yüzdesini içeren ve dinlenme metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edilen taze bir kas örneğidir (yani, 38 ° C ve pH 7.0). Bu koşullar altında, araştırmacı L N değerleri 2.71 ± 0.90, PN değerleri 62.40 ± 26.22, PN+S değerleri 93.67 ± 34.76 ve PS değerleri 46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (Şekil 3 ve Şekil 4). TMRM ile inkübe edilen mitokondrinin solunum değerleri, floroforun inhibitör etkisinden dolayı daha düşüktür (Şekil 1). FCRSızıntısı, FCRN ve FCRS sırasıyla 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 ve 0,51 ± 0,07'dir. Hesaplanan oksidatif fosforilasyon verimliliği 0.97 ± 0.01'dir. Bu solunum durumları için mutlak değerler, bireysel deneğe ve doku oksidatif kapasitesine bağlı olarak değişir, ancak bu değerlerin göreceli paterni, geçirgenleştirilmiş at iskelet kası liflerinden yayınlanan sonuçlarla tutarlıdır (yani, spesifik substratların eklenmesiyle solunumdaki artışlar, Kompleks I ve Kompleks II yoluyla solunumun kombinasyonu, elektron transfer sisteminin doygunluğu nedeniyle bu elektron kaynaklarının her birinden ayrı ayrı daha azdır [ETS] aşağı akış kapasitesi). İzole at iskelet kası mitokondrisinin hesaplanan etkinliği, permeabilize at iskelet kası lifleri için bildirilen karşılık gelen değerlerle tutarlıdır11.

ATP sentez hızının mitokondri izolatında kullanılan mg kaynak doku başına PN solunumunda 438.59 ± 397.10 pM x s-1, PN+S solunumunda 383.18 ± 397.19 ve PS solunumu için 172.07 ± 125.60 olması beklenmektedir. Süksinat ilavesiyle ATP sentezindeki azalma muhtemelen, ETS'nin kinon kavşağındaki iki elektron beslemesi ile rekabetten kaynaklanmaktadır; Kompleks II'den gelen besleme (mitokondriyal membran potansiyeline doğrudan katkıda bulunmayan), elektronların akışını Kompleks I yoluyla azaltmaktadır (bu, protonların iç mitokondriyal membran boyunca pompalanması yoluyla mitokondriyal membran potansiyeline doğrudan katkıda bulunur).

Mitokondri izolatında kullanılan mg kaynak doku başına H2O2 üretim hızının L N solunumunda 0,079 ±± 0,095 nmol.s-1, PN solunumunda 0,021 0,043, PN+S solunumunda 0,026 ± 0,056ve Ps solunumu için 0,237 ± 0,248 olması beklenmektedir (Şekil 4). ROS üretiminin nispi oranı, mitokondriyal membran potansiyelinin öngörülen büyüklüğü ve yüksek membran potansiyeli ile ROS üretimi arasındaki ilişki ile tutarlıdır. Bu ilişkinin istisnası, solunum sadece Kompleks II yoluyla gerçekleştiğinde, rotenon tarafından bloke edildiğinde elektronların kinon kavşağından Kompleks I'e geri akışı nedeniyle çok yüksek ROS üretimidir.

Şekil 1: At iskelet kası mitokondriyal solunumunun ve göreceli membran potansiyelinin temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi. Üst pencere, zaman içindeki oksijen konsantrasyonu (sol Y ekseni) ve oksijen akısıdır (sağ Y ekseni) (X ekseni); alt pencere, oda TMRM floresansı (sol Y ekseni) ve zaman içinde floresan sinyali değişim hızı (sağ Y ekseni) (X ekseni). Dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklenmesini gösterir (mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: süksinat; R: rotenon; CCCP: Karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Magnezyum yeşili için oda floresan sinyalinin kalibrasyonunun temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi ve magnezyum ve adenilatlar için Kd tayini. Oda MgG floresansı (sol Y ekseni) ve floresan sinyal değişim hızı (sağ Y ekseni) zaman içinde (X ekseni). İlk dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklendiğini gösterir (MgG: Magnezyum yeşili; mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; S: süksinat; EDTA: etilendiamintetraasetik asit). Bunu, floresan sinyalini artıran otomatik bir titrasyon pompası (TIP) kullanılarak MgCl2'nin seri titrasyonu, ardından floresan sinyalini azaltan bir adenilatın (bu durumda ATP) seri titrasyonu izler. MgCl2'nin titrasyonu, MgG sinyalini kalibre etmek için her tahlilin başında da kullanılır, ancak mitokondri ve P, G, M ve S gibi respirometri substratlarının eklenmesinden önce gerçekleştirilir .

Şekil 3: At iskelet kası mitokondriyal solunumu ve ATP sentezinin temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi. Üst pencere, zaman içindeki oksijen konsantrasyonu (sol Y ekseni) ve oksijen akısıdır (sağ Y ekseni) (X ekseni); alt pencere, zaman içinde (X ekseni) oda MgG floresan (sol Y ekseni) ve floresan sinyali değişim hızı (sağ Y ekseni) 'dir. Dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklenmesini gösterir (mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: süksinat; R: rotenon). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 4: At iskelet kası mitokondriyal solunumunun temsili yüksek çözünürlüklü respirometri izi veH2O2üretimi. Üst pencere, zaman içindeki oksijen konsantrasyonu (sol Y ekseni) ve oksijen akısıdır (sağ Y ekseni) (X ekseni); alt pencere, oda resorufin floresansı (sol Y ekseni) ve zaman içinde floresan sinyali değişim hızı (sağ Y ekseni) (X ekseni). Dikey işaretler, odaya spesifik substratların eklenmesini gösterir (mt: mitokondri süspansiyonu; P: piruvat; G: glutamat; M: malat; D: ADP; S: süksinat; R: rotenon). Ayrıca, H2O2kullanılarak floresan sinyalinin üç adet tahlil içi iki noktalı kalibrasyonu dadahildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların bu makale ile ilgili çıkar çatışması yoktur.