Aort kapak darlığının (AVS) altında yatan patolojik mekanizmaları anlamak ve terapötik girişimlerin etkinliğini değerlendirmek için uygun bir hayvan modeline ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, in vivo olarak doğrudan balon yaralanması yoluyla AVS tavşan modelini geliştirmek için yeni bir prosedürü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Doğrudan Balon Yaralanmasının Neden Olduğu Bir Tavşan Aort Kapak Darlığı Modeli
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hayvan modelleri, hastalıklı insan aort kapaklarının güvenilir kaynaklarına erişim eksikliği nedeniyle aort kapak darlığının (AVS) altında yatan patolojik mekanizmaları anlamak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Çeşitli hayvan modelleri arasında, AVS tavşan modelleri, büyük hayvan çalışmalarında en yaygın kullanılanlardan biridir. Bununla birlikte, geleneksel AVS tavşan modelleri, aort kapağında önemli darlıklara neden olmak için uzun süreli bir diyet takviyesi ve genetik manipülasyon gerektirir ve bu da deneysel çalışmalarda kullanımlarını sınırlar. Bu sınırlamaları ele almak için, aort kapağına doğrudan balon yaralanması ile stenozun indüklendiği yeni bir AVS tavşan modeli önerilmiştir. Mevcut protokol, hazırlık, cerrahi prosedür ve ameliyat sonrası bakım için adım adım prosedürlerle Yeni Zelanda beyaz (NZW) tavşanlarında AVS'yi indüklemek için başarılı bir tekniği tanımlamaktadır. Bu basit ve tekrarlanabilir model, AVS'nin başlangıcını ve ilerlemesini incelemek için umut verici bir yaklaşım sunar ve hastalığın altında yatan patolojik mekanizmaları araştırmak için değerli bir araç sağlar.
Giriş
Aort darlığının (AS) ilerlemesi ile ilişkili hastalıklı insan aort kapaklarının güvenilir kaynaklarına erişim eksikliği nedeniyle, uygun hayvan modellerinin kullanılmasının aort kapak darlığının (AVS) altında yatan patolojik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabileceği giderek daha fazla kabul görmektedir. AVS'yi incelemek için çeşitli hayvan modelleri arasında, tavşanlar en yaygın kullanılan büyük hayvan AVS modellerinden biridir ve AVS tavşan modeli, kolesterol / D2 vitamini takviyesi veya genetik manipülasyon 1,2,3,4 yoluyla indüklenir.
Tavşan AVS modelleri, AVS'nin gelişimi ve ilerlemesi hakkında önemli bilgiler sağlamış olsa da, ön deneylerimizde görüldüğü gibi, AVS'yi tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde indüklemek hala zor olmaya devam etmektedir.
Diyete bağlı ve genetik olarak duyarlı hayvan modellerine ek olarak, farelerde doğrudan mekanik yaralanma yoluyla yeni bir AVS modeli oluşturulmuştur 5,6. Mekanik yaralanma modeli, aort darlığını başarılı bir şekilde indükler ve vahşi tip farelerde basit ve tekrarlanabilir bir AVS modelini temsil eder. Bildiğimiz kadarıyla, tavşan modellerinde mekanik bir yaralanmanın aort kapağı üzerindeki etkilerini inceleyen daha önce yapılmış bir çalışma yoktur. Bu nedenle, bu çalışma, aort kapağına doğrudan balon yaralanması yoluyla erkek Yeni Zelanda beyaz tavşanlarında AVS'yi indüklemek için yeni bir prosedür sunmaktadır ve bu da kapak aort darlığının durumunu doğru bir şekilde taklit edebilir. Bu protokol, tekrarlanabilir AVS tavşan modellerini indüklemek için yararlı olan preparat, cerrahi prosedür ve ameliyat sonrası bakımın adım adım açıklamalarını içerir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan araştırma prosedürleri, Kore Katolik Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan Laboratuvar Hayvanları Refahı Yasası, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve Hayvan Deneyleri için Kılavuz ve Politikalar uyarınca onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir (onay numarası: CUMC-2021-0176-05). Bu çalışmada, standart koşullar altında ayrı kafeslerde tutulan 3.5-4.0 kg ağırlığındaki 3 aylık erkek Yeni Zelanda beyaz (NZW) tavşanları kullanılmıştır. Tavşanlar ya normal bir diyetle ya da 50.000 U D2 vitamini ile desteklenmiş% 0.5 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyetle beslendi (Malzeme Tablosuna bakınız). AVS tavşan modelinin indüksiyonu için deneysel tasarım ve analiz yöntemleri Şekil 1'de gösterilmektedir.
