Cnidarian Model Organizma Clytia hemisphaerica'yı Kullanarak İn Vivo Epitelyal Yara İyileşmesini Karakterize Etmek

Özet

Bu yazıda, canlı bir Clytia hemisphaerica medusa'nın epitelinde yara oluşturmak ve in vivo olarak yüksek çözünürlükte yara iyileşmesini görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ek olarak, yara iyileşmesi sırasında epitel hücrelerinde ve hücre dışı matrikste sinyal süreçlerini bozmak için boyalar ve ilaçlar tanıtmak için bir teknik sunulmaktadır.

Özet

Deriden gözlere ve bağırsaklara kadar tüm hayvan organları, onları enfeksiyondan korurken homeostazı sürdürmelerini sağlayan epitel hücreleri tabakaları ile kaplıdır. Bu nedenle, epitel yaralarını onarma yeteneğinin tüm metazoanlar için kritik olması şaşırtıcı değildir. Omurgalılarda epitelyal yara iyileşmesi, enflamatuar yanıtlar, vaskülarizasyon ve yeniden epitelizasyon dahil olmak üzere örtüşen süreçleri içerir. Bu süreçlerin düzenlenmesi, epitel hücreleri, komşu hücreler ve hücre dışı matris (ECM) arasındaki karmaşık etkileşimleri içerir; ECM yapısal proteinler, düzenleyici proteinler ve aktif küçük moleküller içerir. Bu karmaşıklık, çoğu hayvanın opak dokulara ve erişilemeyen ECM'lere sahip olmasıyla birlikte, yara iyileşmesinin canlı hayvanlarda incelenmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, epitelyal yara iyileşmesi üzerine yapılan birçok çalışma, doku kültürü sistemlerinde, yapay bir matris üzerinde tek katmanlı olarak kaplanmış tek bir epitel hücre tipi ile gerçekleştirilir. Clytia hemisphaerica (Clytia), bu çalışmalara benzersiz ve heyecan verici bir tamamlayıcı sağlar ve epitelyal yara iyileşmesinin otantik bir ECM ile bozulmamış bir hayvanda incelenmesine izin verir. Clytia'nın ektodermal epiteli, canlı hayvanlarda diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin veren tek bir büyük skuamöz epitel hücresi tabakasıdır. Göçmen fibroblastların, vaskülatürlerin veya inflamatuar yanıtların yokluğu, in vivo olarak yeniden epitelizasyonda kritik olayların diseksiyonunu mümkün kılar. Tek hücreli mikro yaralar, küçük ve büyük epitel yaraları ve bazal membrana zarar veren yaralar dahil olmak üzere çeşitli yara türlerinin iyileşmesi analiz edilebilir. Lamellipodia oluşumu, kese ipi kasılması, hücre gerilmesi ve kolektif hücre göçü bu sistemde gözlenebilir. Ayrıca, hücre: ECM etkileşimlerini ve hücresel süreçleri in vivo olarak değiştirmek için ECM aracılığıyla farmakolojik ajanlar tanıtılabilir. Bu çalışma, canlı Clytia'da yara oluşturma, iyileşme filmlerini yakalama ve reaktifleri ECM'ye mikroenjeksiyon yoluyla iyileşme mekanizmalarını araştırmak için yöntemler göstermektedir.

Giriş

Epitel hücrelerinin tabakaları tüm metazoanların dış yüzeyini kaplar, iç organları hizalar ve hayvan vücudunu ayrı bölmelere böler. Epitel ayrıca iç vücudu dış ortamdan ayırır ve hasar ve enfeksiyondan korur. Bu nedenle, epitel tabakalarının ortaya çıkışı, çok hücreli hayvanların evriminin önemli bir parçasıydı ve epitel tabakaları, omurgalılardan en bazal metazoanlara kadar tüm hayvanlarda görülür¹. Bazı organların epiteli, akciğer hava kesecikleri, kan damarları ve bağırsak^2'de olduğu gibi, ayrıca planaria ve cnidarians³ gibi omurgasızların epidermisinde olduğu gibi tek bir tek katmandır. Omurgalıların deri⁴ ve kornea⁵ gibi diğer dokularda, epitel tabakalaşır, yani çoklu epitel hücre katmanları² vardır. Her durumda, en bazal epitel tabakası, hücre dışı matrisin (ECM^{) özel} bir bölgesini oluşturan bir protein tabakası olan bazal membrana yapıştırılır6,7,8.

Epiteldeki ihlaller, sürekli bir epitel tabakasını yeniden oluşturmak için hızla onarılmalıdır. Epitel hasarı, bağırsaktaki epitel hücrelerinin dökülmesi gibi doğal süreçler sırasında ortaya çıkar,9,10 ve iltihaplanma veya fiziksel travma sonucu ortaya çıkar. Tek bir epitel hücresi hasar gördüğünde, çevreleyen hücrelerin birbirine yapışmasına ve^11,12 deliğini kapatmasına izin vermek için ya kendini onarmalı ya da ortadan kaldırılmalıdır. Tek bir hücrenin boyutundan daha büyük yaralarda, epitel hücreleri birbirlerine ulaşmak ve tabakayı onarmak için hareket etmelidir¹³. Bu, boşluklar küçükse hücre yayılımı ile sağlanabilir veya yara boşluğunu kapatmak için epitel hücrelerinin bir yaranın kenarlarından göçünü gerektirebilir; Bu son sürece yeniden epitelizasyon^{denir 14,15}. Embriyonik dokularda, epitel hücreleri yayılır ve yakın yaralara göç eder veya yara kenarındaki hücreler arasında oluşan aktomiyozin kablolarının bir kese ipine benzeyen bir mekanizma içinde kasılması ile boşluk boyunca çekilir¹⁶. Birçok yetişkin dokuda, yeniden epitelizasyon, hücrelerin komşu hücrelerle kavşaklarını koruduğu tutarlı hücre tabakalarının göçünü içerir^14,17,18. Diğer dokularda, hücre: hücre bağlantıları sökülür ve epitel hücreleri daha çok mezenkimal hücreler gibi davranır, yeniden epitelizasyon sırasında koordineli fakat bağımsız bir şekilde yara bölgesine hareket eder 14,19,20,21.

