Yöntem makalesi

İnsan Hücre Hatlarında Nükleer lncRNA'ların Uzun Süreli Yıkılması İçin Bir Araç Olarak Antisens Oligonükleotidler

DOI:

10.3791/65124

⸱

1 Eylül 2023

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromozomal kararsızlık gibi zamana bağlı süreçlerde lncRNA'ların işlevini analiz etmek için, uzun süreli bir yıkım etkisi elde edilmelidir. Bu amaçla, burada sunulan, 21 gün boyunca hücre hatlarında etkili bir yıkım elde etmek için modifiye edilmiş antisens oligonükleotidleri kullanan bir protokoldür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), transkripsiyonel düzeyde gen ekspresyonunda anahtar düzenleyici roller oynar. Deneysel kanıtlar, lncRNA'nın önemli bir kısmının tercihen çekirdekte biriktiğini ortaya koymuştur. Nükleer lncRNA'ların işlevinin analizi için, bu transkriptlerin çekirdek içinde verimli bir şekilde parçalanmasını sağlamak önemlidir. Sitoplazmik susturma mekanizmasına bağlı bir teknoloji olan RNA interferansının kullanımının aksine, bir antisens oligonükleotid (ASO) teknolojisi, nükleer RNA bölünmesi için RNA-DNA duplekslerine RNase H'yi alarak RNA yıkımını sağlayabilir. Kromatin durumunda olası değişikliklerin meydana gelebileceği genom mühendisliği için CRISPR-Cas araçlarının kullanılmasından farklı olarak, ASO'lar genomu değiştirmeden nükleer transkriptlerin verimli bir şekilde parçalanmasına izin verir. Bununla birlikte, ASO aracılı yıkımın önündeki en büyük engellerden biri geçici etkisidir. lncRNA susturmanın uzun süreli etkilerinin incelenmesi için, uzun süre verimli bir şekilde knockdown'ın sürdürülmesi gereklidir. Bu çalışmada, 21 günden fazla bir süre boyunca nakavt etkisi elde etmek için bir protokol geliştirilmiştir. Amaç, lncRNA yıkımının, yalnızca zaman ve hücre yaşlanması yoluyla gözlemlenen bir durum olan kromozomal instabilite ile ilişkili olan bitişik kodlama geni RFC4 üzerindeki cis-düzenleyici etkilerini değerlendirmekti. İki farklı insan hücre hattı kullanıldı: PrEC, normal primer prostat epitel hücreleri ve kolorektal karsinomdan izole edilen bir epitel hücre hattı olan HCT116, test edilen hücre hatlarında başarılı bir yıkım elde etti.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan genomunun büyük çoğunluğu kopyalanır ve sayı olarak insan transkriptomundakiaçıklamalı kodlama genlerinin sayısını aşan lncRNA'lar da dahil olmak üzere çok çeşitli transkriptlere yol açar 1. LncRNA'lar, proteinleri 2,3 kodlamayan ve yakın zamanda hücre4'teki önemli düzenleyici işlevleri açısından incelenen 200 nükleotidden daha uzun transkriptlerdir. İşlevlerinin, lncRNA'ların önemli bir bölümünün biriktiği ve transkripsiyonel düzenlemeyeaktif olarak katıldığı çekirdek gibi hücre altı lokalizasyonlarına 5 ve diğerbiyolojik süreçlerin yanı sıra nükleer mimarininsürdürülmesine 7 7,9,10 bağlı olduğu gösterilmiştir.