1. Operasyon için hazırlık
- Operasyonun başında tüm tıbbi ve cerrahi aletlerin ( Malzeme Tablosuna bakınız) sterilize edildiğinden emin olun.
- Aşağıdaki adımları izleyerek dilatasyon balonu kateter setini hazırlayın.
- Tuzlu su ve piyasada bulunan kontrast madde (1:1) karışımı ile doldurulmuş in-deflasyon cihazını balon kateterin luer kilit kısmına bağlayın (bkz.
- Balonu şişirme solüsyonu ile doldurun ve balon kateterindeki havayı alın.
NOT: Bu çalışma için, şişirme çözeltisi %0.9 salin ile %30 iyodiksanolden oluşmuştur (bkz. - Balon lümenini şişirme solüsyonuyla temizleyerek uygun balon şişirmeyi doğrulayın.
2. Aort kapak yaralanması için cerrahi prosedür
- Hayvanı uyuşturmak için intramüsküler tiletamin ve zolazepam (15 mg / kg) ve ksilazin (5 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Anestezi uygulanmadan önce, tavşanlara anestezik öncesi antikolinerjik ajan olarak deri altı glikopirrolat enjeksiyonu (0.05 mg / kg) ile ön muamele edildi. Yeterli anestezi seviyesi, ayak parmağı sıkışmasına yanıt eksikliği ve sabit bir solunum hızı dahil olmak üzere bir dizi kriter ile belirlendi. - Marjinal auriküler veline 24 G intravenöz (IV) kateter yerleştirin ve heparinize salin (100 U / kg heparin) ile bir infüzyon seti bağlayın.
- Oksijen doygunluk sinyali (SpO2), sıcaklık ve kan basıncı gibi hayati belirtileri sürekli olarak izlemek için tavşanı çok parametreli bir veteriner monitörüne (Malzeme Tablosuna bakın) bağlayın.
NOT: SpO 2 izleme için SpO2 sensörünü tavşanın diline takın. Sıcaklık izleme için, probu tavşanın rektumuna yerleştirin. Kan basıncı izleme için manşeti ön ayağa yerleştirin. - Tavşanı C kollu floroskopi ile donatılmış bir ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin (bkz . Malzeme Tablosu) ve hayvan saç kesme makineleri kullanarak ventral boyun bölgesindeki tüyleri alın (Şekil 2A).
- Kesi bölgesini iyotla sterilize edin ve tavşanı cerrahi havlularla örtün.
- Tavşanın kalbini C kolu görüntüsünün ortasına yerleştirin.
NOT: Tüm araştırmacılar, C-kol kılavuzluğundaki ameliyatı gerçekleştirirken radyasyona maruz kalmayı azaltmak için termolüminesan dozimetreler (TLD'ler) takılı koruyucu giysiler giymelidir.- C kolunu açın ve kardiyak görüntüleme için floroskopik modu seçin.
- Kalbin görüntüleme alanının merkezinde olduğundan emin olmak için tavşanın konumunu ayarlayın.
- Boyun derisinde yaklaşık 3 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve fasya ve yağ dokusunu kesmek için cerrahi makas kullanın.
- LCCA'nın yaklaşık 3-3.5 cm'si açığa çıkana kadar kasları dikkatlice ayırarak sol ana karotis arteri (LCCA) ortaya çıkarın (Şekil 2B).
- Kan akışını durdurmak için LCCA'yı açıkta kalan LCCA'nın üstünde ve sonunda 3-0 ipek sütür ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile bağlayın.
- LCCA'ya 22 G IV kateter yerleştirin ve IV kateter aracılığıyla sol ventriküle (LV) bir kılavuz tel (0.016 inç, Malzeme Tablosuna bakınız) sokarak kateterin ucunun C-kolunun görüntüleme alanına düzgün bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
NOT: IV kateteri yerleştirirken, kateterin ilerlemesine izin vermek için aort kapağına inerken ligatür sütürünü dikkatlice gevşetin. - Kılavuz telden ayrılarak IV kateteri geri çekin ve balon kateteri yerleştirmek için kılavuz telin üzerine LCCA'ya bir 4-F kılıf (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin (Şekil 2C).