Epitel hücre hareketleri, göç eden hücreler arasındaki ve hücreler ile ECM arasındaki karmaşık etkileşimler tarafından düzenlenir. Epitel hücrelerinin yara aktivasyon mekanizmalarını ve ardından göçü ele alan muazzam miktarda deneysel literatür olmasına rağmen, hala keşfedilmeyi bekleyen çok şey var. Örneğin, bir yaraya yanıt olarak epitel hücrelerini göç etmek için aktive eden ilk sinyal kesin olarak tanımlanmamıştır 22 veya aktinin, yaraya en yakın epitel hücrelerinin yanında lamellipodia oluşturmak için nasıl yeniden konuşlandırıldığı tam olarak anlaşılamamıştır 22,23,24,25,26,27. Kolektif hücre göçü, yaradaki hücrelerden gelen bilgilerin yaraya distal hücrelerle paylaşılmasını gerektirir ve iletişim yolu hala belirsizdir²⁸. Hücre: hücre kavşakları ve hücre: ECM ekleri, tabakadaki hücreler kendilerini yeniden düzenlerken sökülmeli ve yeniden düzenlenmelidir, ancak bu işlemin düzenlenmesi tam olarak anlaşılamamıştır^14,29. Bu ve diğer ilgili sorularda ilerleme kaydetmek sadece temel bir biyolojik problem olarak değil, aynı zamanda doğru yara iyileşmesinin klinik önemi nedeniyle de önemlidir. Epitel hücrelerinin doğru göç etme yeteneğini tehlikeye atan hastalıklar kronik yaralara neden olur; Bir örnek, epitel hücrelerinin ECM'ye bağlanmasında rol oynayan genlerin mutasyona uğradığı ve soyulan ve kabarcıklanan kırılgan bir cilde neden olan genetik hastalık epidermolizis bülloza'dır. Doğal olarak yaşlanan dokularda yeniden epitelizasyon da tehlikeye girer^30,31. Bu nedenle, yara iyileşmesi sonuçlarını iyileştirmek için müdahaleler geliştirmek için daha iyi bir anlayış şarttır.

Yara iyileşmesinde epitel hücre göçü hem in vitro yaklaşımlar hem de model organizmalar kullanılarak incelenmiştir. Yara iyileşmesi ve hücre göçü mekanizmaları ile ilgili çalışmaların çoğu, tek bir epitel hücre tipinin tek katmanlarının ECM'nin yerini alan bir substrat üzerinde yetiştirildiği doku kültüründe gerçekleştirilmiştir. Hücre tek katmanları, belirli şekil ve boyutlarda boşluklar oluşturmak için çizilir veya şablonlarla büyütülür ve daha sonra 32,33,34 olarak gözlemlenir. İn vitro model, hücre davranışının ideal bir şekilde görselleştirilmesinin yanı sıra, substratın niteliklerini değiştirme, hücreleri ilaçlara ve abiyotik ve biyotik faktörlere maruz bırakma ve çeşitli genleri ifade eden veya baskılayan yapılara sahip hücreleri transfekte etme fırsatına izin verir. Bununla birlikte, bu indirgemeci yaklaşım, çeşitli hücre tipleri arasındaki iletişim ve ECM^11'de meydana gelen sinyal olayları da dahil olmak üzere, in vivo bağlamda epitel hücre davranışında yer alan bazı önemli parametreleri yakalamada başarısız olabilir. İn vivo modeller, birden fazla hücre tipi, çakışan sinyal yolları ve karmaşık bir ECM³⁵ ile bir yaranın otantik bağlamını sağlar. Yara iyileşmesi çalışmaları için böyle bir model, son gelişmelerin araştırmacıların canlı hayvanlarda tam kalınlıktaki yaraların iyileşmesi sırasında epidermal hücreleri gözlemlemelerine izin verdiği fare^{19'dur 36}. Bununla birlikte, fare ve diğer in vivo sistemler, yeniden epitelizasyonu incelemek için zorluklar ortaya koymaktadır. İlk olarak, hücre davranışını doğal bir bağlamda gözlemlemenin en büyük avantajı, kanın pıhtılaşması, bağışıklık hücrelerinin işe alınması ve iltihaplanma, fibroblastların işe alınması ve hücre farklılaşması, yeniden vaskülarizasyon ve ECM'nin yeniden şekillendirilmesi dahil olmak üzere omurgalı yara iyileşmesi sırasında meydana gelen geçici olarak örtüşen olayların karmaşıklığı ile dengelenir. Ayrıca, opak dokular görüntülemeyi zorlaştırır. Drosophila larva ve Zebrafish epidermis sistemleri ^37,38, göreceli basitlikleri nedeniyle bu zorlukların bazılarının üstesinden gelmiştir³⁹.

Laboratuvarımız yakın zamanda epitel yara iyileşmesini incelemek için yeni bir model tanıttı: hidrozoan cnidarian Clytia hemisphaerica'nın (Clytia) medusa (denizanası) ^formu40. Clytia, tam dizili ve açıklamalı genom⁴¹, tek hücreli RNAseq transkriptom 42 ve genom modifikasyonu için protokoller (mutagenez ve transgenez) ^43,44,45 ile ortaya çıkan bir model organizmadır. Cnidarians, epitel katmanlarına sahip en eski mevcut soylardan biridir, bu nedenle cnidarian yara iyileşmesini anlamak, epitel bütünlüğünü sağlayan ataların yollarına dair içgörüler sağlar. Yaşam ağacı boyunca korunmuş olan yollar için Clytia, epitel hücre dinamiklerini ve in vivo yara iyileşmesinin fonksiyonel düzenlemesini incelemek için heyecan verici yeni bir sistem sunar.