Nükleer lncRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonu için, çekirdekte yıkımı (KD) indükleyebilen yöntemler kullanılmalıdır ve ASO'lar nükleer transkriptleri susturmak için güçlü bir araçtır. Genel olarak, ASO'lar, Watson-Crick baz eşleşmesi 11,12,13 ile tamamlayıcı RNA'ya bağlanan ve kimyasal yapılarına ve modifikasyonlarına 13,14 bağlı mekanizmalar yoluyla RNA'nın işlevini değiştirebilen ~20 baz çifti uzunluğundaki tek sarmallı DNA dizileridir. ASO kimya modifikasyonları 2 ana gruba ayrılabilir: omurga modifikasyonları ve 2' şeker halkası modifikasyonları15, her ikisi de nükleazlara karşı yüksek direnç sağlayarak stabiliteyi arttırmayı ve aynı zamanda amaçlanan biyolojik etkiyiarttırmayı amaçlamaktadır 13,16. Omurga modifikasyonları arasında, fosforamidat morfolino (PMO), tiyofosforamid ve morfolino bağları, sterik bloke edici ajanlar19 olarak hizmet ederek17,18 eklemeye müdahale gibi amaçlar için yaygın olarak kullanılır, ancak transkriptin bozulmasını indüklemek için değil. Diğer bir omurga modifikasyonu, ASO'larda en sık kullanılan modifikasyonlardan biri olan fosforotiyoat (PS) bağıdır. Daha önce bahsedilen modifikasyonların aksine, PS bağları RNase H alımına12,20 müdahale etmez, böylece RNA'nın yıkılmasına izin verir. Bununla birlikte, çok çeşitli 2' şeker halkası modifikasyonlarıda vardır 21; bununla birlikte, RNA yıkımı amacıyla, verimli susturma etkilerini indükleyen modifikasyonlar arasında kilitli nükleik asitler (LNA'lar)22, 23 ve 2'-O-metil modifikasyonu24 bulunur. LNA'ların diğer modifikasyonlara25 kıyasla nakavt için oldukça etkili olduğu kanıtlanmış olsa da, hepatotoksisite26 ve apoptoz indüksiyonu gibi istenmeyen etkilere neden olabilirler in vivo ve in vitro27.

RNA yıkımı amacıyla, daha önce bahsedilen uygun modifikasyonlara sahip ASO'lar, RNaz H1 ve H220,28'i işe alabilir ve bu enzimler, DNA-RNA hibritlerine alınır ve hedef RNA'yı parçalayarak ASO13'ü serbest bırakır. Bu bölünmenin RNA ürünleri daha sonra RNA gözetim mekanizması tarafından işlenir ve kromatin durumundaki modifikasyonların istenmeyen biyolojik etkileryaratabileceği CRISPR-Cas sistemleri gibi diğer tekniklerin aksine, ilgilenilen genomik bölgeyi değiştirmeden RNA bozunması29 ile sonuçlanır 30. ASO teknolojisinin avantajlarına rağmen, zaman içinde hücre bölünmesi veya ASO bozulmasından kaynaklanan geçici susturma etkileri, kromozomal instabilite (CIN) gibi zamana bağlı süreçleri incelerken üstesinden gelinmesi gereken bir engeldir31.

Özellikle, CIN, normal hücrelere kıyasla kromozom sayısı ve yapısındaki değişiklik oranınınartması olarak tanımlanır 32 ve mitoz sırasında kromozom ayrışmasındaki hatalardan kaynaklanır ve zamanla tümör içi heterojenlikten33 kaynaklanan genetik değişikliklere yol açar. Bu nedenle, CIN sadece bir anöploid karyotip bularak değerlendirilemez. Hücre kültüründe CIN'in uygun şekilde incelenmesi ve değerlendirilmesi için, hücrelerin zaman içinde izlenmesi önemlidir. Bir lncRNA KD'nin CIN üzerindeki etkilerinin incelenmesi için, uzun süreli bir KD etkisine izin veren bir metodolojiye ihtiyaç vardır. Bu amaçla, lncRNA-RFC4'ün insan hücre hatları HCT115 ve PrEC'de sırasıyla 18 ve 21 gün boyunca başarılı bir şekilde susturulduğu bu protokolde ASO'lar kullanıldı. Bu transkript, 1.2 kb uzunluğunda, karakterize edilmemiş bir lncRNA'dır ve genomik konumu kromozom 3 (q27.3) üzerindedir. Farklı insan kanseri türlerinde CIN ile ilişkili bir gen olan protein kodlayan gen RFC4'e bitişiktir 34,35,36.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolün sadece laboratuvar güvenlik prosedürleri konusunda deneyimli laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Tehlikeli madde ve ekipmanları kullanmaya başlamadan önce bu protokolde kullanılan tüm reaktiflerden ve malzemelerden alınan güvenlik bilgi formlarını uygun şekilde okumak önemlidir. Tüm protokol boyunca kurumunuzun laboratuvar güvenlik kılavuzunda belirtilen tüm güvenlik gerekliliklerini okumak, anlamak ve yerine getirmek esastır. Tüm biyolojik ve kimyasal atıkların bertarafı, kurumun atık yönetimi ve bertaraf kılavuzuna göre yapılmalıdır. Dikkatli ve güvenli laboratuvar uygulamalarına uygun olarak kullanılmazsa, bu protokolde kullanılan malzeme ve ekipman ciddi yaralanmalara neden olabilir. Her zaman kurumun güvenlik laboratuvarı kılavuzuna ve güvenlik prosedürlerine uyun.