NOT: IV kateteri kılıfla değiştirdikten sonra, sıkışan hava kılıf cihazından çıkarılmalıdır. - 8 mm'lik balon kateteri kılavuz telin üzerinden C-kollu floroskopi kılavuzluğunda aort kapağına dikkatlice yerleştirin (Şekil 2D).
- Balon kateter ucunu aort kapağının yaklaşık 1-2 cm distaline yerleştirin ve şişirme solüsyonunu 6 atm'de bir basınç şişirici ile temizleyerek balonu şişirin.
- Balonu LV tepesine ilerletin ve LV çıkışına geri çekin. Bu işlemi beş kez tekrarlayın ve ardından balonu söndürün (Şekil 2E, F).
- Yeterli valf yaralanmasını sağlamak için 2.8-2.9 adımlarını üç kez tekrarlayın.
- Balon kateterini ve kılavuz teli geri çekin. Kılıfı LCCA'dan yavaşça çıkarın ve LCCA'yı hemen aort kapağına inerken dikişle bağlayın.
- Kan pıhtılarını gidermek için kesi bölgesini tuzlu su ile temizleyin ve delinmiş bölgeyi arteriyel kanama açısından inceleyin.
- Kas ve cildi 3-0 emilmeyen bir dikişle kapatın ve yaranın her tarafını iyot ile sterilize edin.
3. Ameliyat sonrası bakım
- İzleme yamalarını ve klipslerini çıkarın ve tavşanı yoğun bakım kuvözünde tutun.
NOT: Ameliyattan sonra tavşanlar yoğun bakım kuvözünde 1 gün boyunca yakından izlendi ve daha sonra bir ev kafesine taşındı. - Ameliyat sonrası ağrıyı 5 mg / kg tramadol ve 3 mg / kg ketoprofen ile yönetin ve deri altı enjeksiyon yoluyla 3 gün boyunca günde iki kez antibiyotik (4 mg / kg gentamisin) uygulayın (bkz.
NOT: Ameliyat sonrası ağrı yönetimi veterinerlik ve IACUC yönergelerine uymalıdır (ör., opioid, NSAID, lokal anestezik veya kombinasyon). - 8 hafta boyunca 50.000 U D2 vitamini (HC + VitD2) ile% 0.5 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyet besleyin.
4. Ekokardiyografi
- 8 haftalık balon yaralanmasından sonra, adım 2.1'de açıklanan prosedürün aynısını kullanarak tavşanı uyuşturun.
- İki boyutlu transtorasik görünümleri kullanarak aort kapaklarını görselleştirin ve kısa eksenli ve uzun eksenli görünümlerde M modu görüntüleri kaydedin.
- Tavşanı bir yankı masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
- Göğüs makası ve tüy dökücü krem kullanarak göğüs bölgesini tıraş edin.
- Ultrason dönüştürücü jeli (Malzeme Tablosuna bakınız) göğsünüze uygulayın.
- Aort kapağının parasternal uzun eksen görünümünü ve parasternal kısa eksen görünümünü elde etmek için dönüştürücüyü ayarlayın.
- Aort kapağının görüntülerini hem uzun eksen hem de kısa eksen görünümlerinde kaydetmek için M modu görüntülemeyi kullanın ve görüntüleri daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.
5. Histolojik analiz
- Ekokardiyografiden sonra, intravenöz potasyum klorür (KCl, 3 g / 20 mL, 1 mL) enjeksiyonu uygulayarak tavşanı ötenazi yapın.
- Göğüs boşluğunu açın, kalbi çıkan aort7 ile toplayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) içinde buzun üzerine yerleştirin.