Clytia medusa'nın (exumbrella) üst yüzeyini kaplayan epitel, yaklaşık 50 μm genişliğinde ve 1-2 μm kalınlığında şeffaf, skuamöz epitel hücrelerinin tek katmanlıdır (Şekil 1). Denizanasının "jölesi" olan mezoglea adı verilen bir ECM'ye bağlanırlar. Mezoglea, omurgalılar da dahil olmak üzere diğer hayvanlarda 46,47,48 bulunan ECM'ye bileşimsel olarak benzer, bir bazal membran ^40'a sahiptir ve tamamen şeffaftır. Clytia medusa'daki epitel tabakası kolayca çizilebilir veya yaralanabilir (aşağıya bakınız). Epitel ve ECM'nin basitliği ve şeffaflığı, hücrelerin ve iyileşme sırasındaki hareketlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar. Son zamanlarda, Kamran ve ark. Clytia epitelindeki küçük yaraların iyileşmesini ayrıntılı olarak karakterize ettiler⁴⁰. Clytia'da iyileşmenin, lamellipodia tabanlı hücre taraması, hücre yayılımı ve kolektif hücre göçünün yanı sıra embriyonik sistemlere daha tipik olan cüzdan ipi kapanması yoluyla gerçekleştiği gösterilmiştir (daha önce kornea⁴⁹ gibi yetişkin hayvan yapılarında görülmesine rağmen). Clytia yara iyileşmesi, enflamatuar yanıtı olmayan diğer sistemlerde görüldüğü gibi son derece hızlıdır^40,50. Clytia exumbrella'da iyileşme tamamen mevcut epitel hücrelerinin hareketlerine bağlıdır - hiçbir hücre çoğalmaz veya ECM'den yara bölgesine göç etmez (Ek Film 1). Tüm bu bulgular, Clytia'nın epitel yara iyileşmesini incelemek için yararlı bir model sistem olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, yara iyileşmesi sırasında Clytia'daki epitel hücrelerinin görüntülenmesinin kolaylığı, epitel hücreli lamellipodia'nın sağlam bir bazal membran olduğu sürece maruz kalan ECM alanlarına yayıldığını ve yayıldığını keşfetmeye yol açmıştır; Bazal membran hasar görürse, epitel iyileşmesi bir çanta ipi mekanizmasına geçer⁴⁰. Bu, lamellipodia tabanlı sürünmeye karşı cüzdan ipi kapanması ile kapanma kararının altında yatan bir mekanizmanın ilk gösterimiydi ve spesifik hücre: ECM etkileşimlerinin iyileşmede ve hücreleri doğal bağlamlarında gözlemlemenin önemini vurguladı.

Aşağıda, tek hücreli mikro yaraların, öncelikle hücre yayılımı ile kapanan küçük yaraların ve kolektif hücre göçünün kapanmasını gerektiren büyük yaraların oluşturulması ve görüntülenmesi için protokoller açıklanmaktadır. Ayrıca, küçük moleküllerin ECM ve epitel hücrelerine sokulması için bir protokol tanımlanmıştır ve yara iyileşmesinin varsayılan düzenleyici yollarının deneysel bozulmalarına izin vermektedir.

Protokol

1. Hayvan kültürü

1. Bir zebra balığı sisteminde 18 ° C'de mikroskop slaytları ve yapay deniz suyunda (ASW) medusae üzerinde Clytia polip kolonilerini, polip kolonileri için 2 L zebra balığı tankları ve medusae için özel yapım 5 L sahte kreisel tankları ile koruyun (Ek Şekil 1) ⁵¹. ASW, deiyonize (DI) H₂O'da% 4 Anlık Okyanus'tan oluşur.
2. Hayvanları günlük olarak tarif edildiği gibi 2-3 günlük artemi ile besleyin⁵¹.
   NOT: Hayvanlar yakın zamanda beslenmemişse, yara iyileşmesi görüntülemesi daha kolaydır, çünkü bağırsaktan görüş alanına daha az döküntü salınır.
3. Kolonileri bir gecede 1 L ASW ile doldurulmuş 2 L'lik bir beher içine yerleştirerek kurulan polip kolonilerinden bebek medusae'yi gerektiği gibi toplayın. Tüm yara iyileşme deneyleri için 2-3 haftalık dişi medusae kullanın. Clytia'nın yayılımı başka bir yerde ayrıntılı olarak tanımlanmıştır⁵¹.