1. ASO'ların Tasarımı

  1. ASO'ları aşağıda açıklandığı gibi manuel olarak tasarlayın.
    1. Hedef transkriptin tam dizisini elde edin ve minimum serbest enerji (MFE) ikincil yapısını elde etmek için web sitesindeki varsayılan parametreleri kullanarak RNAfold Web Sunucusu, Viyana Üniversitesi37'de (Malzeme Tablosu) analiz edin.
    2. Sonuçlar hazır olduğunda, MFE düz yapı çizimine gidin ve web sitesinde MFE ikincil yapısını açmak için Forna'da Görüntüle'ye tıklayın, yazılım analiz edilen transkriptin tahmin edilen ikincil yapısını gösterecektir.
    3. Tahmin edilen MFE ikincil yapısından, oligonükleotidleri tasarlarken G-stringlerinden (arka arkaya 3 guanin dizileri) kaçınarak RNA'da 20 bp uzunluğunda bir bölge seçin. ASO için en iyi hedef bölgenin seçimi için, dahili baz eşleşmesi olasılığının daha düşük olduğu tahmin edilen bölgeleri kullanın (Şekil 1).
    4. Seçilen 20 bp'lik bölgeden ters tamamlayıcı dizisini oluşturun. Ters tamamlayıcıyı manuel olarak oluşturun veya ters tamamlayıcı çevrimiçi aracını (Malzeme Tablosu) kullanın. Ters tamamlayıcı dizi, deney için sentezlenmesi gereken ASO olacaktır.
    5. Nucleotide Blast NCBI (blastn) ve UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38) kullanarak ASO dizisini analiz edin. ASO'ların insan genomundaki diğer transkriptlere veya diğer genomik bölgelere homoloji göstermediğinden emin olun.
      NOT: ASO sentezi ve saflaştırılması ticari bir şirket tarafından gerçekleştirilmiştir (Malzeme Tablosu).
  2. Sentezlenen oligonükleotidlerin aşağıdaki özelliklere sahip olduğundan emin olun.
    1. Oligonükleotid38'in tüm dizisi boyunca PS bağlarının olduğundan emin olun (Şekil 2A). ASO'ların kimerik olduğundan ve 5'-O-metil ile modifiye edilmiş şeker halkaları ile 5' ve 3' uçlarını çevreleyen 2 nükleotid ile emin olun (Şekil 2B).
    2. Ortadaki 10 nükleotidin, RNase H bağlanmasını desteklemek için değiştirilmemiş bir şeker halkasına sahip olduğundan emin olun (Şekil 2C).
    3. Şirketten standart tuzdan arındırma ve ters fazlı (RP) HPLC39 kullanarak arıtma yapmasını isteyin.
    4. ASO teslimatını liyofilize formatta sipariş edin.
  3. Liyofilize ASO'ları Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) kalsiyum ve magnezyum olmadan 200 μM'lik bir nihai konsantrasyona kadar çözün. -20 ° C'de saklayın.
  4. Konsantre stoğu 20 μM'lik bir konsantrasyona seyrelterek ASO'nun çalışma çözeltisini hazırlayın. DPBS kullanarak seyreltmeyi hazırlayın. -20 °C'de saklayın.
    NOT: Bu çalışma için lncRNA-RFC4'ü hedefleyen iki ASO tasarlanmıştır. Transfeksiyon ve verimlilik için ASO konsantrasyonunun optimizasyonu için, Zong ve ark.40 tarafından hazırlanan protokol takip edildi. Zong'un protokolüne göre iki ASO tasarlanmış ve deneysel olarak optimize edilmiştir: ASO-lncRFC4 ve ASO-lncRFC4-2. Optimizasyondan sonra, uzun süreli knockdown protokolü için lncRNA-RFC4'ü hedefleyen etkili bir ASO, ASO-lncRFC4 seçildi (Ek Şekil 1). Pozitif bir kontrol olarak, lncRNA MALAT18'i hedefleyen daha önce doğrulanmış verimli bir ASO kullanıldı: ASO-MALAT1. Negatif kontrol için, Escherichia coli lacZ geni, ASO-lacZ (NCBI erişim numarası: FN297865) hedefleyen bir ASO tasarlandı.