- Kalbi hemen% 4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisine daldırın ve bir parafin bloğuna gömün (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Parafine gömülü kalp bloğunu bir mikrotom kullanarak 4 μm kalınlığında bölümlere ayırın ve kollajen birikimini ve kapak kalsifikasyonunu değerlendirmek için bölümleri sırasıyla Masson'un trikrom (MT), Alizarin Kırmızısı ve von Kossa (Malzeme Tablosuna bakınız) ile boyayın 8,9.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aort kapak yaralanmasının neden olduğu tavşan AVS modeli
Tavşan AVS modelini indüklemek için, bu çalışma için 3.5-4.0 kg ağırlığındaki erkek NZW tavşanları kullanıldı. Adım 2'de (Şekil 2) açıklanan cerrahi prosedürlere göre, AVS modeli, mekanik aort kapak dejenerasyonu ve kalsifikasyonu ile sonuçlanan aort kapak yaralanması ile oluşturulmuştur. Kontrol grubu,% 0.5 kolesterolle zenginleştirilmiş bir diyet (yüksek kolesterol, HC) ve diyete bağlı AVS modeli olarak bilinen 50...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hayvan AVS modelleri, AVS'nin başlatılması ve ilerlemesi de dahil olmak üzere AVS'nin patolojik yönlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bu protokol, aort kapağına doğrudan balon yaralanması ile indüklenen yeni bir tavşan AVS modelini tanıtmaktadır. Bu çalışmada, aort kapak yaralanması modelinde belirgin yaprakçık kalınlaşması ve kalsifikasyon görülmüştür. Diyet takviyesi ile indüklenen hafif AVS modeliyle karşılaştırıldığında, doğrudan balon yaralanması modelindeki aort kapağı seçici olarak yaralandı, bu da ka...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların bu çalışma ile beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) (No. 2020R1A4A3079570), Eğitim Bakanlığı (No. 2021R1I1A1A01051425) ve Kore Cumhuriyeti Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı tarafından finanse edilen Endüstriyel Stratejik Teknoloji Geliştirme Programı (No. 20014873) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3-0 İpek sütür | AILEE | SK312 | |
| %4 paraformaldehit(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin kırmızı Solüsyon | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION MAVİ | ASAHI | Kılavuz tel | |
| Arka Masa Örtüsü | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balon İn-söndürme Cihazı | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veteriner monitörü | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Sertifikalı Tavşan Diyeti | Purina | 5322 | %4.7 Hidrojene Hindistan Cevizi Yağı, %0.5 Kolesterol & %1 Molasse |
| Curadle Akıllı Kuvöz | Autoelex | CS-CV206 | Yoğun Bakım Ünitesi (YBÜ) |
| Ergokalsiferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner konjonktiva forseps titanyum | DÜNYA HASSASİYET Aleti | WP1820 | |
| Forseps | HEBU | HB203 | |
| Gentamisin | Shin Poong | ||
| Glikopirolat | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal salin 500 mL | |
| Hematoksilen çözeltisi | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW farmasötik | 25.000 U | |
| Tek kullanımlık infüzyon seti | SWOON MEDICAL | ||
| İyot Yeşil | ilaç | ||
| İodiksanol | GE Healthcare | Visipaque | Şişirme solüsyonu (kontrast madde) |
| IV kateter 22 G | BD | ||
| IV kateter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok şırınga 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok şırınga 3 mL | Becton Dickinson Tıbbi | ||
| Mikroskop | OLYMPUS | SZ61 | |
| Mikrotom | ThermoFisher Bilimsel | HM 325 | |
| MT leke kiti | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| İğne tutucu | Solco | 009-1304 | |
| Kilitli ve Dikişli İğne Tutucu | JEUNGDO BIO & BİTKİ | H-1222-18 | |
| Parafin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potasyum klorür 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelüd İdeal Hidrofilik Kılıf | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Kılıf 4F |
| PTA Balon Dilatasyon kateteri | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balon kateter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| steril Gazlı Bez | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Cerrahi Eldivenler | Ansell | Ansell | |
| Cerrahi Önlük | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Cerrahi Makas | Nopa, Almanya | AC020/16 | |
| Cerrahi Bant | 3M micopore | 1530-1 | |
| Şırınga 1 mL | Shin Chang Tıbbi | ||
| Şırınga 10 mL | Shin Chang Medikal | ||
| Doku kaseti | Scilav korea | Cas3003 | |
| Dönüştürücü jel ve nbsp; | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan A.Ş. | Tramadol HCl | |
| Ultrason sistemi | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa leke seti | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac kore | Tiletamin & zolazepam |
Kaynaklar
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