2. Yaralama

1. Hücreler içinde ve arasında mikro yaralar oluşturma (20-500 μm²)
   1. Daha büyük bir açıklık (0,5-0,7 cm çapında) yapmak için ucu makasla keserek modifiye edilmiş bir transfer pipeti oluşturun.
      NOT: Pipetteki açıklık, hayvana zarar gelmesini önleyecek kadar geniş olmalıdır.
   2. Modifiye transfer pipetini kullanarak, medusa'yı medusa exumbrella yukarı bakacak şekilde, hayvanı örtmek için yeterli ASW olacak şekilde bir çöküntü slaytına yerleştirin.
   3. Hemen hayvanın ve resmin üzerine bir örtü parçası yerleştirin (görüntülemenin açıklaması için aşağıya bakın). Kapak kayması, mezogleayı sıkıştırır ve sıkıştırılmış dokunun geri tepmesi, hücreleri hafifçe birbirinden ayıran bir kuvvet yaratır⁵². Bu hemen her hücre arasında boşluklar ve bazı hücrelerdeki hasar olarak görünür (Şekil 1B, B', Şekil 2 ve Şekil 3A-C).
2. Küçük epitel yaraları oluşturma (0.02-0.125^mm2)
   1. Modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak (yukarıdaki gibi), medusa'yı medusa exumbrella yukarı bakacak şekilde bir çöküntü slaytına yerleştirin.
   2. 200 μL pipet ucu kullanarak medusanın yüzeyini nazikçe çizin. Nazik çizilme, bodrum zarında kolayca görülebilen yırtılmalar da oluşturabilir²². Hayvanı görüntüleme için bir kapakla örtün. Alternatif olarak, kapak kaymasının yerleştirilmesi bazen çizilmeden bile küçük epitel yaraları oluşturmak için yeterlidir (Şekil 1C, C', Şekil 2 ve Şekil 3A-C).
      NOT: Medusa'nın yüzeyini çizerken bastırmayın, çünkü bu ECM'ye zarar verir ve düzensiz bir yüzey oluşturur – düzensiz bir yüzeyde göç eden epitel hücrelerinin odakta tutulması daha zordur.
3. Büyük epitel yaraları oluşturma (0.5-0.9^mm2)
   1. Bir mikropipet çektirici ve cam kılcal tüp kullanarak bir mikroenjeksiyon iğnesi yapın (adım 5.2). Boş mikroenjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatöre yapıştırılmış bir mikroenjektör tutucusuna yerleştirin. İğnenin ucunu, açıklık yaklaşık 20-40 μm olacak şekilde kesin.
      NOT: Büyük epitel yaraları için kesilmiş iğneler, deneyler arasındaki tutarlılığı artırmak için saklanabilir ve yeniden kullanılabilir.
   2. Mikroenjektör üzerindeki tutma basıncını sıfıra ayarlayın ve çıkarma basıncını yaklaşık 20 PSI'ya ayarlayın. Mikro enjektörü 2 sn hava darbesi verecek şekilde ayarlayın.
      NOT: Çıkarma basıncının, iğne açıklığının çapına göre ayarlanması gerekebilir (yani, daha küçük uçlar daha yüksek basınç kullanırken, daha büyük uçlar daha düşük basınç kullanır).
   3. Medusa'yı, eksşemsiye yukarı bakacak şekilde, diseksiyon kapsamı sahnesindeki bir çöküntü slaytına bakacak şekilde, hayvanı örtmek için yeterli ASW ile yerleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak, mikroenjeksiyon iğne ucunu suyun hemen üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Bunu yapmak için, ucu dikkatlice suya batırın (pipet ucuna su girebilir), ardından medusa'nın epitel yüzeyine yakın olacak şekilde geri çekin.
      NOT: Uç, medusanın bir çeyreğinin üzerine yerleştirilmelidir. Medusa'nın radyal kanalları, medusa çanını dört ayrı kadrana böler. Bir kadranın hedeflenmesi, gonadlar ve radyal kanallar yara bölgesinden dışlandığı için daha temiz görüntüleme ile sonuçlanacaktır.
   4. Enjektörde start tuşuna basarak havayı darbeleyin. Ucun genişliğine bağlı olarak darbeyi aynı noktada iki ila dört kez tekrarlayın. Daha büyük uçlar daha az darbe gerektirir.
      NOT: Suda/medusada hava darbesinden kaynaklanan bir girinti görünür olmalıdır.
   5. Büyük yaraları görüntülemek için yaralı hayvanı bir örtü ile örtün (Şekil 1D, D').
   6. Epitelyal yara iyileşmesini görüntülemek için aşağıdaki adımları (bölüm 3) izleyin.

Resim 1: Clytia medusa'da sağlam ve yaralı ekzolarji epitel tabakası. (A) Clytia medusa gövdesinin karikatür grafiği. (A') Sağlam medusa exumbrella epiteli yukarıdan bakıldığında. (B) Epitel hücreleri mavi renkte olan tek hücreli mikro yaraların (kırmızı pürüzlü şekiller) karikatürü. (B') Tek hücreli mikro yaralar. (C) Küçük bir epitel yarasının karikatürü (kırmızı pürüzlü şekil). (C') Küçük epitel yarası. (D) Büyük bir epitel yarasının karikatürü (kırmızı pürüzlü şekil). (D') Büyük epitel yarası. Görüntülerin hepsi DIC mikroskobu kullanılarak elde edildi. Ölçek çubukları (A'-C'): 50 μm. Ölçek çubuğu (D'): 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Çok boyutlu yaralar ve hasarlı bir bazal membran. Tipik bir küçük eksumbrella epitel yarası, marjinal hücrelerden oluşan lamellipodiyi gösteren etiketlerle gösterilmiştir. Ek olarak, epitel hücreleri içinde ve arasında mikro yaralar görülür. Yaranın üst kısmındaki küçük bazal membran yırtığına dikkat edin. Film 4 bu yaranın iyileşmesini gösterir. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Epitelyal yara iyileşmesinin görüntülenmesi

1. Mikroskobun Köhler aydınlatması⁵³ için hizalandığından ve diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu⁵⁴ için doğru şekilde ayarlandığından emin olun. Epitel hücreleri standart optiklerle neredeyse görünmezdir (Şekil 3D,E).
2. Odağı exumbrella'ya ayarlayın. Bu ince bir tabaka olmasına rağmen, altıgen hücreler açık olmalıdır.
   NOT: Exumbrella ve subumbrella, dikey liflerle desteklenen kalın bir mezoglea ile ayrılır. Subumbrellar hücreler radyal kanallarla aynı odak düzlemindedir. Başlangıçta şemsiye altı katmanına odaklanmışsa, odağı exumbrella'yı bulana kadar mezoglea ve dikey lifler boyunca yavaşça ayarlayın.
3. Görüntüdeki bir yarayı manuel olarak tanımlayın. Büyük yaralar için 10x hedef kullanın. Daha küçük yaralar ve tek hücreli yaralar için 20x hedef kullanın.
4. Görüntüleri gerçek zamanlı olarak film olarak toplayan veya düzenli aralıklarla bir dizi görüntü toplayan bir program başlatın. Yara alanının görüş alanının dışına kaymadığından ve ilgilenilen hücrelerin odakta kaldığından emin olmak için ilerlemeyi izleyin.
   1. Tek hücreli yaralar bir dakika içinde kapanır; bu nedenle, kapanışlarını bir filmle hayal edin.
   2. Küçük yaralar için hücre dinamiklerinin ayrıntılarını yakalamak için, yaklaşık her 10 saniyede bir görüntü toplayın. Küçük yaraların kapanması büyüklüğüne bağlı olarak 20-50 dakika sürer.
   3. Mühürlenmemiş slaytları 45 dakikadan fazla görüntülemeyin, çünkü zamanla slayttan suyun buharlaşması hayvan ölümüne ve hücrelerin yırtılmasına neden olur.
   4. Daha uzun gözlem için, buharlaşmayı azaltmak için kapak kaymasının etrafını petrol jölesi ile kapatın.
      NOT: Bazı medusalar slaytta nabız atabilir ve bu da görüntülemeye müdahale eder. Bu durumda, ASW'de pH 7.5'e ayarlanmış% 1 Etil 3-aminobenzoat metansülfonatın (Trikain) 1:10 seyreltilmesinde hayvanların montajı etkili bir anestezi görevi görür ve 1 saatlik bir zaman diliminde iyileşme üzerinde belirgin bir etkisi yoktur. Bununla birlikte, Tricaine'de birkaç saat bırakılırsa hayvanlar ölecektir.