2. Hücrelerin hazırlanması

NOT: Hücre kültürü manipülasyonu sırasında kullanılacak hücre hatları, çözeltiler, malzeme veya herhangi bir ürün her ele alındığında hücre kültürü başlığının içinde çalışın. Hücre kültürü için sıvıları manipüle ederken, her zaman sterilize edilmiş serolojik pipetler veya sterilize edilmiş uçlara sahip mikropipetler kullanın. Tüm protokol boyunca kurumun laboratuvar güvenlik kılavuzunda belirtilen tüm güvenlik gerekliliklerini daima yerine getirin ve bunlara uyun.

  1. Aşağıda açıklandığı gibi her hücre hattı için tam hücre kültürü ortamını hazırlayın.
    1. HCT116 için, McCoy's 5A besiyerini %10 fetal sığır serumu (FBS) ile hazırlayın.
    2. PrEC için, prostat epitel hücresi büyüme kiti ile prostat epitel hücresi bazal ortamını hazırlayın.
  2. KD deneyleri için, kullanılacak her oligonükleotid için bir tane olmak üzere üç adet 100 mm kültür plakası (55 cm2 yüzey alanı) kullanın: lncRNA'yı hedefleyen ASO, pozitif kontrol olarak kullanılacak ASO (ASO-MALAT1) ve negatif kontrol olarak kullanılacak ASO (ASO-lacZ).
  3. Hücre geçişleri arasında KD için kontrol noktaları olarak kullanılacak iki adet 35 mm kültür plakası (yüzey alanında9 cm2 ) kullanın, bunlardan biri ASO-lncRFC4 ve diğeri ASO-lacZ için tam transfeksiyon ortamı ile transfekte edilecektir.
    NOT: Transfeksiyon, lipid bazlı transfeksiyon reaktifi (bkz. Malzeme Tablosu) üreticisinin daha önce bildirilen prosedürlerine ve protokollerine göre planlanmıştır41,42.
  4. Hücre kültürü kaplarında 1 x 104 hücre/cm2 yoğunluğa kadar tohum hücreleri. Hücreler %50 birleşmeye ulaşana kadar (yüzeyin %50'si hücre tek tabakası tarafından kaplandığında) havada% 5 CO2 kullanarak inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. % 50'lik bir birleşme ile hücreler bu protokol için transfekte edilmeye hazırdır.
    NOT: ASO-lncRFC4 ve ASO-lacZ'nin transfeksiyonu için bir adet 100 mm'lik çanak ve bir adet 35 mm'lik çanak tohumlanmıştır. ASO-MALAT1'in transfeksiyonu için sadece 100 mm'lik bir tabak tohumlandı (Şekil 3A).

