Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

Nörolojik bozukluklar dünya çapında engelliliğin önde gelen nedenidir¹. Altı kişiden biri etkilenir ve insidans artmaya devam eder. Toplumlar ve sağlık sistemleri üzerindeki ilgili mali yük çok büyüktür. 2010 yılında 30 Avrupa ülkesinin değerlendirilmesi, zihinsel ve nörolojik bozukluklarla ilgili tahmini yıllık 800 milyar € maliyettir². Artan sosyoekonomik yük, etkili tedavi stratejileri gerektirmekte ve hastalık patofizyolojisi konusundaki anlayışımız önemli ölçüde artmış olsa da, kliniklere çeviri çoğu zaman yetersiz kalmaktadır. Genel olarak, farmasötiklerin sadece% 12'si klinik çalışmalara girmektedir, bunların% 80'inden fazlası daha sonraki aşamalarda, esas olarak etkisizlik veya öngörülemeyen toksisite nedeniyle başarısız olmaktadır ^3,4. Sebepler çeşitlidir, ancak klinik öncesi aşamalardaki hayvan testlerinden insan deneylerine sınırlı aktarılabilirlik giderek daha fazla ön plana çıkmıştır⁵. İnsan in vitro hücre ve doku modelleri, türler arası translasyon boşluğunu kapatabilir ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisindeki ilerlemeler bu konuda büyük bir potansiyele sahiptir. hiPSC'ler temel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve embriyonik kök hücrelerle (hESC'ler) neredeyse sınırsız kendini yenileme kapasitesi ve embriyo yıkımı ile ilişkili etik kaygıları aşarken her üç germ^katmanına 6 farklılaşma yeteneği gibi temel özellikleri paylaşır.

Nöronal hücrelerin hESC'lerden ve daha sonra hiPSC'lerden türetilmesi, beyin araştırmalarında bir kilometre taşı oldu. İlk farklılaşma protokolleri, embriyogenez sırasında kritik adımları taklit eden büyüme faktörlerinin uygulanmasına dayanıyordu^ve bunların çoğu, süspansiyonda veya yapışkan kültürlerde ikili SMAD inhibisyonunu içeriyordu ^7,8,9. Olgun nöronlar başarıyla üretilmiştir, ancak bu protokollerin çeşitli dezavantajları, üretilen nöronların düşük verimi ve yüksek partiden partiye değişkenliğinin yanı sıra uzun kültür süreleriyle ilgili kapsamlı iş yükü gibi ilaç geliştirmede yaygın kullanımlarını hala engellemektedir. Nörogenezde kritik rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile iyileşmeler sağlanmıştır ve nörojenin (NGN) ailesinin üyeleri, özellikle NGN2, etkili sürücüler olarak tanımlanmıştır¹⁰. HiPSC'lerde NGN2'nin lentiviral aracılı ektopik ekspresyonu, nöronal farklılaşmanın erken aşamalarını önemli ölçüde hızlandırdı ve sadece 1 hafta içinde nöronal hücre kaderini indükledi¹¹. Astrositlerle birlikte kültürlerde daha sonraki terminal olgunlaşma, tekrarlanabilir özelliklere sahip yüksek saflıkta ve miktarda fonksiyonel nöronlar verdi. Daha sonra NGN2^12,13 için stabil ve doksisiklin ile indüklenebilir bir ekspresyon kaseti ile hiPSC hatları oluşturmak için adeno ilişkili virüs entegrasyon bölgesi 1 (AAVS1) güvenli liman lokusunun bölgeye yönelik gen düzenlemesi uygulandı ve böylece lentiviral iletimin istenmeyen yan etkileri en aza indirildi.