Şekil 3: Exumbrellar epitelinde küçük bir yara oluşturma. (A) Küçük bir epitel yarası oluşturmak için eksşemsiyenin 200 μL pipet ucu ile nazikçe çizilmesi. (B) Kapak kaymasının yerleştirilmesi bazen küçük epitel yaraları oluşturmak için yeterlidir. (C) Bir çöküntü kaydırağına monte edilmiş Medusa. (D ) DIC optikleri olmayan küçük epitelyal yara görüntüsü ve (E) DIC optikleri ile. Ölçek çubukları: 50 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Analiz

1. Görüntü dosyalarını hazırlama
   NOT: Görüntü dosyalarını işlemek için, güncellenmiş BioFormat eklentileriyle FIJI/ImageJ kullanın.
   1. Görüntü yığınını kaydetmeden önce ölçeği mikron başına doğru piksel oranına ayarlayın; Ölçeği analiz edin > ayarlayın. Bu, aşağı akış analizlerinde gerçek boyut ölçümlerini çıkarmak için gereklidir.
   2. Çoğu zaman, hayvan mikroskop slaydında hafifçe sürüklenir; bu nedenle, filmlerdeki kaymayı ortadan kaldırmak için, FIJI eklentisi doğrusal yığın hizalamasını SIFT ile kullanarak görüntüleri kaydedin. Eklentiler > SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalaması > Kayıt Sağlar.
   3. Kayıtlı yığını .avi dosyası olarak kaydedin. Dosya > AVI > Farklı Kaydet... Açılır pencerede, kare hızını ayarlayın (buradaki animasyonlu figürler 10 fps'ye ayarlanmıştır) ve Tamam'ı tıklatın. Yara iyileşmesi analizi yapmak için bu çıktıyı kullanın.
2. Yara alanının analizi
   1. FIJI / ImageJ'deki kement aracını kullanarak, hücre kenarlarını izleyerek yarayı ana hatlarıyla belirtin. Az önce Command+ M veya CTRL+M tuşlarıyla özetlenen yara alanını ölçün.
   2. Her 10 karede bir yara alanı ölçümünü tekrarlayın. FIJI/ImageJ'den alınan ölçümler daha sonra Prizma 9 kullanılarak çizilebilir (Şekil 4).

Şekil 4: Küçük epitel yaralarında yara alanının analizi. (A) 10 dakika boyunca küçük bir epitelyal yara iyileşmesi örneği. (B) 21 dakika boyunca farklı bir epitel yara iyileşmesi örneği. A,B'deki mor ana hatlar, FIJI / ImageJ'deki kement aleti kullanılarak yara alanlarının ölçümleriyle karşılaştırılabilir. (C) A'da zamanla yara bölgesinin normalleştirilmiş azalması. (D) B'de zamanla yara bölgesinin normalleştirilmiş azalması. (E) 14 küçük yara için zaman içinde yara alanının ortalama azalması. n = 14. Ortalama ± SEM etrafında ortalanmış hata çubukları. Ölçek çubukları: 50 μm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Mezogleal enjeksiyonlar