3. Transfeksiyon

  1. Prosedür başlamadan önce serum ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
  2. ASO-lacZ ve ASO-lncRFC4 ile transfeksiyon için aşağıda açıklanan adımları izleyin.
    NOT: ASO-lacZ ve ASO-lncRFC4 ile transfeksiyon, 55cm2'lik bir yüzey alanındaki hücreler için planlanmıştır; Farklı alanlar kullanıldığında, hacimler buna göre ayarlanabilir. Bu prosedür, aynı koşullar altında kullanılan her ASO için yapılmalıdır.
    1. 15 mL'lik konik santrifüj tüpünde 1.4 mL ılık indirgenmiş serum ortamında 43.75 μL ASO'yu (20 μM) çözerek hücre kültürü başlığının içinde tüp 1'i hazırlayın.
    2. 18.66 μL lipid bazlı transfeksiyon reaktifini 1.5 mL RNaz içermeyen bir mikrofüj tüpünde 1.4 mL ılık indirgenmiş serum ortamı ile karıştırarak hücre kültürü davlumbazının içinde tüp 2'yi hazırlayın.
    3. Tüp 1 ve 2'yi hücre kültürü davlumbazının içinde oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    4. Tüp 2'de bulunan çözeltiyi (transfeksiyon reaktifi + azaltılmış serum) doğrudan tüp 1'e (ASO + azaltılmış serum) reaktiflerin tüpün yüzeyine yayılmasını önlemek için yavaşça, damla damla ekleyin.
    5. Tüp 1'de bulunan karışımı oda sıcaklığında kültür davlumbazının içinde 20 dakika inkübe edin.
    6. Tüp 1'e 8.75 mL'lik bir son hacme kadar ılık indirgenmiş serum ortamı ekleyin.
      NOT: Son transfeksiyon ortamı, 100 nM'lik bir konsantrasyonda ASO içeriyordu.
    7. Kültür ortamını, transfekte edilecek hücreleri içeren hücre kültürü kabından çıkarın ve transfeksiyon ortamının 7.5 mL'sini 100 mm'lik kültür plakasına ve 1 mL'sini 35 mm'lik kültür plakasına doğrudan hücre tek tabakasına damla damla ekleyin. Çanağı hafifçe sallayarak ortamın tüm yüzey boyunca eşit olarak dağıldığından emin olun.
    8. 37 ° C'de bir inkübatörde 6 saat havada% 5 CO2 ile inkübe edin.
    9. Transfeksiyon ortamında 6 saatlik inkübasyondan sonra, 100 mm kültür plakasındaki hücrelere 7.5 mL tam ortam ve 35 mm kültür plakasındaki hücrelere 1 mL tam ortam ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  3. ASO-MALAT1 ile transfeksiyon için, aşağıda açıklandığı gibi deneyleri gerçekleştirin.
    NOT: ASO-MALAT1 ile transfeksiyon, 55cm2'lik bir yüzey alanındaki hücreler için planlanmıştır.
    1. 37.5 μL ASO'yu (20 μM) 1.2 mL ılık indirgenmiş serum ortamında 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde çözerek hücre kültürü başlığının içindeki tüp 1'i hazırlayın.
    2. 16 μL lipid bazlı transfeksiyon reaktifini 1.2 mL ılık indirgenmiş serum ortamı ile karıştırarak tüp 2'yi hazırlayın.
    3. Tüp 1 ve 2'yi hücre kültürü davlumbazının içinde 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. Tüp 2'de bulunan çözeltiyi (lipid bazlı transfeksiyon reaktifi + azaltılmış serum) doğrudan tüp 1'e (ASO + azaltılmış serum) yavaşça, reaktiflerin tüpün yüzeyine yayılmasını önlemek için damla damla ekleyin.
    5. Tüp 1'de bulunan karışımı oda sıcaklığında kültür davlumbazının içinde 20 dakika inkübe edin.
    6. Tüp 1'e 7.5 mL'lik bir son hacme ılık indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Son transfeksiyon ortamı, 100 nM'lik bir konsantrasyonda ASO içeriyordu.
    7. Kültür ortamını, transfekte edilecek hücreleri içeren hücre kültürü kabından çıkarın ve tabağın hafifçe çalkalanmasıyla ortamın tüm yüzey boyunca eşit olarak dağılmasını sağlamak için 7.5 mL transfeksiyon ortamını doğrudan hücre tek tabakasına damla damla ekleyin.
    8. 37 ° C'de 6 saat boyunca havada% 5 CO2 kullanarak bir inkübatörde inkübe edin.
    9. Transfeksiyon ortamı ile 6 saatlik inkübasyondan sonra, hücrelere 7.5 mL tam ortam ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde inkübe edin.
  4. Hücreler bir sonraki transfeksiyon turu için hazır olana kadar hücreleri her 12-24 saatte bir mikroskobik olarak değerlendirin.
    NOT: Daha sonra, hücreler% 70'lik bir birleşme elde ettiğinde transfeksiyon yapılmalıdır. Gerekirse, ortamı tam kültür ortamıyla değiştirerek değiştirin.
  5. Hücreler, hücre kültürü kabında %70 oranında birleştiğinde, prosedürü tekrarlayın (adım 3.1 ila 3.4) ve bir sonraki transfeksiyon turunu gerçekleştirin.
    NOT: İkinci transfeksiyondan sonra, hücreler her 12-24 saatte bir mikroskobik olarak değerlendirilmelidir. Hücre hasadı ve geçişi, hücreler %80-85'lik bir birleşme elde ettiğinde gerçekleştirilmelidir. Gerekirse, ortamı tam kültür ortamıyla değiştirerek değiştirin.