Doksisiklin ile indüklenebilir nörojenin 2 (iNGN2) nöronlarının sağlam ve etkili farklılaşması, yüksek verimli fenotipik ilaç taramaları ve toksisite testleri için büyük bir potansiyele sahiptir^10,14,15; ve son on yılda ölçeklenebilir bir hücre genişlemesi ve farklılaşması için biyoreaktörlerin uygulanmasında biyoişlemede önemli ilerlemeler kaydedilmiştir^16,17,18,19. Bununla birlikte, farklılaşma protokollerinin çoğunluğu bağlı kültürler için optimize edilmiştir ve üç boyutlu (3B) bir ortama çeviri genellikle temel değişiklikler gerektirir. Son zamanlarda, hiPSC'lerin genişlemesi ve hepatositlere, kardiyomiyositlere ve nöronlara tekrarlanabilir farklılaşma için azaltılmış kayma stresi özelliklerine sahip bir tezgah üstü 3D biyoreaktörün başarılı bir şekilde kullanıldığı bildirilmiştir²⁰. Burada, iNGN2 nöronlarının üretimi ve karakterizasyonu için aynı tezgah üstü 3D biyoreaktör kullanılarak ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

NOT: Tüm hücre manipülasyonları, ayrıca kültür yemekleri ve ortam preparatları steril koşullar altında yapılmalıdır. Laminer akış davlumbazı, kullanımdan önce ve işlendikten sonra tüm yüzeyler p etanol ile silinerek iyice temizlenmelidir. Açıklanan protokol, bir CERO 3D İnkübatörü ve Biyoreaktöründeki nöronal farklılaşmalar için optimize edilmiştir (aşağıda tezgah üstü biyoreaktör olarak anılacaktır). Bu tezgah üstü biyoreaktör, her biri maksimum 50 mL kapasiteye sahip özel biyoreaktör tüpleri için dört yuva sunar. Sıcaklık ve CO₂ seviyeleri sürekli olarak kontrol edilir ve her tüp için yetiştirme parametreleri (örneğin, dönme hızı ve zamanı) bağımsız olarak düzenlenir. Tüm aspirasyon adımları, aksi belirtilmemişse, bir aspirasyon pipeti ve vakum pompası kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. HiPSC'lerin kültürlenmesi ve genişletilmesi

NOT: Bu protokolde mühendislik ürünü doksisiklin ile indüklenebilir NGN2 hiPSC hattı BIONi010-C-13 kullanılmıştır. Burada sağlanan genişletme protokolü 6 cm'lik Petri kapları için optimize edilmiştir, ancak tercih edilirse alternatif kültür formatları kullanılabilir.

1. Soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM)/F12 (-/-) ile seyreltilmiş baz membran matrisli 6 cm'lik Petri kaplarını 0,083 mg/mL/10^cm2'lik bir nihai konsantrasyonda kaplayın. Kaplanmış bulaşıkları 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Bazal membran matris çözeltisinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol, üreticinin talimatlarında bulunabilir. hiPSC'ler genişleme için alternatif hücre dışı matrisler üzerinde kültürlenebilir.
2. EBiSC Hücre hattı Kullanıcı Protokolü^21'e göre kriyokorunmuş hiPSC'leri besleyicisiz iPSC bakım ortamında + 10 μM ROCK inhibitöründe (Y-27632) çözün. 60 mm'lik çanak başına 1 × 10⁶ canlı hücrenin tohumlama yoğunluğu önerilir.
3. Ertesi gün ortamı ROCK engelleyicisi olmayan besleyicisiz iPSC bakım ortamına değiştirin ve günlük ortam değişiklikleri gerçekleştirin.
4. HiPSC kültürleri% 60 -% 80'lik bir birleşime ulaştığında geçmeye başlayın. Farklılaştırılmış alanları kontrol edin ve alan% 5'i aşarsa kolonileri manuel olarak temizleyin.
   NOT: Farklılaşmamış hiPSC'ler, belirgin bir nükleolus ve daha az sitoplazmaya sahip yuvarlak hücreler olarak görünür. Düz ve sıkıca paketlenmiş koloniler, çözüldükten veya geçtikten sonra erken oluşur. HiPSC kültürlerinin örnek parlak alan görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. Daha fazla bilgi EBiSC Hücre hattı Kullanıcı Protokolü^21'de verilmiştir. Geçiş için, bodrum membran matris kaplı tabaklar ve besleyicisiz iPSC bakım ortamı hazırlayın.
5. Ortamı hiPSC kültürlerinden aspire edin ve hücreleri 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) Ca 2 + ve Mg 2⁺ olmadan² kat durulayın (DPS [-/-], bkz.
6. Süpernatantı çıkarın ve 6 cm'lik Petri kaplarına 1x DPBS'de (-/-) 2 mL 0,5 mM EDTA ekleyin. Hücreleri inkübatörde 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
7. EDTA çözeltisinin 1.5 mL'sini aspire edin ve 3-5 dakika boyunca inkübasyona devam edin.
8. Hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için bulaşıklara hafifçe dokunun.
   NOT: Ayırmayı görsel değerlendirme ile kontrol edin. hiPSC kolonileri 5 dakika sonra ayrılmaya başlamalıdır, ancak daha yüksek akışlı hiPSC kültürleri ile daha uzun bir inkübasyon süresi gerekebilir. Koloniler ayrılmazsa, kuluçka süresini 10 dakikaya kadar artırın, ancak bu zaman dilimini aşmayın.
9. 6 cm'lik Petri kaplarına 5 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı ekleyin ve 10 mL serolojik pipetle veya geniş delikli pipet uçları kullanarak kolonileri 2 kat hafifçe askıya alın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
   NOT: hiPSC'ler mekanik strese karşı oldukça hassastır; Bu nedenle, birden fazla yeniden askıya alma işleminden kaçınılmalıdır. Son hücre süspansiyonu küçük koloni parçalarından (50-200 μm) oluşmalıdır.
10. Süpernatantı kaplanmış kültür yemeklerinden aspire edin ve 6 cm'lik tabak başına 4 mL besleyicisiz iPSC bakım ortamı hazırlayın.
11. Küçük koloni parçalarını taze hazırlanmış kültür yemeklerine 1:10 ila 1:40 arasında bölünmüş oranlarda aktarın ve günlük medya değişiklikleriyle 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de yetiştirin.
    NOT: Küçük koloniler geçişten sonra 1 veya 2 saat içinde bağlanmalıdır.