1. Enjeksiyon kabı oluşturma
   1. Bir PDMS bazını ve kürleme maddesini birleştirerek, ağırlıkça 10 parça baz ila 1 kısım kürleme maddesi oranında polidimetilsiloksan (PDMS) hazırlayın. Baz ve kürleme maddesini tamamen karıştırmak için kuvvetlice karıştırın.
   2. Kabarcıkları çıkarmak için, karışımı 15 dakika boyunca bir vakum odasına koyun. Kalıbı yerinde tutmak için karışımı mikrosantrifüj tüp kapakları olan 60 mm'lik bir Petri kabına dökün. Kalıbı hemen tüp kapaklarına 45 ° eğimli ve yerinde bant yerleştirin. Kalıp, son enjeksiyon kabında sırtlar oluşturmak için birbirine yapıştırılmış üç istiflenmiş, ofset cam slayttır.
   3. Elastomeri kürlemek için tüm tabağı, kalıbı ve karışımı 2 saat boyunca 60 ° C'de bir fırına koyun. Tamamlanmış bir enjeksiyon kabı için kalıbı çıkarın.
2. Mikropipet çekme
   1. Bir mikroelektrot çektirici kullanarak, bir çekme programı tasarlayın. Yüksek hızda tek adımlı bir program kullanın. Isı yaklaşık olarak cam RAMP test sonucu^55,56'dır. Elde edilen mikropipetlerde uzun süre tutarlı konikler olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: 1,0 mm dış çapa, 0,75 mm iç çapa ve 10 cm uzunluğa sahip ince duvar camı borosilikat kılcal damarları kullanın.
3. Boya ve ilaç enjeksiyonu
   1. Bir mikroenjeksiyon iğnesi yapın (yukarıdaki gibi).
   2. Medusa'ya enjeksiyon için aşırı miktarda boya veya ilaç içeren uzun bir pipet ucu kullanarak mikroenjeksiyon iğnesini doldurun.
      NOT: Clytia için, dimetil sülfoksit (DMSO), ASW ile <1:100 seyreltmede tutulmalıdır, çünkü daha yüksek DMSO konsantrasyonları yara iyileşmesini engeller. Net bir çözelti enjekte edilirse, enjekte edilen sıvıyı görselleştirmek için Hızlı Yeşil FCF çözeltisi (ASW'de% 0.1 Hızlı Yeşil FCF'nin 1:100 seyreltilmesi) eklenebilir.
   3. Yukarıdaki gibi modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak, alt şemsiyesi yukarı bakacak şekilde bir medusa'yı, hayvanı örtmeye yetecek kadar ASW'ye sahip bir PDMS enjeksiyon kabına yerleştirin (Şekil 5C). Çanağı diseksiyon kapsamının sahnesine yerleştirin.
      NOT: Aşırı ASW'yi sınırlamak, medusanın tabakta yüzmesini önler ve daha başarılı enjeksiyonlara izin verir.
   4. Mikroenjeksiyon iğne ucuna odaklanın ve medusanın yakınındaki suya ilerletin. Mikromanipülatör ile, iğneyi bükülene ve kırılana kadar kabın içine bastırın. Bu uç açıklığı yaklaşık 10-20 μm'dir.
      NOT: Bu iğne o gün aynı boya/ilaç enjeksiyonları için tekrar tekrar kullanılabilir. Her gün taze bir uç ve ayrı boyalar / ilaçlar için kullanılması önerilir.
   5. Mikromanipülatörü kullanarak, iğnenin ucunu alt şemsiyeden ekzogleayı delmeden mezogleaya yerleştirin.
      NOT: Epitelin kırışması/katlanması fark edilir. İğne medusa'ya sokulduktan sonra, kırışma / katlanma durur.
   6. Mikroenjektörde, tutma basıncını sıfıra ve ejeksiyon basıncını ≤20 PSI olarak ayarlayın. Bir veya iki kadrana enjekte edin, her birini o kadranın alanının kabaca 1 / 4'ü kadar bir boya veya ilaçla doldurun.
      NOT: Medusa'nın boyutuna bağlı olarak, tek enjeksiyon noktalarında daha büyük veya daha küçük hacimler uygundur. Medusa'nın aşırı doldurulması, epitelin aşırı hasar görmesine ve hatta hayvanın ölümüne neden olur.
   7. Hangi boya veya ilacın enjekte edildiğine bağlı olarak, hayvanlar boya veya ilaç difüzyonu ve inkübasyonuna izin vermek için taze ASW kabına yerleştirilir.
   8. Görüntüleme için, modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak medusa'yı bir çöküntü slaydına monte edin ve hayvanı eksşemsiye yukarı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 5). Enjekte edilen bir reaktifin etkisini test etmek için hayvanlar bu aşamada yaralanabilir.

Şekil 5: ECM'ye boya veya ilaç eklemek için enjeksiyon kurulumu. (A) Enjeksiyon kurulumu. (B) Mikroenjeksiyon iğnesinin yönünü gösteren enjeksiyon düzeneğinin yakın çekimi (çanaktaki hayvana göre yaklaşık 45° açı). (C) Silikon enjeksiyon kabının enjeksiyon için az miktarda ASW içinde medusa ile yakın çekimi. (D) Medusa'nın mezoglesine alt şemsiyeden giren Hızlı Yeşil FCF yüklü bir mikroenjeksiyon iğnesi. (E) Monte edilmiş bir medusada Hızlı Yeşil FCF'nin enjeksiyonundan sonra. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolleri takiben, tek hücreli mikro yaralar, küçük yaralar ve büyük yaralar görüntülendi. Kayıtlı görüntü dosyası yığınları .avi dosyaları olarak kaydedildi.

Film 1'de, mikro yaraların hücreler arasında ve içinde kapandığı görülebilir (Şekil 1 ve Şekil 2). Kapanma sırasında küçük lamellipodia gözlenir, bunu kasılma ve iyileşme izler. Enkaz hariç tutulur ve suya salınır. İyileşme bir dakika veya daha kısa sürede tamamlanır.

Film 2 ve 3'te, farklı şekillerdeki küçük yaralar, daha önce tarif edildiği gibi, lamellipodia oluşumu, lamellipodial temasların uzaması ve yara marjındaki hücrelerin yayılması yoluyla iyileşir⁴⁰ (Şekil 1 ve Şekil 2). Marjinal hücrelerin arkasındaki katmanlardaki hücreler, bu büyüklükteki yaraların iyileşmesine katılmaz ve kolektif hücre göçü yoktur. Epitel boşluklarının hızlı ve ilerleyici olarak kapanmasını, yeni oluşan yara dikişi⁴⁰ boyunca doku kasılması izler. Orijinal alanın zaman içinde yüzdesi olarak ifade edilen bu iki yaranın normalleştirilmiş iyileşme hızı gösterilmiştir (Şekil 4C,D). Yara kapanma dinamiklerinde bir miktar değişkenlik olsa da, 0.02-0.125^mm2 arasında değişen çeşitli şekillerdeki 14 yara için zaman içinde yüzde alan kapanmasının ortalamasının alınması, tedavi edilmeyen hayvanlarda yara iyileşmesi için ortalama bir eğrinin oluşturulmasına olanak sağlamaktadır (Şekil 4E).

Bodrum zarındaki hasar, oluştuğunda açıkça görülebilir (Şekil 2). Film 4'te, bazal membran hasarının olduğu küçük bir yaranın kenarındaki hücreler hasarlı bölgenin etrafına yayılır ve boşluk kapanması bir kese ipi kasılması ile tamamlanır.

Doku susuz kalırsa veya onarılamayacak kadar hasar görürse, hücre hareketleri durabilir veya tüm hücre tabakası patlayabilir (Film 5 ve Film 6). Bu genellikle uzun görüntüleme sürelerinden sonra olur (45 dakika veya daha uzun). Görüntülemenin erken dönemlerinde hücre patlaması meydana gelirse, numune atılır.