4. Hücre hasadı ve geçişi

NOT: Hücre hasadı ve geçişi, her 2 tur transfeksiyondan sonra ve 2., 4. ve 6. transfeksiyon turlarından sonra gerçekleştirilir. HCT116 hücrelerinde ortalama hasat süresi 1., 3. ve 5. transfeksiyonlardan 6 gün sonra ve PrEC hücreleri için ortalama süre 1., 3. ve 5. transfeksiyonlardan 7 gün sonraydı. Transfeksiyon için zaman noktası, bu protokolde kullanılan her iki hücre hattı için farklılık gösterir. HCT116 için, 2., 3., 4., 5. ve 6. transfeksiyonlar ilk transfeksiyondan sırasıyla 3, 6, 9, 12 ve 15 gün sonra gerçekleştirilir. PrEC için 2., 3., 4., 5. ve 6. transfeksiyonlar ilk transfeksiyondan sırasıyla 3, 7, 10, 14 ve 18 gün sonra gerçekleştirilir. Transfeksiyon, geçiş ve hasat için zaman noktalarını kontrol etmek için Şekil 3'teki zaman çizelgesine bakın.

  1. Aşağıda açıklandığı gibi 100 mm'lik kültür plakalarında KD deneyleri için hücre toplama ve pasaj gerçekleştirin.
    1. Hücreleri hasat etmeye ve hücreler% 80 -% 85'lik bir birleşme elde ettiğinde geçişe devam edin.
    2. Tüm ortamı ısıtın ve solüsyonları 37 °C'ye kadar yıkayın. Ayrışma reaktifini oda sıcaklığına ısıtın. Ayrışma reaktifi için nötralize edici çözeltiyi oda sıcaklığına ısıtın.
      NOT: Yıkama solüsyonları, ayrışma reaktifleri ve nötralize edici solüsyonlar, bu protokolde kullanılan iki hücre hattı için farklılık gösterir. HCT116 hücreleri PBS (fosfat tamponlu salin) ile yıkanır ve tripsin-EDTA çözeltisi ile ayrıştırılır. Ayrışma reaktifinin nötralizasyonu, HCT116 hücreleri için tam kültür ortamı ile gerçekleştirilir. PrEC için, yıkama çözeltisi olarak HEPES tamponlu tuzlu su çözeltisi kullanılır. Tripsin-EDTA, ayrışma reaktifi olarak kullanılır. Ayrışma reaktifinin nötralizasyonu için tripsin nötralize edici çözelti kullanın.
    3. Kültür davlumbazının içinde, kültür ortamını hücre kültürü kabından çıkarın ve 3 mL yıkama solüsyonu ile nazikçe yıkayın, ardından yıkama solüsyonunu atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
    4. Hücre tek tabakasına hücre hattına göre 2 mL ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin. Ayrışma tamamlanana kadar hücreleri her 2 dakikada bir değerlendirin.
    5. Hücre hattına göre 2 mL nötralize edici çözelti ekleyin ve hücre süspansiyonunun tüm hacmini hücre kültürü kabından 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.
    6. RNA ekstraksiyonu için, 500 μL hücre süspansiyonunu alın ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve RNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR için adım 5.1'e geçin.
    7. Hücre süspansiyonunun geri kalanını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    8. Hücre peletini 2 mL tam kültür ortamında yeniden süspanse edin ve standart prosedürlere göre hücre sayımına devam edin.
    9. Karyotipleme için, 35 mm çapında (9cm2 yüzey alanı) bir hücre kültürü kabında 1 x 104 hücre /cm2 yoğunluğa kadar tohum hücreleri, 24 saat boyunca havada% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin ve standart prosedürlere göre karyotiplemeye devam edin.
    10. Bir sonraki hücresel geçişte KD deneylerine devam etmek için, hücreleri 100 mm çapında yeni bir hücre kültürü kabında 1 x 104 hücre/cm2 yoğunluğa kadar tohumlayın. Bu yemek, deney için 2 numaralı pasaj olacaktır. Hücreler %50'lik bir birleşme elde edene kadar havada% 5 CO2 kullanarak inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: İstenirse, kalan hücreler standart prosedürlere göre protein ekstraksiyonu ve / veya dondurma için kullanılabilir.