Şekil 1: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kültürlerinin morfolojisi . (A,B) Homojen morfolojiye ve tanımlanmış kenarlara sahip sıkıştırılmış hiPSC kolonilerini gösteren farklı birleşimlere sahip kaliteli hiPSC kültürleri. (C) koloni kenarları etrafında ortaya çıkan farklılaşmış hücre kümeleri ile hiPSC kültürü (kesikli beyaz çizgi). Ölçek çubuğu = 200 μm. Kısaltma: hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Tezgah üstü biyoreaktör sisteminde hiPSC'lerin ön ekimi (gün-2)

İlk adımlarda, hiPSC'lerin yapışkan kültürleri ayrılır, tekilleştirilir ve süspansiyona aktarılır (Şekil 2). Agregalar 24 saat içinde oluşur ve sürekli olarak büyür. Transgen indüksiyonundan 2 gün sonra, erken nöronlar sonraki deneyler için kriyokorunabilir.

Süspansiyonun ilk günlerinde kalıcı proliferasyon, hücre sayısında bir artışa neden olur ve 2 günlük indüksiyondan sonra zirveye ulaşır (Şekil 3A, B). Çoğalma ile birlikte, agregalar büyümeye başlar. 0. güne kıyasla, çap 2. günde P'lik bir artış gösterir ve 5. günde neredeyse iki katına çıkar (Şekil 3D). Artan bir çap, agregaların içindeki besin arzını sınırlasa da, hücrelerin canlılığı farklılaşmanın 2. gününde veya 5. gününde etkilenmez (Şekil 3C). Bununla birlikte, süspansiyonda 4 günden fazla uzun süreli bir ekim, agregalar enzimatik tekilleşmeye karşı giderek daha dirençli hale geldiğinden, hücre verimini daha da artırmaz (Şekil 3B).

Kriyoprezervasyon üzerine, 2. gün hücreleri çözülür ve terminal olgunlaşması için poli-L-ornitin (PLO)-laminin kaplı tabaklara kaplanır. Genel olarak, hücreler çözüldükten sonra çok iyi bağlanır ve nöritleri erken uzatmaya başlar. Temporal gen ekspresyon profili ve nöronal belirteçler TUBB3 ve MAP2 için immünositokimyasal boyama, nöronal hücre kimliğini doğrulamaktadır (Şekil 4A, B). Yükselen TUBB3 ve MAP2 seviyelerine ek olarak, nöronal kültürler mikrotübül ile ilişkili protein tau transkriptlerinde (MAPT) zenginleştirilir, akson stabilizasyonunda yer alan nöronal bir proteini kodlar ve pluripotensi düzenleyici transkripsiyon faktörü POU5F1'in ekspresyonunda eşzamanlı bir düşüş gösterir. Ayrıca, çözülmeden sonraki ilk hafta içinde yoğun bir nöritik ağ oluşur (Şekil 4C). Bu morfolojik değişiklikler, transkripsiyonel profil ile birlikte, nöronal kültürlerin artan bir olgunlaşmasını göstermektedir.