Film 7'de gösterildiği gibi, büyük yaralar birkaç aşamada iyileşir. İlk olarak, yaranın kenarı, daha önce bildirildiği gibi, marjdaki kasılmalar nedeniyle pürüzsüz ve düzenli hale gelir⁵⁷. Daha sonra, lamellipodia'nın yara kenarındaki hücrelerden oluştuğu görülür, lamellipodia bitişik lamellipodia ile teması en üst düzeye çıkarmak için ilerler. Yara kenarındaki hücrelerdeki çekirdeklerin ve marjinal hücrelerin arkasındaki birkaç katmanın izlenmesi, büyük boşlukların kolektif hücre göçü ile kapandığını göstermektedir⁴⁰. Hücreler asla ayrılmaz ancak bir sayfa olarak birlikte hareket eder.

Boyaların ve farmakolojik ajanların tanıtılması, biyolojik mekanizmaların diseksiyonu için güçlü bir araç olabilir. Birçok madde, muhtemelen hayvanın yüzeyini kaplayan mukus tabakası nedeniyle Clytia'dan (gösterilmemiştir) hariç tutulmuştur. Bununla birlikte, mikroenjeksiyon, molekülleri doğrudan ECM'ye sokmak, ECM yapısını bozmak veya ECM'deki düzenleyici faaliyetleri bozmak için kullanılabilir. Ek olarak, boyalar ve diğer moleküller epitel hücrelerine bazal taraftan girebilirler. Örneğin, Şekil 6 , Hoechst ile nükleer boyama, FM1-43 ile membran boyama ve bu reaktifler ECM'ye mikroenjekte edildikten sonra sitokalasin B ile lamellipodia oluşumunun inhibisyonunu göstermektedir. Bu moleküllerin yaralanmadan önce ECM ve epitel hücrelerine sokulması, farmakolojik araçların iyileşme süreci üzerindeki etkisini test eden deneylere izin verir.

Şekil 6: Boyaların veya farmakolojik ajanların mikroenjeksiyonundan sonra medusanın epitel hücreleri. (A) 20 μM Hoechst (çekirdek) ve 50 μM FM1-43 (membranlar) ile enjeksiyondan 5 dakika sonra üst panelde gösterilen epitel hücreleri. (B,C) 1:1.000 DMSO kontrolü (B) veya 100 μM Cytochalasin B (C) ile enjeksiyondan sonra yara iyileşmesi. Yaralar enjeksiyondan 15 dakika sonra yapıldı. Görüntüler yaralanmadan 5 dakika sonra çekildi. Lamellipodia oluşumu sitokalasin B tarafından inhibe edilir. Yara bölgesindeki hücreler arasında sıklıkla görülen belirgin "liflerin" bazal zarı geren gerginliğin sonucu olduğuna inanılmaktadır – falloidin ile lekelenmezler (gösterilmemiştir). Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 1: Tek hücreli mikro yara iyileşmesinin hızlandırılmış filmi. Geçen süre: 20 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 2: Küçük bir epitelyal yara iyileşmesinin hızlandırılmış filmi. Geçen süre: 9 dk 54 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 3: Küçük bir epitelyal yara iyileşmesinin hızlandırılmış filmi. Bu yara, Film 2'deki yaradan daha büyük ve düzensiz şekillidir. Geçen süre: 20 dk 54 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 4: Küçük bir yaranın hızlandırılmış filmi ve bazal membran yırtığı ile mikro yara iyileşmesi. Lamellipodia, bazal membran yırtığının etrafına yayılmıştır, ancak ECM'nin geri kalanı üzerinde ilerleyebilirler. Yaranın bazal membran hasarı olan bölgesi çevrelendiğinde, bir kese ipi kasılması hücreleri bölgenin üzerine çeker. Geçen süre: 19 dk 4 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 5: Küçük bir epitel yarasında ölen hücreler. Hücre ölümü muhtemelen hayvanın dehidrasyonundan kaynaklanmaktadır. Geçen süre: 4 dk 24 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 6: Küçük bir epitel yarası iyileşmeyi tamamlayamaz. Geçen süre: 42 dk 32 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Film 7: Büyük epitelyal yara iyileşmesi. Geçen süre: 25 dk 29 sn. Kare hızı: 10 fps. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Clytia tankı boyut şemaları. Özel yapım Clytia tanklarının 3D görselleştirilmesi. (A) Ön ve arka görünüm. (B) Yandan görünüm. Yeşil renkle gösterilen parçadaki kesik naylon ağ ile kaplanmıştır. Su, tanka doğrudan ağın üzerinden girer, ağın üzerinden süpürür ve dairesel bir akım oluşturur. Su, mavi renkle gösterilen son parçadaki delikten sistemden çıkar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film 1: Clytia'da asellüler hücre dışı matris. Konfokal mikroskopi kullanılarak alınan Clytia'nın Z-yığını. Yığın başlangıçta exumbrella'ya odaklanır ve daha sonra ECM'den her 10 μm'de bir plaka endodermine ve alt şemsiyeye tarar. DIC (solda) ve Hoechst nükleer boyama (sağda) kullanan görüntüler, ECM'deki hücrelerin eksikliğini göstermektedir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, nispeten yeni bir omurgasız model organizma olan Clytia'da in vivo yaraların görüntülenmesi için metodoloji^{sunulmaktadır 40,43,58}. Bu sistemi, yara iyileşmesi ve yeniden epitelizasyonu incelemek için kullanılan diğer modellerden farklı, benzersiz ve güçlü bir araştırma aracı yapan çeşitli faktörler vardır. İlk olarak, tek katmanlı epitel şeffaf bir ECM'ye bağlanır, bu nedenle in vitro doku kültürü tahlillerine benzer (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4). İn vitro testlerde olduğu gibi, hücreler yüksek çözünürlükte görüntülenebilir. Bununla birlikte, doku kültüründen farklı olarak, otantik bir hücresel ortam ve ECM vardır, böylece yara iyileşmesi, canlı yaralı bir hayvanda meydana gelen karmaşık sinyal olayları bağlamında görülebilir. İkincisi, Clytia enflamatuar yanıtlardan, göçmen fibroblastlardan, vaskülatürden ve kandan yoksundur. Bu, yara iyileşmesi sırasında daha karmaşık yetişkin hayvanlarda meydana gelen örtüşen olayların yokluğunda yeniden epitelizasyon sürecinin in vivo olarak incelenmesini sağlar⁵⁹. Üçüncüsü, ECM asellüler (Ek Film 1) ve büyüktür, mikroenjeksiyon iğnesi ile kolay erişim sağlar (Şekil 5 ve Şekil 6). Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar ECM yapısını veya sinyalini bozan farmakolojik reaktiflerin in vivo yara iyileşmesi üzerindeki etkisini test edebilirler. Reaktifler ayrıca epitel hücrelerine de sokulabilir ve in vivo yara iyileşmesi üzerindeki etkileri değerlendirilebilir. Dördüncüsü, Clytia sisteminde mutantlar ve transgenik hayvanlar yaratmak için var olan protokoller vardır^42,43,44,45. Bu nedenle in vivo yara iyileşmesi, ilgilenilen genlerin ekspresyonunun arttığı/azaldığı hayvanlarda gözlenebilir.