    11. 3.1 ve 4.1.10 numaralı pasajlardan transfeksiyon ve hasat için 2 ila 3 arasındaki adımları tekrarlayın.
  2. 35 mm'lik kültür kaplarında KD deneylerinin kontrol noktaları için hücre hasadı için bir sonraki prosedürü izleyin.
    NOT: KD deneyinde ilk kontrol noktası için hasat, 2. ve 4. transfeksiyon prosedürlerinden 2 gün sonra gerçekleştirilir.
    1. Tüm ortamı ve yıkama solüsyonlarını 37 °C'ye ısıtın. Ayrışma reaktifini oda sıcaklığına ısıtın. Ayrışma reaktifi için nötralize edici çözeltiyi oda sıcaklığına ısıtın.
    2. Kültür başlığının içinde, kültür ortamını hücre kültürü kabından çıkarın ve 0,5 mL yıkama solüsyonu ile nazikçe yıkayın ve ardından yıkama solüsyonunu atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
    3. Yıkama solüsyonlarını attıktan sonra, hücre hattına göre 0.5 mL ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin. Ayrışma tamamlanana kadar hücreleri her 2 dakikada bir değerlendirin.
    4. Hücre hattına göre 0.5 mL nötralize edici çözelti ekleyin ve hücre süspansiyonunun tüm hacmini hücre kültürü kabından 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin.
    5. RNA ekstraksiyonu ve qPCR için adım 5.1'e geçin.

5. RNA ekstraksiyonu ve RT-PCR

  1. Hücre süspansiyonunu 200 x g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 600 μL soğuk PBS (4 °C) ile yıkayın.
  2. Hücre süspansiyonunu 200 x g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    Standart prosedürlere göre RNA ekstraksiyonu için hücre peletini kullanın.
  3. Saflaştırılmış RNA'nın laboratuvarda izlenen standart prosedüre göre DNaz işlemine devam edin. Duraklama noktasında, saflaştırılmış RNA'yı -80 °C'de uzun süre saklayın.
  4. Elde edilen her RNA örneği ile standart cDNA sentezi için RNA'yı kullanın. Duraklama noktasında, cDNA'yı -20 °C'de uzun süre saklayın.
  5. Aşağıda açıklanan adımlara göre standart qPCR gerçekleştirin.
    1. qPCR için, oligonükleotidler aşağıdaki transkriptleri amplifiye eder: ilgilenilen lncRNA, MALAT1 ve iç kontrol olarak yapısal olarak eksprese edilen bir gen (Tablo 1). Bu protokol için dahili kontrol olarak RPS28 ifadesi kullanılmıştır.
    2. ASO-LacZ örneğinden cDNA kullanarak dahili kontrolü, ilgilenilen lncRNA'yı ve MALAT1'i amplifiye etmek için qPCR reaksiyonları gerçekleştirin. Bu örnek, diğer örneklerden ifadeyi normalleştirmek için kullanılacaktır.
    3. ASO-lncRNA örneğinden cDNA kullanarak dahili kontrol RPS28'i ve ilgilenilen lncRNA'yı amplifiye etmek için qPCR reaksiyonları gerçekleştirin.
    4. ASO-MALAT1 örneğinden cDNA kullanarak dahili kontroller RPS28 ve MALAT1'i amplifiye etmek için qPCR reaksiyonları gerçekleştirin. Tablo 2'de açıklandığı gibi reaksiyon kurulumunu ve termodöngüleyici koşullarını takip edin.
    5. qPCR verilerini, ilgilenilen transkriptin ifadesinin iç kontrole karşı normalleştirilmesi ile analiz edin ve ardından, transkriptin nispi ekspresyon seviyesini elde etmek için ilgilenilen transkriptin (lncRNA veya MALAT1) ifadesini ASO-LacZ örneğindeki aynı transkriptin ifadesine karşı normalleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokolde, ASO'ların kullanımı, insan hücre hatları PrEC ve HCT116'da uzun bir süre için bir nükleer lncRNA'nın KD'sine uyarlanmıştır.