Şekil 2: Bir tezgah üstü biyoreaktör kullanılarak hiPSC türevi iNGN2 nöronlarının üretimi. (A) Hücre kültürünün temel adımlarını vurgulayarak farklılaşma paradigmasına şematik genel bakış. (B-F) Parlak alan görüntüleri, (B) hiPSC'leri ve (C,D) tezgah üstü biyoreaktörde agrega oluşumunu görselleştirir. (E,F) iNGN2 nöronları nöritleri genişletir ve farklılaşma sırasında morfolojik değişikliklere uğrar. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kısaltmalar: BMM = bazal membran matrisi; iPSC-MM = iPSC bakım ortamı; FKÖ = poli-L-ornitin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Agrega oluşumu ve büyümesi sırasında hücre verimi ve canlılığı. (A) Parlak alan görüntüleri, tezgah üstü biyoreaktörde kültürden sonraki 2 gün içinde agrega oluşumunu ve zaman içinde agrega boyutundaki artışı göstermektedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Hücre veriminin nicelleştirilmesi ve (C) farklılaşma seyri boyunca canlılık. Çubuk grafikler, dört bağımsız deneyden elde edilen ortalama + SD'yi temsil eder. (D) Agregaların boyutunu gösteren çap, açık kaynaklı yazılım ImageJ (sürüm 1.53) kullanılarak yarı otomatik olarak belirlenmiştir. İlk olarak, parlak alan görüntüleri ikili görüntülere dönüştürüldü ve daha sonra aşağıdaki parametreleri uygulayarak parçacıkları analiz etme aracı kullanılarak daha fazla değerlendirildi: boyut > 2.500 μm2, dairesellik 0.45-1, kenarları hariç tutma ve delikler içerme. Yatay çizgiler, beş bağımsız farklılaşmanın ortalama ± SD'sini gösterir. Tek noktalar, zaman noktası başına en az 20 toplama ile bireysel farklılaşma deneylerinin ortalamasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: HiPSC türevi iNGN2 nöronlarının karakterizasyonu. Nöronal genler TUBB3, MAP2 ve MAPT için zamansal gen ekspresyon profilinin yanı sıra pluripotent kök hücre ile ilişkili gen POU5F1. Göreceli ekspresyon seviyeleri referans genler GAPDH, HPRT1 ve GUSB'ye normalleştirildi. Kalibratör olarak farklılaşmamış hiPSC'ler (gün-2) seçildi. Geometrik semboller, dört bağımsız farklılaşmanın ortalama ± SD'sini gösterir. (B) Çözüldükten sonra 7. günde (gün-2 + 7) iNGN2 nöronlarının temsili görüntüleri, beta-III-tübülin (TUBB3, macenta) ve mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2, camgöbeği) için boyanmıştır. Hücre çekirdekleri DAPI ile boyandı. Ölçek çubukları = 100 μm. (C) Çözüldükten sonra nöronal kültürlerin parlak alan görüntülerinde nöritik ağın değerlendirilmesi. Nöritlerin toplam uzunluğu, ImageJ (versiyon 1.53) kullanılarak 930.82 × 698.11μm2'lik bir alanda belirlendi. Parlaklık ve kontrast ayarlandıktan sonra, görüntüler 8 bit görüntülere dönüştürüldü ve renkler tersine çevrildi. Nöritler daha sonra iskeletleştirildi ve daha sonra sırasıyla ImageJ eklentileri 'Skeletonize' ve 'Analyze Skeleton' kullanılarak analiz edildi. Nöritlerin toplam uzunluğu, ortalama nörit uzunluğunu / hücresini vermek için ilgili bölgedeki soma sayısına bölündü. Çubuk grafikler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama + SD'yi temsil eder. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.