Bu teknikte birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, Şekil 3'te gösterildiği gibi, düz, şeffaf epitel hücreleri standart ışık mikroskobu ile neredeyse görünmez olduğundan, DIC mikroskobu için doğru şekilde yapılandırılmış bir mikroskop kullanmak gerekir. Hayvanları nazikçe yaralama becerisini geliştirmek de önemlidir, böylece epitel ECM'yi oyuklamadan zarar görür. Malzemelerin ECM'ye mikro enjekte edilmesi için benzer şekilde nazik bir dokunuş gereklidir, çünkü enjeksiyon sırasında hayvana verilen kapsamlı hasar, yara iyileşmesinin sonraki bir analizini tehlikeye atabilir. Bu tekniklerin bir öğrenme eğrisi olsa da, yeni başlayan öğrenciler bile Malamy laboratuvarında hızlı bir şekilde ustalaşmışlardır. Gerçekten de, bu protokoller Chicago Üniversitesi'ndeki lisans laboratuar derslerinde hücre göçünü göstermek için kullanılmıştır.

Optimum görüntüleme için, hayvanın hareket etmemesi ve seçilen yara alanının görüş alanının dışına kaymaması önemlidir. Hayvanlar nabız atıyorsa, tarif edildiği gibi Trikain ile tedavi çok etkilidir. Sürüklenme için, genellikle numuneyi manuel olarak yeniden konumlandırmak gerekir. Bu hareketler, FIJI/ImageJ'deki kayıt işlevi kullanılarak son filmden çıkarılabilir.

Bu sistemle ilgili bir sınırlama, burada açıklanan yöntemleri kullanarak yaralar hem şekil hem de boyut olarak değiştiğinden, aynı yaraları yaratmanın mümkün olmamasıdır. Bu nedenle, yara kapanmasının veya hücre göçünün kesin oranını ölçmek zor olabilir. Karbon taneleri gibi konumsal belirteçler, yaralı bir hayvanda maruz kalan ECM'ye yapışır ve büyük yaralarda kolektif hücre göçü oranını ölçmek için kullanılabilir (gösterilmemiştir). Küçük yara kapanma analizi için, değişken yara boyutu ve şekli olsa bile, bu boyuttaki yaralar arasında sınırlı bir kapanma oranı aralığı vardır (Şekil 4). Bu nedenle, promotive edici veya baskılayıcı farmakolojik reaktiflerin etkilerini nicel olarak tespit etmek mümkündür.

Bu çalışma sadece DIC mikroskobu kullanılarak yara iyileşmesinin karakterizasyonunu açıklarken, aynı yaklaşımlar floresan veya konfokal mikroskopi kullanılarak iyileşmeyi görüntülemek için kullanılabilir. Buna yardımcı olmak için, çeşitli hücresel ve hücre dışı proteinlerin floresan olarak etiketlendiği transgenik hayvanlar üretmek için protokoller mevcuttur. DIC ve floresan ile eşzamanlı görüntüleme, farmakolojik ajanlar veya mutant çizgiler kullanılarak yara iyileşmesinin bozulması ile birlikte, epiteldeki yara iyileşme sürecinin altında yatan mekanizmaları anlamak için güçlü bir yaklaşım olacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
20500 ACE EKE Mikroskop Fiber Optik Işık Kaynağı	Kramer Scientific Corporation
AxioCam 506 mono	ZEISS	426557-0000-000-MA285
Kılcal borular	Dünya Hassas Aletler	TW1004
Sitokalasin B	Abcam	ab143482
Depresyon slaytları	Amscope	BS-C12
DIC seçenekleri ve floresan halojen lambalı DMR	Leica
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat	Sigma Aldrich	E10521-10G
Hızlı Yeşil FCF	Thermo Scientific	A16520-06
FM1-43	Biotium	70022	Uyarma / Emisyon: 480/598 nm ve nbsp;
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249	Uyarma/Emisyon: 361/497 nm
imageJ	NIH
Mikro yükleyici uçları (0,5-10 μ L /2-20 μ L)	Eppendorf	930001007
Mikromanipülatör	World Precision Instruments	3301R / M3301L
Mikroskop Kapak Camı (22X40-1.5)	Fisherbrand	12-544-BP
Petri Kabı (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB085713A
PicoNozzle v2	World Precision Instruments	5430-ALL
Pipet çektirme	Sutter Instrument Co	P-97
Pnömatik PicoPump	World Hassas Aletler	PV820
Polikarbonat vakum, kurutucu	Bel-art	F42025-0000
Prizma 9	GraphPad
STEMI Sv11 Diseksiyon kapsamı	ZEISS	STEMI SV11
SYLGARD 184	Dow Silikonlar	1024001
Transfer pipetleri	Fisherbrand	13-711-7M
Z-Hab mini sistem	Pentair
ZEN Mikroskopi yazılımı	Zeiss