Kesinlikle, KD deneyi, Şekil 4'te gözlemlendiği gibi, deneyin 21 günü boyunca hücre hattı PrEC'de başarılı oldu. Bu ifadeyi doğrulamak için, hücre geçişi günlerindeki ifadeyi analiz etmenin yanı sıra (Şekil 4 A-C), 1. ve 2. pasajlar arasında ve 2. ve 3. pasajlar arasında kurula...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce de belirtildiği gibi, lncRNA'lar hücrede temel düzenleyici işlevlere sahiptir; Bu nedenle, bu transkriptlerin düzensizliği hastalıklarda rol oynayabilir. Kanser, lncRNA düzensizliği43,44 ile karakterize edilen böyle bir hastalıktır. Bu hastalıkta, lncRNA'ların onkogenler45 veya tümör baskılayıcılar46 olarak önemli düzenleyici roller oynadığı bilinmektedir. Bazıları kanseri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montiel-Manriquez, Rogelio, Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) 'dan doktora öğrencisidir ve CONACyT CVU numarası: 581151 ile CONACyT bursu almıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15ml Santrifüj Tüpleri - 15ml Konik TüplerThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC ile işlenmiş Kültür KabıCorning 430167Yüzey alanı: 55 cm2
Corning 35 mm TC ile işlenmiş Kültür KabıCorning 430165Yüzey alanı: 9 cm2
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokThermo Fisher Scientific14190144
Fetal Sığır Serumu (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 hücre hattıATCCCCL-247
HEPES, 1M Tampon ÇözeltiThermo Fisher Scientific15630122
Entegre DNA Teknolojileri NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofektamin RNAiMAX ReaktifiThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A ortamı ATCC30-2007
Normal İnsan Primer Prostat Epitel Hücreleri (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nükleotid Patlaması NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7.4Thermo Fisher Scientific
Prostat Epitel Hücreli Bazal OrtamATCCPCS-440-030
Prostat Epitel Hücre Büyüme KitiATCCPCS-440-040
Ters tamamlayıcı çevrimiçi araçNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNaz içermeyen Mikrofüj Tüpleri, 1.5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzim (1X), fenol kırmızısı içermezThermo Fisher Scientific12604013Tripsin-EDTA çözeltisi Tripsin
Nötralize Edici ÇözeltiATCCPCS-999-004
Birincil Hücreler için Tripsin-EDTAATCCPCS-999-003
UCSC Genom Tarayıcısı, İnsan (GRCh38 / hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832(2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119(2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501(2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377(2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672(2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693(2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019(2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , Humana Press. New York. (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56(2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608(2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9(2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nuclear lncRNA KnockdownLong Noncoding RNAsRNase H RecruitmentProlonged RNA KnockdownCis Regulatory EffectsChromosomal InstabilityPrEC CellsHCT116 Cells
Video yakında

İlgili makaleler